Method Article

Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles

DOI:

10.3791/50726

⸱

October 10th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Tufts University, 2Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), 3Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een werkwijze voor het profileren speekseleiwitten met multiplex-microsfeer gebaseerde antilichaam arrays. Monoklonale antilichamen werden covalent gebonden aan fluorescerende kleurstof gecodeerd 4,5 urn polymere microsferen middels carbodiimide chemie. De gewijzigde microsferen werden afgezet in glasvezel-microwells eiwit niveaus in het speeksel te meten met behulp van fluorescentie sandwich immunoassays.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin beschrijven we een protocol voor het gelijktijdig meten van zes eiwitten in het speeksel met een vezeloptische-microsfeer gebaseerde antilichaam array. De immuno-array-technologie die combineert de voordelen van op microsfeer gebaseerde suspensie matrix productie met gebruik van fluorescentiemicroscopie. Zoals beschreven in de video-protocol, werden commercieel verkrijgbaar 4,5 urn polymeermicrosferen gecodeerd in zeven verschillende soorten, onderscheiden door de concentratie van twee fluorescente kleurstoffen fysiek opgesloten in de microsferen. De gecodeerde microsferen die oppervlak carboxylgroepen werden gewijzigd met monoklonale antilichamen capture via EDC / NHS koppeling chemie. Om het eiwit microarray assembleren, de verschillende soorten van gecodeerde en gefunctionaliseerde microbolletjes werden gemengd en willekeurig gestort in 4,5 urn microputjes, die chemisch werden geëtst op het proximale einde van een vezeloptische bundel. De vezeloptische bundel werd gebruikt als zowel een drager en voor het afbeelden van de microspheres. Afgewerkt, werd de microarray gebruikt om eiwitten te vangen in het speeksel supernatant verzameld uit de kliniek. De detectie is gebaseerd op een sandwich immunoassay met een mengsel van gebiotinyleerde detectie antilichamen voor verschillende analyten met een streptavidine-geconjugeerde fluorescente probe, R-fycoerythrine. De microarray werd afgebeeld door fluorescentiemicroscopie in drie verschillende kanalen, twee voor microsfeer registratie en een voor de test signalen. De fluorescentie microfoto's werden vervolgens gedecodeerd en met een zelfgemaakte algoritme in MATLAB geanalyseerd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinds de eerste microarray gemeld door Mark Schena en collega's in het midden van de jaren 1990, heeft deze krachtige tool is gebruikt op vele terreinen van biologisch onderzoek 1. Antilichaam microarrays kan tegelijkertijd detecteren van meerdere eiwitten in diagnostische fluïda, zoals bloed, hebben belangrijke toepassingen in de klinische diagnostiek en biomarker screening 2-10. Speeksel, die veel van dezelfde analyten zoals bloed, wordt beschouwd als een beter alternatief voor bloed doordat speekselinzameling veilig, niet-invasieve, en kan door minimaal geschoold medisch personeel 11-13 worden uitgevoerd. Momenteel wordt gemult....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Figuur 1. . Workflow voor toepassing vezeloptische microsfeer antilichaam array speeksel profilering (1) Microsferen worden intern gecodeerd met twee fluorescerende kleurstoffen, (2) de gecodeerde microbolletjes uitwendig gemodificeerd met eiwit-specifieke monoklonale antilichamen, (3) de gemultiplexte microsferen worden gemengd, en (4) willekeurig gestort in microputjes geëtst op het proximale uiteinde van een vezel-optische bundel, (5) speekseleiwitten weergegeven doo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentie beelden van drie kanalen toont een klein gedeelte van de vezel-optische bundel zijn weergegeven in figuren 2A-C. Deze beelden werden geanalyseerd met een algoritme geschreven in MATLAB (zoals in meer detail beschreven in het hoofdstuk discussie). De analyse maakt gebruik van beide informatie van de Eu-TTA afbeelding codering (figuur 2A) en het C30-codering afbeelding (Figuur 2B) aan de microsferen decoderen, en de fluorescentie-intensiteiten van verschille.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoekers moeten extra aandacht besteden aan de volgende stappen: voor betere nauwkeurigheid decoderen, is het noodzakelijk te controleren of de microsferen werden homogeen gesuspendeerd in alle incubatie en wassen stappen tijdens de microsferen coderingsprocedure. Bovendien moeten de gecodeerde microbolletjes worden beschermd tegen licht gedurende het gehele experiment. Na juiste codering en opslagprocedures, vonden we dat algehele nauwkeurigheid decoderen was boven 99%. De gecodeerde microsferen moet worden bewaard.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (subsidie ​​08UDE017788-05). EBP erkent ook steun van de Spaanse Stichting voor Wetenschap en Technologie (FECYT). De auteurs danken Shonda T. Gaylord en Pratyusha Mogalisetti voor kritische lezing van het manuscript.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Eu-TTA kleurstofFisher ScientificAC42319-0010
THFSigma-Aldrich34865-100ML
Bernstein glazen vialFisher Scientific03-339-23B
Coumarine 30 kleurstofSigma-Aldrich546127-100MG
MicrosferenBangslabsPC05N/6698
1.5 ml microcentrifugebuizenFisher Scientific05-408-129
PBS 10x concentraatSigma-AldrichP5493-1L
WaterSigma-AldrichW4502-1L
MethanolSigma-Aldrich34860-100ML
Tw-20Sigma-AldrichP7949-100 ml
BupH MES gebufferde zoutoplossingThermo Scientific28390
SDSSigma-Aldrich05030-500ML-F
NaOH-oplossingFisher ScientificSS256-500
Safe-lock microcentrifugebuisVWR labshop53511-997
EDCThermo Scientific22980
Sulfo-NHSThermo Scientific24510
Human VEGF capture antilichaamR&D SystemsMAB293
Human IP-10 capture antilichaamR&D SystemsMAB266
Human IL-8 capture antilichaamR&D SystemsMAB208
Human EGF capture antilichaamR&D SystemsMAB636
Human MMP-9 capture antilichaamR&D SystemsMAB936
Human IL-1β capture antilichaamR&D SystemsMAB601
Mouse IgG1 isotype control antilichaamR&D SystemsMAB002
StartingBlock (TBS) bufferThermo Scientific37542
HCl standaardoplossing 1.0 NSigma-Aldrich318949-500 ml
0.5 ml microcentrifugebuizenFisher Scientific05-408-120
Proteïnevrij (PBS) bufferThermo Scientific37572
Recombinant human VEGF 165R&D Systems293-VE
Recombinant human IP-10R&D Systems266-IP
Recombinant human IL-8R&D Systems208-IL
Recombinant human EGFR&D Systems236-EG
Recombinant human MMP-9R&D Systems911-MP
Recombinant human IL-1βR&D Systems201-LB
StartingBlock T20 (PBS) bufferThermo Scientific37539
Blocker BSA in PBSThermo Scientific37525
Biotinyleren VEGF detectie antilichaamR&D SystemsBAF293
Biotinyleren IP-10 detectie antilichaamR&D SystemsBAF266
Biotinyleren IL-8 detectie antilichaamR&D SystemsBAF208
Biotinyleren EGF detectie antilichaamR&D SystemsBAF236
Biotinyleren MMP-9 detectie antilichaamR&D SystemsBAF911
Biotinyleren IL-1β detectie antilichaamR&D SystemsBAF201
Streptavidine, R-fycoerytrineInvitrogenS-21388
Ethanol (200 proof)Sigma-AldrichE7023-500ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
  2. Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
  3. Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Fluorescent MicroarraySalivary Protein AnalysisPolymer MicrospheresFiber optic BundlesMicrosphere EncodingAntibody CouplingFluorescence MicroscopySandwich ImmunoassayBiofluid AnalysisMATLAB Algorithm

Related Articles