We beschrijven een niet-invasieve beeldvorming methode voor het onderscheiden van inflammatoire fasen. Systemische toediening van luminol onthult gebieden van acute ontsteking afhankelijk MPO-activiteit in neutrofielen. Daarentegen injectie lucigenine maakt visualisatie van chronische inflammatie afhankelijk Phox activiteit in macrofagen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo beeldvorming methode om acute en chronische ontsteking Onderscheid
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ontsteking is een fundamenteel aspect van vele menselijke ziekten. In deze video verslag, tonen we aan niet-invasieve bioluminescentie imaging technieken die acute en chronische ontsteking te onderscheiden in muismodellen. Met weefselschade of pathogeen invasie, neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie, spelen een belangrijke rol in het bemiddelen van de acute ontstekingsreactie. Aangezien de inflammatoire reactie verloopt monocyten geleidelijk migreren naar de plaats van verwonding en differentiëren tot rijpe macrofagen, die chronische ontsteking mediëren en weefselherstel bevorderen door het verwijderen weefselstukjes en die anti-inflammatoire cytokines. Intraperitoneale injectie van luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazinedion, natriumzout) maakt detectie van acute ontsteking grotendeels gemedieerd door weefsel-infiltrerende neutrofielen. Luminol specifiek reageert met de superoxide die binnen de phagosomes neutrofielen bioluminescentie sinds gevolg van een myeloperoxidase (MPO) gemedieerde reactie. Lucigenine (bis-N-methylacridinium nitraat) reageert ook met superoxide om bioluminescentie genereren. Echter, lucigenine bioluminescentie is onafhankelijk van MPO en het uitsluitend steunt op fagocytensysteem NADPH oxidase (Phox) in macrofagen tijdens chronische ontstekingen. Samen luminol en lucigenine mogelijk niet-invasieve visualisatie en longitudinale beoordeling van diverse fagocyt populaties in zowel acute als chronische inflammatoire fase. Gezien de belangrijke rol van ontsteking bij een verscheidenheid van menselijke ziekten, geloven we dat niet-invasieve beeldvorming methode kan helpen onderzoeken de differentiële rol van neutrofielen en macrofagen in verschillende pathologische aandoeningen.
Inleiding
Ontsteking is een sterk gereguleerd biologische respons bij een verscheidenheid van menselijke ziekten, met inbegrip van microbiële infectie 1, wondgenezing 2, 3 diabetes, kanker 4, 5 cardiovasculaire, neurodegeneratieve 6, 7 en auto-immuunziekten. Weefselontsteking vereist een goede coördinatie van de verschillende immuuncellen om pathogeen klaring, weefselherstel, en de resolutie van de ziekte te bereiken. Neutrofielen en macrofagen zijn belangrijke immuun mediatoren van weefselontsteking. In de acute fase van ontsteking, neutrofielen eerste responders verschillende schadelijke stimuli en weefselschade 8. De neutrofielen snel extravasatie van verkeer naar de plaats van verwonding, waar de cellen inactiveren microben door het vrijgeven antimicrobiële granules en fagocytose. Tijdens fagocytose, overspoelen neutrofielen microben in fagosomen, waarbinnen de cellen produceren hoge niveaus van Superoxide (O 2 · -). Phagosomal superoxide is de primaire bron van vele downstream reactive oxygen species (ROS). Bijvoorbeeld kan superoxide worden dismutated waterstofperoxide (H 2 O 2) door spontane dismutatie of superoxide dismutase (SOD) 9, 10. In neutrofielen, myeloperoxidase (MPO) zet verder waterstofperoxide antimicrobiële hypochloorzuur (HOCl) 11. Aangezien ontstekingsreacties blijven, monocyten geleidelijk migreren naar de plaats van verwonding en differentiëren tot rijpe macrofagen 2, waarvan fagocytosefunctietesten helpen verwijderen geïnactiveerde pathogenen en celresten. Bovendien, als een sleutelrol in de latere fase van ontsteking, macrofaag stimuleert weefselherstel door het produceren van anti-inflammatoire cytokines 12 door het genereren en extracellulaire ROS op een lager niveau 9. De ROS gegenereerd in deze latere fase reguleren weefselremodellering, nieuwe bloedvatvorming en reepitheliabiliseren 13.
Fagocyt NADPH oxidase (Phox) is de primaire bron van superoxide productie in zowel neutrofielen en macrofagen 9. Phox is een multi-subunit complex waarvan de assemblage wordt strak gereguleerd 9. De holoenzyme bevat meerdere cytosole regulerende subeenheden (p67 phox, p47 phox, p40 phox en RAC) en een membraan-gebonden heterodimeer cytochroom b 558 (bestaan uit subunit CYBA en CYBB). Cytochroom b 558 is de reactie kern waarin het CYBB subeenheid (ook bekend als p91 phox en NOX2) voert de primaire redox kettingreactie 9. Interessant is dat de assemblage sites zijn verschillend tussen neutrofielen en macrofagen. In rustende neutrofielen, cytochroom b 558 is vooral aanwezig in het membraan van intracellulaire opslag granules 14. Tijdens fagocytose, neutrofielen assembleren de holoenzymes op phagosomes 9, die een hoog gehalte MPO activiteit aanwezig. De neutrofielen Phox verbruikt snel zuurstof en oefent zijn microbicidal macht door ROS productie, een fenomeen genaamd de respiratoire burst 11. Daarentegen macrofagen een lager MPO expressie en cytochroom b 558 wordt meestal gevonden in de plasmamembraan 15, 16. Zo neutrofielen produceren hoge niveaus van superoxide voor anti-microbiële activiteit, terwijl macrofagen produceren minder superoxide voor regulerende functies 15.
Omdat de ontsteking is een ingewikkeld in vivo proces, zouden niet-invasieve beeldvormende methoden die specifiek zijn voor de verschillende fasen van ontsteking kwantitatieve en longitudinale beoordeling van de ziekte modellen laten. Gebruik mechanistische studies hebben we eerder aangetoond dat het gebruik van twee chemiluminescente agentia, luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazinedion) en lucigenine (bis-N-methylacridinium nitraat)Voor niet-invasieve beeldvorming van acute en late (chronische) stadia van ontsteking, respectievelijk 17. Luminol maakt visualisatie van neutrofielen MPO activiteit in de acute fase van ontsteking 18-20, terwijl lucigenine bioluminescentie kunnen worden gebruikt om macrofaagactiviteit in samenwerking ervan met de late fase of chronische ontsteking 17. In dit manuscript, gebruikten we twee experimentele inflammatiemodellen (sc PMA en sc LPS) om deze beeldvormende technieken demonstreren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Alle dierlijke studies werden uitgevoerd onder erkende institutionele protocollen en richtlijnen verzorging van dieren.
1. Reagentia en oplossingen
- PMA oplossing sc inoculatie: Bereid een voorraadoplossing van forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en 5 mg / ml in DMSO. Bewaar de voorraad oplossing bij -20 ° C. Voor enting, ontdooi de stockoplossing en verdun tot 1 mg / ml PMA in PBS.
- LPS oplossing sc inoculatie: Los lipopolysaccharide (LPS van Salmonella enterica serotype enteritidis) in steriele PBS bij 1 mg / ml voor sc inoculatie.
- Luminol oplossing acute fase beeldvorming: Los luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazinedion, natriumzout) in steriele fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl) bij 10 mg / ml. De oplossing kan bij -20 ° C worden bewaard voor gebruik.
- Lucigenine oplossing voor de chronische fase beeldvorming: Los lucigenine (bis-N-methylacridinium nitraat) in steriele fysiologische zoutoplossingbij 2,5 mg / ml. De oplossing kan bij -20 ° C worden bewaard voor gebruik.
2. Subcutane PMA Ontsteking Model
- Verdoven NCR naakt muizen in een inductie kamer met 1-2% isofluraan. Bevestig algemene anesthesie door het verlies van beweging en een constante ademhalingsfrequentie. Overdracht van een dier naar een neuskegel met isofluraan-gemengde gas geleverd en houdt het dier onder narcose.
- Gebruik een isopropylalcohol vegen schoon te maken en te desinfecteren de injectieplaats op de linker flank.
- Met behulp van steriele techniek, injecteer 50 ul van de PMA inoculatie oplossing (bevattende 50 ug PMA) in de subcutane ruimte op de linkerflank. Verwijder overtollig vocht uit de injectieplaats met behulp van een isopropylalcohol pad. Vermijd het gebruik van analgesie als het kan invloed hebben op ontstekingsreacties.
- Verplaats het dier terug naar de behuizing kooi en nauwlettend toezien op het herstel van de anesthesie. Om te helpen bij het herstel, gebruiken een verwarmingselement om het dier warm.
3. Subcutane LPS Ontsteking Model
- Verdoven C57BL/6J-muizen met 1-2% isofluraan in een inductie kamer. Zodra de vaststelling van algemene anesthesie, dragen een dier naar een neuskegel met isofluraan gas geleverd en houdt het dier onder narcose.
- Gebruik een isopropylalcohol Veeg de injectieplaats reinigen links voetzool.
- Met behulp van steriele techniek, injecteer 50 ul van de LPS inoculatie oplossing (bevattende 50 ug LPS) in de linker voetzool. Verwijder overtollig vocht uit de injectieplaats met behulp van een isopropylalcohol pad. Vermijd het gebruik van analgesie als het kan invloed hebben op ontstekingsreacties.
- Verplaats het dier terug naar de behuizing kooi en nauwlettend toezien op het herstel van de anesthesie. Gebruik een verwarmingselement om het dier warm te houden tijdens het herstel.
4. Bioluminescentie beeldvorming van ontsteking
- Verdoven van het dier in een inductie kamer met 1-2% isofluraan-mixed gas. Confirm algemene anesthesie door het verlies van beweging en een constante ademhalingsfrequentie.
- Terwijl het dier nog onder narcose, intraperitoneaal (ip) injectie de luminol-oplossing (10 mg / ml), of lucigenine oplossing (2,5 mg / ml) voor acute of chronische ontsteking beeldvorming, respectievelijk. De uiteindelijke dosis is 100 mg / kg voor luminol en 25 mg / kg voor lucigenine. Een lagere dosis van lucigenine (10-15 mg / kg) kan worden gebruikt om mogelijke toxiciteit enkele muizenstammen voorkomen. Tekenen van toxiciteit zijn kortademigheid en ademnood. De C57BL/6J stam heeft een lagere lucigenine tolerantie dan de NCR naakt stam.
- Breng de dieren in de beeldvorming kamer van een bioluminescentie imaging systeem.
- Voer sequentiële bioluminescentieweergave op 1 min. intervallen. Elke beeldvorming stap bestaat uit 1 min acquisitie tijd, f / stop = 1, binning = 16 en 0 seconden vertraging.
- Binnen de beeldopname paneel, om sequentiële multi-step beeldvorming inschakelen, klik op de volgorde instellen BUtton. Zorg voor voldoende beeldvorming stappen in de overname profiel naar maximale luminescentie-uitgang (meestal 15 een minuut stappen zal volstaan) te bepalen. De 15-min beeldvorming sectie laat voldoende tijd voor substraat absorptie en systemische circulatie.
- Verwijder het dier de beeldvorming kamer en verplaatsen naar de behuizing kooi. Om te helpen bij het herstel, gebruiken een verwarmingselement om het dier warm.
- Tijdens post-acquisitie-analyse, gebruikt u de imaging software pakket aan piek totale lichtgevende signaal te berekenen door middel van gestandaardiseerde regio van belang (ROI). De beelden zijn aanwezig als uitstraling in fotonen / sec / cm 2 / sr met minimale en maximale drempel aangegeven. Kwantitatieve gegevens worden gepresenteerd als totale flux in fotonen per seconde per ROI.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We voerden longitudinale bioluminescentieweergave om acute en chronische ontsteking te beoordelen in experimentele ontsteking modellen. Forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) is een krachtige proteïne kinase C (PKC) agonist die Phox voor superoxide anion productie activeert en triggers intense acute ontstekingsreacties 21. SC injectie van 50 mg van PMA in NCR naakt muizen veroorzaakt een snelle huidirritatie en acute ontsteking op injectieplaats 18, 22, 23. We voerden dagelijks beeldvorming voor 4 da...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit rapport demonstreren we een bioluminescentie methode voor niet-invasieve beeldvorming van ontsteking bij levende dieren. Gebruikmakend van twee luminescerende substraten, luminol en lucigenine, kan de werkwijze onderscheiden fasen van ontsteking. Luminol bioluminescentie wordt geassocieerd met neutrofielen in de acute fase van ontsteking, terwijl lucigenine bioluminescentie wordt gemedieerd door macrofagen in de chronische fase. Relatief kleine (MW = 177,16 g / mol) en elektrisch ongeladen, kan luminol gemakkelij...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten in deze studie.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Nancy Lurie Marks Foundation. Wij danken dr. Nancy E. Kohl voor kritische lezing van het manuscript. Wij danken Kin K. Wong voor zijn hulp bij de voorbereiding van dit videoverslag.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide van Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, natriumzout) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenine (bis-N-methylacridiniumnitraat) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum beeldvormingssysteem met Living Imaging 4.2 softwarepakket | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
Referenties
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).
- Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
- Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
- Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
- Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
- Harlan, J. M. Leukocyte-endothelial interactions. Blood. 65, 513-525 (1985).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
- Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
- Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
- Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
- Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
- Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
- Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
- Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
- Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
- Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
- Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
- Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
- Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
- Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
- Dahlgren, C., Karlsson, A. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).
- Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
- Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
