Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Samenvatting

Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.

Samenvatting

Microglia vormen de resident macrofaag-achtige cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en, als zodanig, zijn kritisch belangrijke rol in fysiologische en pathologische processen zoals CNS rijping in ontwikkeling, multiple sclerose en ruggenmergletsel. Microglia kan worden geactiveerd en aangeworven om actie van neuronale verwonding of stimulatie, zoals axonale schade gezien in MS of ischemische hersentrauma als gevolg van een beroerte. Deze immunocompetente leden van het CZS zijn ook gedacht aan rollen in synaptische plasticiteit onder niet-pathologische omstandigheden. We gebruiken protocollen voor het kweken microglia van de neonatale en volwassen weefsels die bedoeld zijn om het aantal levensvatbare cellen te maximaliseren terwijl het minimaliseren verstorende variabelen, zoals de aanwezigheid van andere CNS celtypes en celkweek vuil. We maken gebruik van grote en duidelijk herkenbaar CNS componenten (bijv. cortex, ruggenmergsegmenten), die het gehele proces haalbaar en reproduceerbaar maakt. Het gebruik van volwassen cels is een geschikt alternatief voor het gebruik van neonatale hersenen microglia, zoals veel ziekten bestudeerde vooral invloed de postnatale ruggenmerg. Deze kweeksystemen zijn ook bruikbaar voor het effect van verbindingen die ofwel kunnen remmen of bevorderen microgliale activering direct testen. Aangezien microgliale activering de resultaten van ziekte kan vormen in het volwassen CZS, is er een behoefte in vitro systemen waarin neonatale en volwassen microglia kunnen worden gekweekt en onderzocht.

Inleiding

Microglia vormen de bewoner immune cellen van het CNS, de meeste overeenkomst vertonen perifere macrofagen in structuur en functie ^1. Het is onlangs aangetoond dat postnatale microgliale cellen afkomstig uit primitieve myeloïde progenitoren en worden gegenereerd voordat de achtste embryogenese, upending de vorige idee dat postnatale hematopoietische voorlopers zijn de bron van microglia in de volwassen hersenen ^2. Zij spelen belangrijke rollen in verscheidene neurologische ziekten en kunnen snel inspelen op infectie of letsel door het vrijgeven van pro-inflammatoire of anti-inflammatoire cytokines ^3. Aldus omvatten microglia een zelfstandige eenheid in het CZS kan worden gemanipuleerd ziekteprogressie beïnvloeden. Ontwikkelen van robuuste, reproduceerbare methoden het isoleren en kweken neonatale of volwassen microgliale cellen belangrijk voor toekomstige studies.

Microglia is bekend kritisch spelers in een aantal hersenen pathologieën. Recenter roles zijn in opkomst voor de cellen in de normale ontwikkeling van de hersenen en de functie als microglia fagocyteren overtollige neurale stamcellen uit de dentate gyrus van de hippocampus ^{1, 4.} Microglia kan ook moduleren verschillende neurologische aandoeningen die het ruggenmerg beïnvloeden, zoals MS, neuropathische pijn, en dwarslaesie ^5-7. Ruggenmerg microglia reageren verschillend tegenover hersenen microglia in response op activering signalen ^{8, 9,} waarschijnlijk als gevolg van verschillen in de lokale omgeving. Dus is het belangrijk een geschikte stand in vitro systeem voor cultuur en studie ruggenmerg microglia. Neonatale microglia tot significant meer van de pro-inflammatoire cytokine stikstofoxide dan bij volwassen cellen na in vitro stimulatie met IFN-γ en TNF-a ^10,11 verder benadrukt dat volwassen cellen gebruiken om microglia bestuderen in de context van bepaalde ziekten.

Het protocol we gebruiken in het lab te culture neonatale microglia is een variant van recente methoden die gebruik schudden van gemengde gliale culturen in een poging om de microglia van het oppervlak van de celkweek kolf ¹² verwijderen. Ook beschrijven we een methode om cultuur microglia van de volwassen muis ruggenmerg gebaseerd op een protocol eerst beschreven door Yip, et al. ^13. Deze methode levert een snellere manier om de cultuur volwassen cellen in vergelijking met andere beschikbare protocollen ^14. De resulterende voorbereiding is 70% microglia, de overige percentage bestaat uit astrocyten. Hoewel de zuiverheid van onze cultuur is lager in vergelijking met andere gepubliceerde methoden ^13, dit kweeksysteem is nuttig voor het verkennen van microglia in kweek reactie op diverse activerende stimuli en voor de studie van ziekten die vooral invloed het ruggenmerg en die een sterke ontstekingsreactie is een van de hoofdkenmerken.

Al de beschreven protocollen zijn goedgekeurd door de Stony Brook University IACUC.

Protocol

1. Dissectie (Dag 0)

1. Induceren anesthesie aan p0-2 muis pups met onderkoeling. Veeg de hoofden van de pups met een Kimwipe gedrenkt in 70% ethanol om het weefsel te desinfecteren.
2. Verwijder de koppen met een schaar, met 4 pups per 10 cm petrischaal. Plaats de hoofden in een petrischaaltje met buffer ijskoude Hank's.
3. Veranker de koppen met gebogen pincet door de oogkassen en verwijder voorzichtig de huid die de schedel met rechte microforceps.
4. Verwijder de schedelbeenderen met rechte microforceps, met behulp van voorzichtigheid om niet doorboren of beschadiging van de cortex. De meest effectieve manier is om de verwijdering te beginnen bij het cerebellum, dat zich aan de voet van de kop, omdat dit gebied worden genegeerd beginnen.
5. Verwijder de hersenen met een kleine spatel, en plaats de (4) hersens in een frisse petrischaaltje met buffer ijskoude Hank's.
6. Alle stappen vanaf dit moment benutten microforceps en worden uitgevoerd onder een dissectie microscoop. Beginnend op de ventrale kant van de hersenen, het weefsel verankeren van die van het cerebellum en maak twee kleine insnijdingen aan weerszijden van de middenhersenen. Wees voorzichtig niet om helemaal te snijden door het weefsel, zoals de cortex hebben betrekking op de middenhersenen in deze regio.
7. Zachtjes plagen de middenhersenen en de kleine hersenen in een stuk van de twee cortex. De twee cortex zou een concave vorm.
8. Scheid de twee cortex en oriënteren een enkele cortex met de mediale zijde voor verdere dissectie. De hippocampus is moeilijk waar te nemen, maar het ligt tegenover de bulbus olfactorius die verschijnt als een klein knobbeltje op het puntige uiteinde van de cortex.
9. Verwijder de hippocampus, die een halve maan-vorm heeft. Flip de cortex naar de dorsale zijde bekijken.
10. Gebruik van de bulbus olfactorius als uitgangspunt, verwijder alle meninges en de bulbus olfactorius zich van de cortex.
11. De ontleed cortex moet in 15 ml conische buizen geplaatst worden met 14 ml van colDe d Hank gebufferde zoutoplossing op ijs.

2. Cel Cultuur (Dag 0)

1. Grondlaag 10 cm weefselkweek schalen met 5 ug / ml Poly-D-Lysine (PDL) verdund in geautoclaveerd water gedurende 3 uur bij 37 ° C.
2. Aspireren PDL, en wassen platen eenmaal met geautoclaveerd water. Droge plaat onder de UV in de weefselkweek kap voor 20 minuten. Deze stap moet alleen worden verricht voorafgaand aan de dissectie proces.
3. Aspireren Hank's buffer van buisjes die de cortex van 4 hersens elk, gelden 4 ml 1x trypsine / EDTA-oplossing, vermaal weefsel met p1000 tip, en plaats buizen in 37 ° C incubator gedurende 15 minuten.
4. Voeg 4 ml van complete microglia media per buis aan de enzymatische spijsvertering, mix, stop en spin down inhoud op 1.5K rpm gedurende 5 minuten.
5. Aspireren supernatant en herhaal wassen met 4 ml van complete media. Resuspendeer cellen in 10 ml compleet microgliale medium (DMEM met 10% FBS, 1% natrium pyruvaat, 0.08% gentamycine) en filtreer door een 40 micron mesh cel zeef.
6. Plaat bij een dichtheid van 8 cortex per 10 ml in een 10 cm weefselkweek plaat en in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO ₂ (zie Adult Microglia protocol).

(Dag 3)

1. Verander media in alle celkweek gerechten met volledige microglia media.

(Dag 10)

1. Voeg 400 microliter 60 mM lidocaïne in HBSS (tot microglia los) in medium 10-cm weefselkweek platen en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10-15 minuten.
2. Verzamel de media / celsuspensie van de plaat, en een keer was de plaat met buffer Hank's. Verzamel de wasbuffer om de resterende microglia herstellen.
3. Voeg 5 mM EDTA (pH 8,0) aan de celsuspensie tot een eindconcentratie van 50 uM of een 1/100 verdunning.
4. Spin down celsuspensie bij 1000 xg (1500 rpm) gedurende 5 min en resuspendeer in 1 ml DMEM met 1% FBS.
5. Tel het aantal levensvatbare cellen (zoals per volwassene Microglia 3.1/3.2) en splitsen cellen in weefselkweek platen bij de gewenste experimentele dichtheid. Ongeveer 1x10 ⁶ microglia worden geoogst van een 10 cm plaat met de cortex van 4 hersenen. Voor immunofluorescentie, is een dichtheid van 2.5x10 ⁴ cellen per 18 mm dekglaasje aanbevolen.
6. Laat minstens 24 uur voor microgliacellen vooraf volledig terugkeren naar hun vertakte, rusttoestand te gebruiken.

Protocol Tekst: (Adult Microglia)

1. Tissue Collection

1. Coat weefselkweekplaten met Poly-D-Lysine (PDL) gedurende 3 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C. Was de plaatjes een keer met geautoclaveerd water onmiddellijk vóór gebruik.
2. Euthanaseren muis door CO ₂ stikken en gaan na of euthanasie is voltooid. Reinig ruggenmerg met 70% ethanol.
3. Met behulp van een schaar snijden de huid op de top van het ruggenmerg, dan overgaan tot het ruggenmerg geknipt uit regio T1 tot T12. Snijdende resterende spier uit van de zijden van het ruggenmerg.
4. Langzaam snijd de wervels met microscissors als je houd het ruggenmerg zachtjes met je vingertoppen. Wees voorzichtig niet te doorboren het ruggenmerg als het weefsel is erg zacht. Extract langzaam het ruggenmerg met behulp microforceps.
5. Dompel het ruggenmerg in een petrischaaltje met ijskoude HBSS. Met behulp van een lichtmicroscoop verwijder alle zichtbare hersenvliezen behulp microforceps
6. Snijd het ruggenmerg in transversale segmenten klein genoeg om meerdere fragmenten te genereren. De dikte van de fragmenten niet meer dan 2 mm zijn om efficiënte spijsvertering. Breng het ruggenmerg stukken aan een 15 ml conische buis met 1 ml ijskoude HBSS. Houd de buis op ijs tot de spijsvertering stap.

2. Vertering van Tissue

1. Aspireren HBSS van 15 ml conische buis met ruggenmergweefsel. Wees voorzichtig om geen stukje weefsel te zuigen.
2. Voeg 1 ml van trypsine (2.5 g / L bestraalde varkens trypsine en 0,2 g / L EDTA in HBSS) en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
3. Om te stoppen met de spijsvertering verwijder de trypsine en voeg 3 ml van de primaire microglia medium dat serum om de enzymatische afbraak te stoppen bevat.
4. Pipet op en neer om het weefsel te verwijderen. Filter de celsuspensie met behulp van een 40 um cel zeef.

3. Cel Tellen en Plating

1. Meng gelijke hoeveelheid celsuspensie en DAPI oplossing.
2. Telling cellen met een hemocytometer.
3. Plaat bij een dichtheid tussen 5-7x10 ⁵ cellen / ml in PDL-gecoate 35 x 10 mm schalen. Plating een lagere dichtheid voorkomen celgroei zelfs wanneer cellen werden gekweekt in platen met 12 putjes die een kleiner gebied moeten tegen 35 x 10 mm schalen.

Resultaten

Een voorbeeld van rustende en geactiveerde microgliale cellen wordt getoond in figuur 1. De microglia werden gevisualiseerd 24 uur na plating (figuur 1a) en vertonen wijdvertakt (rust) morfologie. Blootstelling aan de priming reagens bacterieel lipopolysaccharide (LPS) resulteert in veranderingen in de morfologie microglia cellen geactiveerd worden (Figuur 1b).

Een voorbeeld van het tellen van de cellen voor plating is weergegeven in <...

Discussie

Microglia moduleren CNS normale werking en ontstekingsreacties verschillende pathologieën. Functionele synaptische remodeling door microglia is betrokken bij het ​​handhaven van normale hersenen homeostase ^15. Tijdens de neurogene cascade zij deelnemen aan de klaring van neurale stamcellen uit de dentate gyrus van de hippocampus ^{4, 16.} Daarom is het noodzakelijk om een ​​kweeksysteem waarin neonatale en volwassen microglia, waarvan de grote strook van en volwassen, gedurende welke microglia meerder...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blauw	Sigma	T8154
Trypsine/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Natrium Pyruvaat	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfaat	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm weefselkweekschaal	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Verdun 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV