Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

Samenvatting

Een gewijzigde tweefasige collagenase perfusie procedure voor isolatie van humane hepatocyten is beschreven. Deze methode kan ook worden toegepast op andere zoogdieren levers. De geïsoleerde hepatocyten zijn beschikbaar in hoge opbrengst en haalbaarheid, waardoor ze een geschikt model voor wetenschappelijk onderzoek op gebieden zoals lever regeneratie, farmacokinetiek en toxicologie.

Samenvatting

De lever, een orgaan met een uitzonderlijk regeneratiecapaciteit, voert een groot aantal functies, zoals ontgifting, metabolisme en homeostase. Als zodanig, hepatocyten zijn een belangrijk model voor een grote verscheidenheid van vraagstellingen. Met name het gebruik van menselijke hepatocyten is bijzonder belangrijk op het gebied van farmacokinetica, toxicologie, leverregeneratie en translationeel onderzoek. Aldus stelt deze werkwijze een gemodificeerde versie van een tweefasige collagenase perfusie procedure hepatocyten te isoleren zoals beschreven door Seglen ^1.

Eerder hebben hepatocyten werden geïsoleerd door mechanische methoden. Echter enzymatische werkwijzen aangetoond superieur als hepatocyten behouden hun structurele integriteit en functie na isolatie. De hier gepresenteerde methode past de werkwijze eerder ontworpen rat lever menselijke lever stukken en resulteert in een grote opbrengst van hepatocyten met een levensvatbaarheid van 77 ± 10%. De belangrijksteverschil in deze procedure is het proces van cannulization van de bloedvaten. Verder kan de beschreven werkwijze ook toegepast worden levers van andere soorten met vergelijkbare lever of bloedvat maten.

Inleiding

Een lever celsuspensie kan worden bereid uit de lever door mechanische of enzymatische werkwijzen. Mechanische methoden gebruikt om hele levercellen bereiden omvatten waardoor de lever door kaasdoek ^2, schudden van een lever stuk met glazen kralen in een Kahn shaker ^3, het gebruik van glas homogeniseerders met losse stampers ^4,5 etc. In de loop der jaren zijn mechanische methoden van gevallen gunst vanwege de schade aan celmembranen en functieverlies van de geïsoleerde hepatocyten ^6,7. Bijgevolg is het gebruik van een enzymatische Tegenwoordig is de belangrijkste methode voor isolatie van de hepatocyten.

Isolatie van hepatocyten met behulp van een enzymatische methode is sterk verbeterd toen Berry en vriend ⁸ doorbloed collagenase en hyaluronidase door de lever via de poortader in ratten. Dit perfusieproces gebruikt de vasculatuur om de enzymen in nauw contact met de meerderheid van de cellen te komen, waardooreen 6-voudige toename in opbrengst van hepatocyten ^8. Verder is deze methode leverde cellen die hun structurele integriteit behouden, met vrijwel geen verandering van endoplasmatisch reticulum in geïsoleerde blaasjes en geen mitochondriale schade ^8.

Deze methode werd gewijzigd door Seglen ^1, die een twee-staps procedure perfusie pionier voor levercel isolement. In deze procedure wordt de rattenlever geperfuseerd met een ^{Ca2 +} vrije buffer gevolgd door perfusie met collagenase buffer die Ca ^{2 + 1.} De verwijdering van ^{Ca2 +} in de eerste stap helpt desmosomen verstoren, terwijl de toevoeging van ^{Ca2 +} in de tweede stap is vereist voor optimale collagenase activiteit ^1,9.

Aangezien het gepubliceerde werk hierboven beschreven uitgevoerd bij ratten dit artikel beoogt een gewijzigde procedure die kan worden gebruikt voor isolatie van hepatocyten met hoge levensvatbaarheid van brom toneneen levers. Het gebruik van menselijke hepatocyten blijft belangrijk voor translationeel onderzoek en voor het valideren van experimenten met diermodellen. De menselijke lever stukken die in deze studie werden met toestemming van het bestuur overgenomen door de Human Tissue en Cell Research Foundation, een door de staat gecontroleerde non-profit stichting ^10. Na een patholoog verwijderd wat nodig is voor diagnose, werden lever stukken vanuit het restmateriaal. Het weefsel afgezet door de patholoog was morfologisch gezond weefsel verkregen van resectie marges na leverresectie.

Protocol

1. Bereiding van perfusie en isolatie oplossingen

1. Bereid de voor de perfusie van de lever stuk en isolatie van hepatocyten volgens tabel 1 oplossingen. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik.
2. Steriele filter alle oplossingen met behulp van een 0,22 pm filter.
3. Alle oplossingen die in contact komen met de lever moet steriel zijn.

2. Voorbereiding van de perfusie apparatuur en oplossingen

1. Apparatuur voor de perfusie van de lever stuk moeten worden opgezet, zoals weergegeven in figuur 1.
2. Het waterbad moet worden vastgesteld op een geschikte temperatuur, die verschillend is in elk afzonderlijk experimentele set-up, zodat de oplossingen bij de temperatuur van 37 ° C, als ze de lever stuk te bereiken. In dit geval wordt het waterbad van 41 ° C voor verwarming van de oplossingen 1, 2 en 3 en het dubbelwandige glazen condensor. Oplossing 4 moet worden opgewarmd tot37 ° C in een afzonderlijke waterbad voor het verlies van collagenase activiteit te verminderen.
3. Kort voor leverperfusie, zet de regulator van de gas tank met 95% O _2/5% CO ₂ aan de zuurstofvoorziening apparaat (figuur 1E) gas.

3. Perfusie van de lever

1. Een lever stuk met zoveel intacte Glisson capsule mogelijk en bij voorkeur met slechts 1 snijvlak moet worden verkregen van een patholoog voor perfusie.
2. Plaats deze lever stuk op de Büchner trechter die een geperforeerde filter disc (Figuur 1B) bevat.
3. De perfusie systeem moet worden gegrond met Oplossing 1.
4. Met een lage stroomsnelheid, moet gebogen irrigatie canules met olijf-tips in de grotere bloedvaten worden ingebracht op het snijvlak van de lever stuk. Zoals bloed spoelt uit de lever, het weefsel wordt lichter in gebieden met een goede doorbloeding. Het aantal canules voor verschillende matenlevers wordt getoond in figuur 2A. De meterformaat gekozen zou moeten resulteren in een goede pasvorm die de canules zijn plaats houdt. De kleinere bloedvaten open moet staan ​​voor de perfusie buffer eruit lopen van de lever stuk worden gelaten.
5. Verhoog de ​​stroomsnelheid van de peristaltische pomp tussen 110-460 ml / min afhankelijk van de grootte van de lever (Figuur 2B). Dit resulteert in een gemiddelde stroomsnelheid van 44 ± 16 ml / min per canule (figuur 2C). De gekozen snelheid is afhankelijk van de lever stuk en moet resulteren in een lichte plumping up van de lever stuk. In sommige gevallen kan het nodig zijn om klemmen sluiten enkele open vaten met microvasculaire klemmen de lichte plumping bovengenoemde bereiken. Een goede perfusie kan worden waargenomen wanneer de lever stuk is een lichtere kleur overal.
6. Houd de lever stuk vochtig tijdens perfusie door te bedekken met een gaasje gedrenkt in een zoutoplossing.
7. Perfuse met 1 L van Oplossing 1 te spoelen elke remaining bloed in de lever stuk.
8. Wijzig de perfusievloeistof naar oplossing 2 en perfuseren gedurende 10 minuten.
9. Schakel de perfusie vloeistof Oplossing 3 en perfuseren met 0,5 L.
10. Wijzig de perfusievloeistof Oplossing 4, die 0,1-0,15% collagenase (tabel 2) bevat.
11. Voor deze stap perfusie worden uitgevoerd in een recirculerende wijze uitgevoerd gedurende 9-12 min of totdat de lever voldoende verteerd, het leverweefsel zou lijken enigszins uit elkaar breken onder de Glisson capsule en voelen zacht wanneer onderzocht met de botte kant van een scalpel.

4. Isolatie van Hepatocyten

1. Schakel de peristaltische pomp en verwijder cannulae uit de lever stuk.
2. Leg de lever stuk in een kristallisatieoplosmiddel schotel met 100-200 ml Oplossing 5.
3. Verwijder de Glisson capsule zorgvuldig en schud uit de cellen. Als er gebieden die niet goed doorbloed, kan een scalpel gebruikt doorsnijdendeze regio cellen bevat binnen vrijkomen. Voeg meer Oplossing 5 indien nodig tijdens het proces.
4. Voeg meer 5 oplossing tot een eindvolume van 500 ml wordt bereikt.
5. Filter celsuspensie tweemaal, eerst door een 210 um nylon mesh, gevolgd door een 70 um nylon mesh. Vervolgens giet de celsuspensie in 200 ml centrifuge buizen.
6. Centrifugeer de celsuspensie bij 72 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig supernatant en voorzichtig resuspendeer celpellet voorzichtig in 200 ml oplossing 5.
7. Herhaal de wasstap nummer 4.6 drie keer. Op de laatste centrifuge stap, resuspendeer cellen in koude opslag-oplossing (zie de lijst van materialen). De cellen moet ongeveer 2,5 miljoen hepatocyten per milliliter voor de beoordeling van opbrengst en levensvatbaarheid behulp van een hemocytometer gebaseerde trypan blauw exclusietest.
8. Voor het uitvoeren van een trypan blauw exclusietest, voeg 0,1 ml geschikt verdunde cellen (≈ 2,5 miljoen / ml) een microcentrifugebuis die 0,5 ml trypan blauw solution (0,4% trypan blauw opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) en 0,4 ml PBS. Na het mengen van de celsuspensie grondig, laadt een hemocytometer met de schorsing en onderzoeken onder een microscoop op 100X vergroting. Onder microscopie, zal de dode cellen blauw worden gekleurd, terwijl de levende cellen verschijnen ongekleurd. Tel het aantal levende en de totale cellen in elk van de 1 mm ² roosters die op de hemocytometer. Levensvatbaarheid (%) opbrengst van levende cellen (hepatocyten miljoen per ml koeloplossing (CSS) of hepatocyten miljoen per g lever) kan worden berekend met de volgende formules.

Opmerking: In dit geval, de trypan blauw verdunningsfactor 10 en de hemocytometer factor 10.000.

Resultaten

Perfusie Setup

De voor leverperfusie apparatuur moet worden ingesteld volgens figuur 1.

Levensvatbaarheid en de opbrengst van geïsoleerde humane hepatocyten

De gemiddelde levensvatbaarheid van geïsoleerde menselijke hepatocyten was 77 ± 10% en de gemiddelde opbrengst van hepatocyten was 13 ± 11 miljoen hepatocyten / g lever, met uitgedrukt als gemiddelden ± standaardafwijking. Het aantal hepatocyt isolaties uitgevoerd om te...

Discussie

Dit protocol resulteert in de isolatie van humane hepatocyten met een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid. Om dit te bereiken, is het belangrijk om te beginnen met een geschikt stuk lever. Het stuk van de lever moeten intact Glisson capsule op alle oppervlakken met uitzondering van 1 snijvlak hebben. Een andere belangrijke factor is de bepaalde partij collagenase worden gebruikt als verschillende partijen kan leiden tot grote verschillen in de levensvatbaarheid van hepatocyten na digestie ^11. Daarom moeten v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bubble trap	Gaßner Glastechnik
Glass jacketed condenser	Gaßner Glastechnik
41 °C Water bath	Julabo	35723-H24/EG
37 °C Water bath	GFL	1083
Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Gas permeable tubing	Neolab	2-4440
Peristaltic pump	Ismatec	IP65
Scalpel	Feather	320010
Forceps	Omnilab	5171014
Conical flasks 1 L	Schott Duran	2121654
Conical flasks 5 L	Schott Duran	2121673
Beakers	Schott Duran	2110654
200 ml centrifuge tubes	Becton Dickinson	352075
Crystallizing dish	Omnilab	5144063
Curved irrigation cannulae with ball tips	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Micro vascular clamps	Ernst Kratz GmbH
Büchner funnel	Carl Roth	HT38.1
Nylon mesh 210 µm	Neolab	4-1413
Nylon mesh 70 µm	Neolab	4-1419
0.22 µm sterile filters	Peske	99505
500 ml bottles	Schott Duran	2180144
1 L bottles	Schott Duran	2180154
Hemocytometer	Peske	06-0001
1.5 ml tubes	Eppendorf	0030 120,086
50 ml conical tubes	BD Biosciences	352070
Ice bucket	Neolab	1508454
Sterile Pasteur pipettes	Brand	747715
Motorised pipette filler (Pipette boy acu)	Integra	155017
Refridgerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Laminar flow	Kendro	Hera safe-KS9
Aspirator (Low-flow surgical suction pump)	Atmos	C361
Laboratory Gas Burner	Integra	Fire Boy eco
Disposable laboratory coat	Paperlynen GmbH	MD0202414
Surgical mask with visor	Kimberly-Clark	48247
Surgical hood	Barrier	42072
Latex gloves	Semper Care	CE0321
Collagenase (Batch number NB 4G)	Serva	17465
Calcium chloride dihydrate	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Sodium chloride	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Potassium chloride	Serva	26868
Albumin	Biomol	01400-2
Glucose	Serva	22700
Sodium hydrogen carbonate	Serva	30180
0.4% Trypan blue solution	Lonza	17-942E
Cold storage solution	Hepacult GmbH