Scheiding van spermatogene Cell typen met behulp van STA-PUT Velocity Sedimentatie

Samenvatting

De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van verschillende populaties van spermatogenese cellen op basis van grootte en dichtheid.

Samenvatting

Zoogdieren spermatogenese is een complex differentiatie proces dat plaatsvindt in verschillende stadia in de testes van de testes. Momenteel is er geen betrouwbare celkweeksysteem waardoor spermatogene differentiatie in vitro, en de meeste biologische studies van spermatogene cellen vereisen weefsel oogst uit dierlijke modellen zoals de muis en rat. Omdat de testis bevat een groot aantal celtypen - zowel niet-spermatogene (Leydig, Sertoli, myeloïde en epitheelcellen) en spermatogene (spermatogonia, spermatocyten, ronde spermatiden, condenseren spermatiden en spermatozoa) - studies van de biologische mechanismen die betrokken zijn bij de spermatogenese vereisen de isolatie en verrijking van deze verschillende celtypes. De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van een heterogene populatie van cellen - in dit geval, de testes - via een lineaire gradiënt BSA. Individuele celtypen sediment met verschillende sedimentatiesnelheid volgens cell grootte en fracties verrijkt verschillende celtypen kunnen worden verzameld en gebruikt in verdere analyses. Terwijl de STA-PUT methode niet leidt tot zeer zuivere fracties celtypes, bijvoorbeeld verkregen kunnen worden met bepaalde celsorteringsmethoden, verstrekt het een veel hogere opbrengst van de totale cellen in elke fractie
(~ 1 x 10 ⁸ cellen / spermatogenese celtype uit een uitgangspopulatie van 7-8 x 10 ⁸ cellen). Deze high yield methode vereist alleen gespecialiseerd glaswerk en kan worden uitgevoerd in een koude kamer of grote koelkast, waardoor het een ideale methode voor laboratoria die beperkte toegang tot gespecialiseerde apparatuur zoals een fluorescentie geactiveerde cel sorteerder (FACS) of afslibinrichting hebben.

Inleiding

Zoogdieren spermatogenese is een complex proces dat differentiatie in verschillende stadia van de testes van de testes ^1. In het kort, stam-achtige spermatogonia dat wonen in de buurt van het epitheel van de seminiferous verdeel en differentiëren in spermatocyten, die vervolgens ondergaan meiotische delingen. Nadat meiose is voltooid, de resulterende haploïde cellen of ronde spermatiden ondergaan spermiogenese een differentiatieproces dat het afstoten van cytoplasma en verdichting van de kern omvat. Spermatiden geleidelijk een flagellum en ondergaan rek en condensatie van de kern, het produceren verlengen en vervolgens condenseren spermatiden, respectievelijk. De eindproducten spermatozoa, die vrijkomen in het lumen van de seminiferous en uiteindelijk in de bijbal, waar ze verder rijpen.

Omdat het proces van spermatogenese steunt op speciale hormonale en moleculaire omstandigheden inde testes, een betrouwbare in vitro kweeksysteem voor het gehele proces van spermatogenese nog niet ontwikkeld ^2,3. Cultuur methoden ontwikkeld voor het creëren "primordiale kiemcel-achtige cellen" en haploïde, "rond spermatide-achtige cellen" van stamcellen, maar deze methoden zijn nog niet in staat om grote aantallen van deze cellen te genereren en niet later spermatogenese cellen produceren types ^4,5. Gelukkig is de spermatogenese celtypen sterk verschillen in omvang, waardoor voor een enkele-celsuspensie verkregen uit geheel testes met een gradiënt vloeistof te scheiden. De STA-PUT methode, hier aangetoond, maakt gebruik van een lineaire gradiënt BSA en eenvoudig sedimentatie te spermatogene cellen te scheiden op basis van grootte en massa ^6-9.

De STA-PUT methode heeft een aantal voordelen ten opzichte van de andere twee meest gebruikte methoden om spermatogene celtypes scheiden: FACS en elutriatie ^10-13. De STA-PUT apparaat vereist only verschillende stukken van gespecialiseerde glaswerk geassembleerd in een koude kamer of grote koelkast. Zo is goedkoper dan het gebruik van een cel sorteerder of een afslibinrichting. De STA-PUT methode levert grotere hoeveelheden cellen per celtype en testis dan kan worden gesorteerd door FACS op een vergelijkbare tijdsspanne, hoewel de zuiverheid van elke celpopulatie is niet zo hoog als die verkregen met FACS ^11. Celsortering gebruik magnetische korrels (magnetisch geactiveerde celsortering, MACS) is recent ook succesvol toegepast voor verrijking spermatogonia uit een gemengde testicular celpopulatie, maar het is nog niet geschikt voor het scheiden spermatocyten of spermatiden door gebrek aan kennis van geschikte oppervlakte-markers ^14. Een bijkomend voordeel van de STA-PUT methode via FACS of MACS is de mogelijkheid om levende cellen voor verdere kweek isoleren omdat in tegenstelling tot de meeste FACS protocollen, het geen DNA of andere vormen van vlekken vereisen. Voor studies die ik nodigarge opbrengsten van spermatogene cellen vormen op ~ 90% zuiverheid, de STA-PUT is een ideale methode.

Protocol

De STA-PUT protocol bestaat uit drie fasen: 2) Voorbereiding van de celsuspensie uit volle testes, en 3) Mobiele laden, sedimentatie, en fractieverzameling 1) Opzetten van de apparatuur en reagentia,. Wanneer deze wordt uitgevoerd door een team van twee onderzoekers, het protocol duurt gemiddeld acht uur.

1. Het opzetten van de STA-PUT Apparatuur (figuur 1)

*** STA-PUT apparaat worden geplaatst in een 4 ° C grote koelkast of een koude kamer die ook plaats biedt aan een fractie collector, indien deze wijze van inzameling heeft de voorkeur.

1. De nacht voordat (of op zijn minst een paar uur voor) u de werkwijze uit te voeren, was alle apparatuur (met name het glaswerk en leidingen) en steriliseren met 70% ethanol. Laten drogen materiaal volledig voor de montage van de inrichting zoals weergegeven in figuur 1.
2. Bevestig de twee 2 L flessen (figuren 1B en C) en de cellen laadkamer ( Figuur 1A) aan het bovenste platform en sluit alle met twee kleine stukjes buis met slangklemmen. Klem alle buizen gesloten. Sluit de tuit aan de meest rechtse 2 L cilinder.
3. Plaats een kleine roerstaaf in de cel laadruimte (figuur 1A) en een grotere roerstaaf in de meest linkse 2 L cilinder (figuur 1B) dat 2% BSA bevat.
4. Plaats de 2 L bezinkkamer op het platform (figuur 1D). Plaats de metalen baffle (Figuur 1F) direct op de opening in de bodem van de bezinkkamer (figuur 1D). Dit is essentieel, omdat de geleideplaat voorkomt vortexen van de vloeistof en verstoring van de cel verloop tijdens fractieverzameling. Plaats het deksel op de top van de bezinkkamer.
5. Na het aanbrengen van een zeer kleine hoeveelheid vacuüm vet aan de geslepen glas van de driewegkraan (figuur 1G), klemmen de kraan aan de bodem van de SEdimentation kamer, het aansluiten van de geslepen glas gewrichten van de kraan en de sedimentatie kamer.
6. Verbind de mobiele laadkamer (figuur 1A) rechts uitlaat van de kraan met slang. Sluit de kraan.
7. Bevestig de cel fractionering slang aan op de linker uitgang van de kraan. De fractionering buis bestaat uit een stuk slang met een glas Pasteur pipet verbonden met het open einde. Een stuk met een kleinere diameter wordt aan het smalle uiteinde van de glazen pipet bevestigd. De smalle pipet beperkt de stroom van de celsuspensie gedurende fractie verzamelen. Klem deze kleine buis op de bodem.
8. Bereid 2 L Krebs (1x) buffer op de dag van het experiment (tabel 1). Vervolgens bereiden 550 ml 2% BSA in 1x Krebs, 550 ml 4% BSA in 1 x Krebs en 50 ml 0,5% BSA in 1x Krebs. Filter en deze oplossingen afkoelen tot 4 ° C.
9. Giet de 4% BSA oplossing in de juiste 2 L cilinder (figuur 1C) en 2% BSAoplossing in de linker cilinder 2 L (Figuur 1B). Zorg ervoor dat er geen grote luchtbellen in de slang dat deze cilinders met elkaar verbindt.
10. Giet Krebs buffer in de cel laadkamer en vul de slang deze kamer verbinden met de sedimentatie kamer, zorg ervoor dat er geen grote bellen, want deze kunnen het verloop verstoren. Knijpen of veegt de slang voorzichtig helpt om de bellen te verwijderen. Controleer alle Krebs buffer in de buis en niet in de celkamer.
11. Laat een kleine hoeveelheid Krebs buffer te stromen in de bezinkkamer uitlekken bijna alle buffer in de cel fractionering buis om de buis te vullen en verwijder grote luchtbellen.
12. Plaats de fractie collector direct onder de bezinkkamer. Zorg ervoor dat alle de fractie buizen op hun plaats zitten en bedekt met plastic folie om besmetting te voorkomen.

2. Isoleren spermatogene Cellen van Whole Testikels

1. Ontleden testes van ca. 12 volwassen muizen (bij voorkeur minimaal acht weken oud) en plaats in Krebs buffer bij kamertemperatuur te wassen elke vervuilende materiaal. Dit protocol wordt aangetoond impliceert het gebruik van laboratorium muizen en werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite.
2. Voeg 45 mg collagenase tot 50 ml Krebs buffer in een conische buis vlak voordat je van plan bent de testes te voegen. Laat deze oplossing opwarmen tot 33 ° C gedurende enkele minuten. Evenredig verdeeld in twee 50 ml conische buizen.
3. Decapsulate de testikels in een aparte plaat met 8 ml Krebsbuffer, gooi de tunicaalbuginea en het vrijgeven van de testes. De tunicaalbuginea is het dunne membraan dat de testes omringt. De buisjes moet gemakkelijk los te maken van de tunicaalbuginea. Om dit te doen, maken een incisie in de tunicaalbuginea, houdt dit membraan met een pair van een tang, en duw de buisjes uit en weg van het membraan met een ander paar pincetten.
4. Voeg 4 ml Krebs buffer die de tubuli elke conische buis met 25 ml collagenase-oplossing en incubeer schudden, bij 33 ° C gedurende 10 minuten. Aan het einde moet de buisjes een "spaghetti-achtige" uitstraling hebben.
5. Laat de buisjes te regelen voor ~ 5 min naar de bodem van de buis. Giet het supernatant en was 2x in 25 ml Krebs-buffer (bij kamertemperatuur), waardoor de buisjes telkens naar de bodem van de buis. Verlaat ~ 5 ml Krebs buffer in elke buis.
6. Tijdens het wassen, voeg 30 mg trypsine tot 50 ml Krebs buffer in een valk buis vlak voordat je van plan bent de testes te voegen. Laat deze oplossing opwarmen tot 33 ° C gedurende enkele minuten. Evenredig verdeeld in twee 50 ml conische buizen.
7. Voeg 25 ml trypsine-oplossing aan elk van de twee buizen die de tubuli. Voeg 3 pg DNAse (1 μg/10ml) aan elke buis naar cel te voorkomens klonteren. Incubeer, schudden, bij 33 ° C gedurende 10 minuten.
8. Gebruik een wijde boring pipet om de oplossing die de buisjes ageren, pipetteren ze in en uit ongeveer 10x. De oplossing moet beginnen te kijken meer als een enkele cel suspensie.
9. Incubeer, schudden, bij 33 ° C gedurende nog 10 minuten. Gebruik een wijde boring pipet om de buisjes verspreiden in een enkele cel suspensie, pipetteren ze in en uit ongeveer 25x. Als u nog steeds zien veel buisjes of celklonten, verspreiden meer met de pipet en / of voeg een ander 3 pg DNAse aan elke buis (dubbele aanvankelijke concentratie).
10. Filter de enkele celsuspensie door een 100 um mesh zeef cel (een voor elke buis van 30 ml celsuspensie). Combineer de celsuspensies en tel het aantal cellen (moet tussen 7-8 x 10 ⁸ cellen). *** NIET LADEN MEER DAN 800000000 cellen op het verloop.
11. Op basis van het aantal cellen verkregen in stap 2.10, pellet de approprIATE volume van gefilterde cellen bij 450 RCF gedurende 5 minuten en wassen met 30 ml Krebs buffer. Herhalen. *** Meestal 22 testes zal opleveren meer dan 800.000.000 cellen, maar niet meer dan dit aantal cellen te laden.
12. Resuspendeer cellen voorzichtig in 25 ml 0,5% BSA bevattende tussen 2,5 en 5 ug DNase (afhankelijk van de mate van cel klonteren) zonder dat luchtbellen. Zorg ervoor dat de cellen niet klonteren. Filter de enkele cel suspensie door een 100 um mesh zeef cel. De cellen zijn nu klaar om te laden. Meng goed voor het laden door het buisje een paar keer.

3. Cel laden en Sedimentatie

1. Zorg ervoor dat de kraan gesloten is, maar in de positie die het mogelijk vloeistof te stromen uit de cel kamer (Figuur 1A) in de bezinkkamer (figuur 1D).
2. Draai beide roerstaaf platen op een lage stand (ongeveer 70 min) zodat het roer bars continu bewegen, maar langzaam.
3. Giet de celsuspensie in de celkamer (figuur 1A) en open de kraan zodat de cellen stroomt langzaam in de bezinkkamer met een snelheid van 10 ml / min (figuur 1D). Sluit de kraan. Stroomsnelheid kan worden bepaald vol intervallen op de bezinkkamer markering.
4. Giet 5 ml 0,5% BSA oplossing in de celkamer en afwateren in de bezinkkamer met een snelheid van 10 ml / min. Sluit de kraan. Deze stap zal de cellen te wassen uit de cel kamer. 4x herhalen.
5. Bereid de gradiënt: Open de klemmen tussen de celkamer (figuur 1A) en de twee 2 L flessen (fig. 1B en C), en beginnen de vloeibare afvoer in de bezinkkamer met een snelheid van 40 ml / min (figuur 1D) onmiddellijk. Stel het debiet dus het duurt ongeveer 20-30 minuten naar het BSA gradiënt te laden in de bezinkkamer. Een dunne, ongestoorde laag cellen die bovenop deBSA gradiënt moet zichtbaar zijn. Zodra de meeste van de BSA is geladen, sluit de kraan en draai naar de positie die het mogelijk vloeistof uit de bezinkkamer in de fractionering buis.
6. Schakel het roer platen.
7. Laat de cellen sedimenteren gedurende een uur en 45 minuten. STOOR NIET HET APPARAAT in deze tijd. Elke mechanische agitatie kon het verloop verstoren.

4. Fractionering en Analyse van de Fracties

*** Als je de volgende stappen uitvoeren, wees voorzichtig de helling niet te verstoren. Als de BSA gradiënt wordt verstoord, zal de procedure niet werken!

1. Zodra de cellen gesedimenteerd, langzaam drain 50 ml van de sedimentatie kamer in een 50 ml conische buis en zet apart. Deze fractie bevat meestal ongewenste groepjes van cellen en puin.
2. Bevestig de fractie buis om de fractie collector. *** Het is ook mogelijk om de fracties te verzamelen door de hand als een fractie collector is niet beschikbaar.
3. Verzamel fracties: Stel het debiet met de kraan zodat 10 ml (vullen een collectie buis) wordt verzameld om de 45 sec.
4. Cap de fractie verzamelbuizen en spin gedurende 5 min bij 450 RCF bij 4 ° C. Giet supernatant voorzichtig resuspendeer cellen in de resterende vloeistof, en houdt cellen op ijs.
5. Als alle fracties worden verzameld, microscopisch analyseren de fracties van verschillende celpopulaties. Verschillende celtypen kunnen worden onderscheiden op basis van celgrootte en nucleaire morfologie ^8,15. Figuur 2 illustreert "representatieve resultaten" voor de drie samengevoegde fracties die zijn verrijkt voor (a) somatische en cellen in de meiose en spermatogonia, (b) ronde spermatiden, en (c) het verlengen en condenseren spermatiden.
   • Type A spermatogonia zijn 12-14μm ca. in diameter en hebben ronde kernen die homogeen chromatine samenstelling.
   • Type B spermatogonia zijn 8-9μm ca. in diameter en hebben Round kernen die dichter heterochromatine langs de nucleaire periferie tonen.
   • Pre-leptoteen spermatocyten zijn 7.5-8.2μm ca. diameter, minder dan cytoplasma Type B spermatogonia en kernen hebben die vergelijkbaar zijn met die van categorie B spermatogonia kijken.
   • Leptoteen primaire spermatocyten zijn 8-10 um ca. in diameter en kernen hebben die lijken op die van pre-leptoteen spermatocyten uitzien, maar lijken dichter chromatine te doen aan de kernmembraan.
   • Zygotene primaire spermatocyten zijn 10-12 um ca. in diameter en kernen hebben die lijken op die van leptoteen primaire spermatocyten kijken.
   • Pachytene spermatocyten ergens 12-18 um ca. diameter en bestaan ​​uit een dunne rand van cytoplasma rond een grote kern. Meer klompen dichte chromatine te zien in de nucleus.
   • Ronde spermatiden zijn 10 micrometer ca. in diameter en hebben een ronde kern met een dicht-kleuring chromocenter in het midden.
   • Restlichamen zijn ~ 6,5 micrometer in doorsnede, zijn rond, en het gebrek aan een kern.
   • Verlengen en condenserende spermatiden zijn vergelijkbaar in grootte met spermatiden ronden, maar hebben een unieke, sikkelvormige kern.
   1. Begin met fractie 15 en vijf fracties tot 85 analyseren. Meestal zal fracties onder 15 te worden gemengd en klonterig en fracties dan 85 zal weinig tot geen bruikbare cellen bevatten.
   2. Om een ​​breuk analyseren rekening 5UL vloeistof uit de fractie verzamelbuis (nadat cellen werden geresuspendeerd na centrifugeren) en voeg aan 5UL van 8% formaldehyde in Krebs buffer. Laat de vaste cellen te zitten bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
   3. Voeg 5UL van 0,1% Triton en DAPI (5 μ / ml Krebs-buffer) aan de gefixeerde cellen. Laat de cellen op kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   4. Breng 10 pl van de verkregen oplossing op een glijbaan, bedek met een dekglaasje en geanalyseerd met een fluorescentie microscoop om de zuiverheid van elke fractie bepaald.
   5. Combineer fracties die vergelijkbaar in grootte en nucleaire morfologie zijn (zie "Representatieve resultaten") naar de volgende populaties van cellen te maken: de meiose en somatische diploïde cellen, ronde spermatiden en condenseren / verlengen spermatiden.

Resultaten

Het ideale resultaat van de STA-PUT procedure een vrij merkbaar scheiding van cellen van de testes basis van celgrootte en dichtheid. Terwijl cellen geisoleerd uit de testes sedimenteren via BSA gradiënt, kan een aantal verschillende groepen van cellen waargenomen. Eventuele klompen cellen neiging te zinken naar de bodem van de gradiënt en niet vervuilen de andere fracties. Een beetje verder op de helling zal de grote somatische en meiotische cellen. Verder de helling nog steeds kleiner ronde spermatiden. Op de top van ...

Discussie

Degenen die spermatogenese studeren vertrouwen op dierlijke modellen voor spermatogene cel monsters, als een betrouwbare celcultuur systeem bestaat nog niet voor het genereren van alle spermatogene celtypen ^3. Hoewel spermatogene cellen gemakkelijk worden verzameld uit heel testes, maar een gemengde bevolking leidt. Dit vormt een probleem voor degenen die wensen om specifieke subtypes van deze cellen, zoals cellen in de meiose, ronde spermatiden en condenseren spermatiden bestuderen. Drie verschillende method...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternatief kan worden gebruikt.
0,5%, 2% en 4% BSA-oplossingen	Los 0,25 g, 11 g en 22 g (respectievelijk) op in totaal volumes van 50 ml, 550 ml en 550 ml 1x KREBS (respectievelijk).	Te maken op de dag van de STA-PUT-procedure. Filter steriliseren.
KREBS (10x)	3,26 g KH2PO4 + 139,5 g NaCl +5,89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3,78 g CaCl2/2H20 + 7,12 g KCl, breng naar 2 L met ddH20	Autoclaveer/filter en bewaar bij 4 °C voor meerdere maanden.
KREBS (1x)	Los 4,24 g NaHCO3 op in 100 ml ddH20. Voeg 200 ml 10x KREBS toe. Breng naar 2 L met ddH20.	Te maken op de dag van de STA-PUT-procedure. Filter steriliseren.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsine	Sigma	T9201-1G
DAPI	Voorkeur van onderzoeker
Triton-X100	Voorkeur van onderzoeker
Formaldehyde (~37%)	Voorkeur van onderzoeker
TABEL 2: APPARATUUR
Apparatuur	Bedrijf	Catalogus #	Opmerkingen
Complete STA-PUT-apparatuur	ProScience Glass Shop	STA-PUT (deze procedure gebruikt de standaard sedimentatiekamer: Cat. Nr. 56700-500)	Omvat alle glaswerk en apparatuur voor het apparaat. Alternatief glaswerk is beschikbaar voor het uitvoeren van STA-PUT met kleinere celgetallen.
10 μm gaasfilter	Fisherbrand	22363549
Muisdissectiegereedschap	Voorkeur van onderzoeker
14 ml ronde bodem fractiecollectiebuizen met doppen	Voorkeur van onderzoeker
Ongeveer 100 buizen nodig
Fractiecollector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Productcode: 18-1177-40	Alternatief kan worden gebruikt.
Microscoopglaasjes, dekglaasje	Voorkeur van onderzoeker
Licht/Fluorescentiemicroscoop	Voorkeur van onderzoeker