Methodenartikel

Een in vitro model om immuunresponsen van humane perifere bloedmononucleaire cellen op humane respiratoire syncytiële virusinfectie te bestuderen

7.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50766

⸱

10 december 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

In dit artikel

Samenvatting

Het humaan respiratoir syncytieel virus (HRSV) kan ernstige bronchiolitis veroorzaken bij jonge zuigelingen. Een deel van de pathogenese van ernstige HRSV-ziekte wordt veroorzaakt door de immuunrespons van de gastheer. Stimulatie van primaire menselijke immuuncellen met HRSV biedt een snel en reproduceerbaar modelsysteem om de activering van ontstekingsroutes en infectie te bestuderen.

Samenvatting

Humane respiratoire syncytiële virus (HRSV) infecties presenteren een breed spectrum van ziekteseveriteit, variërend van milde infecties tot levensbedreigende bronchiolitis. Een belangrijk onderdeel van de pathogenese van ernstige ziekte is een versterkte immuunrespons die leidt tot immunopathologie.

Hier beschrijven we een protocol dat wordt gebruikt om de immuunrespons van menselijke immuuncellen op een HRSV-infectie te onderzoeken. Eerst beschrijven we methoden die worden gebruikt voor het kweken, zuiveren en kwantificeren van HRSV. Vervolgens beschrijven we een menselijk in vitro model waarin perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) worden gestimuleerd met levend HRSV. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om meerdere parameters te bestuderen die kunnen bijdragen aan ziekteseveriteit, inclusief de aangeboren en adaptieve immuunrespons. Deze reacties kunnen worden gemeten op transcriptie- en translatieniveau. Bovendien kan virale infectie van cellen eenvoudig worden gemeten met behulp van flowcytometrie. Samengevat biedt stimulatie van PBMC met levend HRSV een snel en reproduceerbaar modelsysteem om mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij HRSV-geïnduceerde ziekte.

Inleiding

Het humaan respiratoire syncytiële virus (HRSV) is de meest voorkomende oorzaak van infecties van de lagere luchtwegen bij kinderen. Elk jaar worden meer dan 33 miljoen kinderen jonger dan vijf jaar besmet met HRSV, wat leidt tot meer dan drie miljoen ziekenhuisopnames en bijna 200.000 sterfgevallen1. Een groeiend aantal bewijzen suggereert dat HRSV ook een aanzienlijke bedreiging vormt voor ouderen en volwassenen met onderliggende chronische ziekten2.

De meeste HRSV-infecties bij jonge kinderen vertonen milde symptomen, vergelijkbaar met de gewone verkoudheid, en vereisen geen klinische interventie. Echter, een klein deel van de patiënten vereist ziekenhuisopname en mechanische ventilatie vanwege ernstige bronchiolitis.

Een deel van de pathogenese van HRSV-ziekte is de overdreven en ontoereikende immuunrespons van de gastheer op infectie3,4. Dit wordt geïllustreerd door verschillende waarnemingen. De periode van maximale ziekte wordt vaak voorafgegaan door het hoogtepunt van virale infectie en valt beter samen met cellulaire infiltratie van geïnfecteerde weefsels en de afgifte van inflammatoire cytokinen3. Een andere lijn van bewijs komt van de formaline-geïnactiveerde HRSV (FI-RSV) proeven in de jaren 1960. In plaats van bescherming te induceren bij jonge zuigelingen, resulteerde het vaccin in een overdreven immuunrespons die leidde tot verhoogde respiratoire aandoeningen en een hogere morbiditeit en mortaliteit.

Er zijn verschillende modellen ontwikkeld om de pathogenese van HRSV-infecties te bestuderen. Continue cellijnen, zoals HEp-2 en A549, zijn uitgebreid gebruikt om HRSV-infectie in vitro te bestuderen. Epitheelcellen zijn de primaire doelwitten van HRSV-infectie5, daarom is er veel aandacht voor deze celtypen. De in vivo situatie is echter veel complexer en niet beperkt tot één celtype. Om deze complexe interacties te onderzoeken, zijn verschillende dierlijke infectiemodellen ontwikkeld om de pathogenese van HRSV te bestuderen. Tot nu toe zijn twee verschillende strategieën toegepast, waarbij de focus ligt op zowel heterologe (niet-menselijke) modellen als cognate gastheer-pneumovirus modellen. Voorbeelden van heterologe modellen voor HRSV zijn chimpansees, schapen, katoenratten en muizen. RSV-infectie in zijn natuurlijke gastheer is bestudeerd bij runderen en bij muizen, met respectievelijk bovien RSV en pneumovirus.

Hoewel elk van deze modellen belangrijke inzichten heeft opgeleverd in de pathogenese van de ziekte, is HRSV sterk aangepast aan mensen. Daarom, als aanvulling op de cellijnen en diermodellen die momenteel worden gebruikt, stellen we voor om menselijke primaire PBMC's te gebruiken als een model voor stimulatie met HRSV. Menselijke PBMC's kunnen worden verkregen van een reeks individuen om specifieke onderzoeksvragen aan te pakken, inclusief jonge kinderen6, immuungecompromitteerde individuen evenals gezonde volwassenen7 of oudere individuen8. PBMC's kunnen worden gebruikt om zowel ingeboren aspecten van infectie als de adaptieve respons op het virus te bestuderen. Geactiveerde ontstekingsroutes die belangrijk zijn voor de pathogenese van HRSV-ziekte kunnen worden bestudeerd op mRNA- en eiwitniveau. Verder kan virale infectie van (subsets van) immuuncellen worden bepaald door middel van flowcytometrie. We hebben dit model eerder gebruikt om de synergistische effecten van HRSV-infectie samen met de bacteriële ligand muramyl dipeptide (MDP) op de inductie van pro-inflammatoire cytokinen te identificeren7. We stellen voor om HRSV-stimulatie van menselijke primaire PBMC's te gebruiken als een robuust, eenvoudig en snel in vitro model om ontstekingsroutes betrokken bij de pathogenese van HRSV-ziekte te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Let op:

Experimenten met HRSV moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskabinet in een laboratorium met biosafety level 2. Verzamel al het virale afval en materiaal dat in contact is geweest met het virus voor een correcte afvoer vanwege biologische risico's.

Er moeten speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het gebruik van potentieel geïnfecteerd menselijk bloed.

Het is essentieel om gedurende alle protocollen endotoxine-vrije reagentia te gebruiken.

1. Kweken van HRSV A2

  1. Kweek HeLa- of HEp-2-cellen in DMEM-medium + 10% foetaal kalfserum (FCS) + 1% penicilline/streptomycine (P/S) in een kweekfles van 175 cm2 tot ze ongeveer 50% confluent zijn.
  2. Was de cellen drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op kamertemperatuur).
  3. Ontdooi een buisje met HRSV seeding stock-virus bij 37 °C in een waterbad. Verdun de virusstock zodanig dat de MOI 0,1 of lager blijft. Dit voorkomt de vorming van defecte interfererende deeltjes (DIPs). Verdun de virusstock in 4 ml/fles infectiemedium (DMEM + 1% P/S) en voeg dit toe aan de HeLa- of HEp-2-cellen. Houd dit volume zo laag mogelijk zonder dat de cellen uitdrogen. Hoe lager het volume, hoe hoger de infectiegraad zal zijn.
  4. Incubeer 2-4 uur bij 37 °C, 5% CO2. Schud de fles elke 15 min rond om het medium te herverdelen.
  5. Verwijder het inoculum en was één keer met PBS.
  6. Voeg 15 ml kweekmedium (DMEM + 10% FCS + 1% P/S) toe en incubeer gedurende 3-5 dagen bij 37 °C, 5% CO2. Observeer de cellen met normale bright-field microscopie op virus-geïnduceerde cytopathologische veranderingen, bijv. syncytiavorming, celdood en drijvende cellen.
  7. Wanneer cytopathologie optreedt, oogst dan HRSV door de cellen af te schrapen en verzamel de virussuspensie in een steriele buis van 50 ml. Vortex de celsuspensie. Het schrapen en vortexen van de cellen laat meer virusdeeltjes vrij.
  8. Centrifugeer de virussuspensie 10 min op kamertemperatuur bij 1.800 x g om het celdebris te pelletten. HRSV in het supernatant pelletteert niet bij deze snelheid; het supernatant kan direct worden gebruikt om meerdere flessen van 175 cm2 te infecteren of kan bij -80 °C worden bewaard als seeding stock in aliquoten van 1 ml voor toekomstig gebruik. Snap-freeze HRSV altijd in vloeibare stikstof om verlies van infectieuze virusdeeltjes te voorkomen.
  9. Zoals hierboven vermeld, wordt de seeding stock die met het bovenstaande protocol is gemaakt, gebruikt om meerdere kweekflessen van 175 cm2 te infecteren. Herhaal exact hetzelfde protocol om meer virus te produceren voor zuivering. Zuiver tot 180 ml virussuspensie in één ultracentrifugatiecyclus.
  10. Wanneer cytopathologie optreedt, oogst dan HRSV door de cellen af te schrapen en verzamel het supernatant. Vortex de virussuspensie. Centrifugeer 10 min op kamertemperatuur bij 1.800 x g om het celdebris te pelletten. HRSV in het supernatant pelletteert niet bij deze snelheid en het supernatant wordt verdeeld in aliquoten van 15 ml per 50 ml buis. Snap-freeze en bewaar bij -80 °C tot aan de zuivering.

2. Zuivering van HRSV

Let op: Wees u ervan bewust dat een ultracentrifuge een potentieel gevaarlijk stuk apparatuur is voordat u deze gebruikt. Lees de handleidingen en voer de eerste ultracentrifugatie-run uit onder toezicht van iemand met ervaring.

  1. Reinig de ultracentrifugebakjes met 70% ethanol en laat ze drogen in een biologische veiligheidskast.
  2. Plaats in elk bakje een steriele centrifugebuis.
  3. Bereid een 30% (w/v) sucrose-oplossing in PBS voor, steriliseer deze door filtratie (0,2 μm filter) en voeg 5 ml toe aan de bodem van elke centrifugebuis. Voor een sneller protocol kunnen de buizen met sucrose-oplossing worden ingevroren. Zorg ervoor dat ze steriel blijven.
  4. Als de sucrose-oplossing niet is ingevroren, voeg dan zeer voorzichtig 30 ml HRSV-oplossing toe bovenop deze sucrose-oplossing. Pipetteer langzaam om te voorkomen dat de sucrose-oplossing wordt verstoord. Houd een duidelijke scheidingslijn aan. Als de buizen zijn ingevroren, giet de virale suspensie dan bovenop de bevroren sucrose-oplossing en laat deze vervolgens ontdooien.
  5. Balanceer de zes ultracentrifugebakjes zeer zorgvuldig met steriele PBS. Plaats de weegschaal in een flowcabinet om alles steriel te houden. Vul de buizen tot 3-5 mm onder de rand, anders kunnen de centrifugebuizen inklappen. Balanceer de bakjes tot op 0,1 g en houd rekening met de schroefdop, voor het geval de doppen niet perfect gelijk zijn.
  6. Centrifugeer in de ultracentrifuge gedurende 1,5 uur bij 4 °C op 20.000 rcf.
  7. Verwijder de centrifugebuis voorzichtig uit het bakje met een steriele pincet. Virusdeeltjes zullen door de sucroselaag zijn gegaan en een pellet vormen. Omgekeerd zullen door cellen uitgescheiden oplosbare factoren (bijv. cytokinen) in oplossing blijven. Kantel de centrifugebuis om al het vloeistof af te voeren. Laat de buis ondersteboven drogen op een steriel oppervlak, bijv. een kweekplaat, maar laat de pellet niet volledig uitdrogen.
  8. Voeg voorzichtig 1 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) toe aan de pellet en kantel de centrifugebuis om de HBSS af te voeren. Laat de buis opnieuw ondersteboven drogen op een steriel oppervlak. Laat de pellet niet volledig uitdrogen.
  9. Resuspendeer de pellet in 1 ml HBSS door 40 keer op en neer te pipetteren. Probeer de vorming van luchtbellen te voorkomen, omdat dit het virus kan vernietigen.
  10. Verdeel het virus in aliquots, vries deze snel in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C tot aan verder gebruik. Gebruik voor elk experiment een nieuwe aliquot virus, aangezien herhaaldelijk invriezen en ontdooien de infectieuze titer zal verlagen. Ontdooi het virus bij het ontdooien altijd bij 37 °C, aangezien HRSV minder stabiel is tussen -20 en 15 °C.

3. Kwantificering van HRSV

Let op: Om reproduceerbare gegevens te garanderen, dient de kwantificering ten minste 3x in duplo te worden herhaald.

3.1. Infectie van A549-cellen

  1. Kweek A549-cellen in een 24-wellplaat tot ze confluent zijn.
  2. Was de A549-cellen twee keer met 1 ml PBS bij kamertemperatuur.
  3. Bereid seriële 5-voudige verdunningen van HRSV voor in Reduced Serum Medium. Voeg 100 μl van het verdunde virus toe aan beide wells. Maak minimaal 4 verdunningen (bijv. 4-, 20-, 100- en 500-voudig). Voeg twee extra wells toe die zijn geïnfecteerd met de hoogste dosis virus (deze worden gebruikt voor de isotypecontrole) en voeg twee mock-geïnfecteerde wells toe.
  4. Incubeer de cellen gedurende 2 uur bij 5% CO2, 37 °C. Schud de 24-wellplaten elke 15 min om uitdroging te voorkomen.
  5. Verwijder de virussuspensie en was de cellen 1x met 1 ml PBS bij kamertemperatuur.
  6. Bereid 4% (w/v) runderserumalbumine (BSA) voor in Reduced Serum Medium. Steriliseer door filtratie (0,2 μm filter) en voeg 500 μl toe aan elke well.
  7. Incubeer bij 5% CO2, 37 °C gedurende 22 uur.

3.2. Voorbereiding voor FACS

  1. Verwijder het medium en was de cellen eenmaal met 1 ml PBS op kamertemperatuur.
  2. Voeg 200 μl voorverwarmde trypsine (37 °C) toe aan elke put en incubeer 10 min bij 37 °C, 5% CO2.
  3. Controleer onder de microscoop of de cellen zijn losgelaten. Indien de cellen zijn losgelaten, voeg dan 800 μl DMEM + 10% FCS + 1% P/S toe om de trypsine te neutraliseren. Resuspendeer de cellen.
  4. Overbreng de cellen naar een conische 96-wells plaat die niet is behandeld voor weefselkweek. Centrifugeer 5 min bij 400 x g op kamertemperatuur. Resuspendeer de pellets in 200 μl koude PBS.
  5. Centrifugeer 5 min bij 400 x g bij 4 °C. Giet het supernatant af en resuspendeer in 200 μl koude PBS.
  6. Centrifugeer 5 min bij 400 x g bij 4 °C. Giet het supernatant af en resuspendeer in 150 μl 80% ijskoude aceton.
  7. Fixeer de cellen gedurende 15 min op kamertemperatuur.
  8. Centrifugeer 5 min bij 400 x g bij 4 °C. Giet het supernatant af en resuspendeer in 200 μl koude PBS + 0,1 % BSA.
  9. Centrifugeer 5 min bij 400 x g bij 4 °C. Giet het supernatant af en resuspendeer in 50 μl anti-NP-RSV-FITC (1:50 verdund in PBS + 1% BSA) of 50 μl IgG2 anti mouse-FITC (dit is een isotypecontrole; gebruik daarom dezelfde antilichaamconcentratie).
  10. Houd de buisjes voor de rest van het protocol in het donker. Incubeer minimaal 1 uur bij 4 °C, maar dit kan worden verlengd tot overnacht.
  11. Voeg 150 μl koude PBS + 0,1% BSA toe.
  12. Centrifugeer 5 min bij 400 x g bij 4 °C. Giet het supernatant af en resuspendeer in 200 μl koude PBS + 0,1% BSA.
  13. Centrifugeer 5 min bij 400 x g bij 4 °C. Giet het supernatant af en resuspendeer in 200 μl koude PBS + 0,1% BSA. Bewaar de plaat op ijs en in het donker tot de FACS-meting.
  14. Meet de geïnfecteerde cellen met een flowcytometer.

3.3. FITC-50 berekening

  1. Gebruik een analyseprogramma voor flowcytometrie om de afkapwaarde in te stellen met behulp van de negatieve controle (isotype controle). Gebruik het Pseudocolor-grafiektype. Teken een kwadrantgate, waarbij de positieve cellen zich in veld Q3 bevinden. Het percentage fout-positieven moet in beide isotype controles onder de 0,2% liggen.
  2. Exporteer de gegevens naar een spreadsheetprogramma en maak een tabel met het percentage FITC+ cellen voor elke verdunning. Trek voor elke waarde bij elk experiment de gemiddelde waarde van de fout-positieven (zoals bepaald door de isotype controle) af.
  3. Open een nieuw bestand (XY-spreidingsplot, enkele X- en meerdere Y-kolommen) in een statistisch programma. Kopieer de gegevens naar dit programma: X = verdunning, Y = % geïnfecteerde cellen, n = 3; gebruik het gemiddelde van twee metingen voor elke verdunning. Voer een niet-lineaire regressie uit via een statistische analyse van een één-fasige exponentiële afname. Controleer of de curve aansluit bij de datapunten; is dat niet het geval, kies dan een andere statistische analyse.
  4. Kopieer de vergelijking voor de curve en de waarden voor de vergelijking naar een spreadsheetprogramma. Bereken de X-waarde voor Y = 50%. Bepaal op basis hiervan de FITC-50 waarde door de door FITC gedetecteerde infectieuze particles/ml (FIP/ml) te berekenen bij de verdunning waarbij er sprake is van 50% infectie, met behulp van de volgende vergelijking:
    Berekeningsformule FITC50; diagram dat de vergelijking voor de meting van fluorescentie-intensiteit illustreert.
    A = gemiddeld aantal A549 cellen/well
    B = μl virus per well gebruikt voor infectie
    C = verdunning waarbij er sprake is van 50% infectie

4. Isolatie van mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) uit bloed van gezonde vrijwilligers

  1. Neem veneus bloed af in 10 ml EDTA-buisjes van gezonde vrijwilligers na geïnformeerde toestemming. Een volume van 10 ml bloed levert ongeveer 107 PBMC's op.
  2. Werk vanaf nu steriel in een laminaire flowkast.
  3. Verdun het bloed 2x met PBS op kamertemperatuur in een 50 ml buisje. Per 50 ml buisje kan een maximaal totaal volume van 35 ml verdund bloed worden gebruikt.
  4. Neem een steriele spuit van 50 ml en bevestig een gesteriliseerde Luer-lock naald. Zuig het densiteitsgradiëntmedium op in de spuit. Plaats de naald op de bodem van een buisje met verdund bloed en pipetteer voorzichtig 15 ml densiteitsgradiëntmedium onder het verdunde bloed. Houd een duidelijke scheiding tussen het densiteitsgradiëntmedium en het bloed.
  5. Centrifugeer 20 min bij 800 x g op kamertemperatuur met een versnelling van 9 (max) en zet de rem uit. Stel de temperatuur van de centrifuge na gebruik in op 4 °C.
  6. De densiteitsgradiëntcentrifugatie resulteert in meerdere lagen. Onderaan bevindt zich een pellet met erytrocyten met daarboven een zilverachtige laag, die de neutrofielen bevat. De heldere laag boven deze pellet bevat het densiteitsgradiëntmedium. Een dunne laag tussen het densiteitsgradiëntmedium en de bloedplasmalayer bovenaan bevat de PBMC's.
  7. Verzamel de PBMC's voorzichtig met een Pasteur-pipet en breng de cellen over naar een nieuwe 50 ml buis. Houd de PBMC's vanaf nu op ijs en gebruik ijskoud PBS. Voeg ijskoud PBS toe tot een volume van 50 ml en centrifugeer 10 min bij 400 x g bij 4 °C (met de rem ingesteld op 9).
  8. Verwijder het supernatant door aspiratie, resuspendeer de pellet in 50 ml ijskoud PBS en centrifugeer 10 min bij 400 x g bij 4 °C; herhaal dit 2x.
  9. Voeg na het verwijderen van het supernatant 1 ml ijskoud medium (RPMI + 1% P/S) toe en tel de cellen met behulp van een telkamer.
  10. Stel de celconcentratie in op 5 x 106 PBMC's/ml.

5. Stimulatie van PBMC's met levend HRSV

  1. Maak de opstelling voor het experiment klaar; neem experimentele duplicaten op voor elke conditie.
  2. Verdun alle benodigde stimuli in medium (RPMI + 1% P/S). Houd er rekening mee dat het uiteindelijke volume per well 200 μl zal zijn. Er zal een volume van 50 μl stimuli worden toegevoegd, bereid daarom 4x geconcentreerde stimulatievoorraden.
  3. Voeg 100 μl van de bovengenoemde celsuspensie toe aan elke well van een 96-well plaat met ronde bodem (5 x 105 PBMC/well).
  4. Voeg 50 μl van de verdunde stimuli toe aan elke well. Het is mogelijk om twee verschillende stimuli toe te voegen, wat een volume van 200 μl oplevert. Als er slechts één stimulus nodig is, breng dan het volume aan met medium aan tot 200 μl.
  5. Incubeer de 96-well plaat gedurende de vereiste incubatieperiode bij 37 °C in een 5% CO2 incubator. Voor de meeste cytokinen zal een incubatie van 24 uur voldoende zijn.

6. Uitlezing van de stimulatie

  1. Centrifugeer na de incubatieperiode de 96-well plaat 5 min bij kamertemperatuur op 450 x g om de cellen onderin te verzamelen.
  2. Verzamel het supernatant (neem een maximaal volume van 180 μl) en bewaar dit voor een daaropvolgende cytokinenanalyse (-20 °C) of voor virusproductie (-80 °C).
  3. De gestimuleerde PBMC's in het pellet kunnen worden geanalyseerd via qPCR/Western blot door lysisbuffer toe te voegen, of alternatief kunnen de PBMC's worden gekleurd voor flowcytometrie-analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier beschreven kweek- en zuiveringsmethode voor HRSV A2 levert een opbrengst op tussen 2 x 107 en 2 x 108 FITC-50 gekwantificeerde infectieuze virusdeeltjes/ml. De resultaten van de microscopische analyse, waarbij FITC-gekleurde geïnfecteerde cellen werden geteld (resultaten niet getoond), werden vergeleken met de resultaten van kwantificatie via FACS (Figuur 1). Beide methoden resulteerden in vergelijkbare titers, hoewel de FACS-methode een veel lagere standaarddeviatie tussen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie demonstreren we dat infectie van PBMC met HRSV een snel en betrouwbaar modelsysteem is waarin inflammatoire paden kunnen worden bestudeerd. Om PBMC's te stimuleren, moet een HRSV-voorraad worden bereid en gekwantificeerd.

Meerdere cellijnen zijn gevoelig voor HRSV-infectie. Cellijnen die het meest worden gebruikt voor HRSV-kweek zijn HEp-2, HeLa en Vero-cellen. We raden echter af om Vero-cellen te gebruiken voor het kweken van HRSV omdat is aangetoond dat het kweken van HRSV in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Wij hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

RSV A2 werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Nederland). MV en GF worden ondersteund door het Virgo consortium, gefinancierd door het Nederlandse overheidsproject FES0908, en door het Netherlands Genomics Initiative (NGI) project nummer 050-060-452. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van het onderzoek, gegevensverzameling en -analyse, besluit tot publicatie, of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
PBSLonzaBE17-516FPBS zonder Ca2+ Mg2+ of fenol rood
HBSSInvitrogen14025-100HBSS, Calcium, Magnesium, geen Fenol Rood
DMEMInvitrogen31966-047DMEM, Hoge Glucose, GlutaMAX, Pyruvaat
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES
Reduced Serum Medium (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX
FCSGreiner Bio-oneFBS (Fetal Bovine Serum)
BSASigma AldrichA7030Albumine uit runder serum
P/SInvitrogen15140-122Penicilline-Streptomycine, vloeibaar
TrypsineInvitrogen25300-0540,05% Trypsine-EDTA (1x), Fenol Rood
HeLa cellenATCCCCL-2
A549 cellenATCCCCL-185
SucroseSigma AldrichS7903Sucrose BioXtra, ≥99,5%
IgG2 anti-muis-FITCBD Pharmingen555057Ms IgG2b K FITC isotype control
Anti-NP-RSV-FITCAbcamab25849Anti-Respiratory Syncytial Virus antilichaam [671] (FITC)
Dichtheidsgradiënt medium (Lymphoprep)Axis-Shield1114545
EDTA buizenBD Biosciences367525
AcetonMerck Millipore1000141000Aceton voor analyse
Materiaal
CentrifugebuizenBeckman Coulter326823Dunwandig, Polyallomer, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm
SureSpin 630 Rotor met 36 ml emmersSorvall79368Zwingende emmer titanium rotor
Sorvall WX80 UltracentrifugeSorvall46900
CB 150l CO2 IncubatorBinder

Referenties

  1. Nair, H., Nokes, D. J., et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 375, 1545-1555 (2010).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults. N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).
  3. Openshaw, P. J. Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).
  4. Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection. Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).
  5. Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).
  6. Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide. J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).
  7. Vissers, M., Remijn, T., et al. Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells. Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).
  8. Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein. Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).
  9. Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands. Vaccine. 30, 597-606 (2012).
  10. Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans. J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).
  11. Treuhaft, M. W., Beem, M. O. Defective interfering particles of respiratory syncytial virus. Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).
  12. Korns Johnson, D., Homann, D. Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry. PLoS One. 7 (5), e37337(2012).
  13. Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity. J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).
  14. Kimpen, J. L. Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).
  15. Wang, S. Z., Forsyth, K. D. The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection. Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).
  16. San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells. J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).
  17. Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10. Plos One. 8 (1), e53641(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RSV zuiveringultracentrifugatiedichtheidscentrifugatieflowcytometrieqPCR analysecytokuinexpressieimmuunresponsvirale infectie

Gerelateerde artikelen