In vivo 19 F MRI voor mobiele Tracking

Samenvatting

We beschrijven een algemeen protocol voor in vivo cell tracking met MRI in een muismodel met ex vivo gemerkte cellen. Een typische protocol voor mobiele etikettering, beeldaanwinst verwerking en kwantificering is inbegrepen.

Samenvatting

In vivo ¹⁹ laat F MRI kwantitatieve cell tracking zonder het gebruik van ioniserende straling. Het is een niet-invasieve techniek die kan worden toegepast op de mens. We beschrijven hier een algemeen protocol voor mobiele etikettering, beeldvorming, en beeldverwerking. De techniek is toepasbaar op verschillende soorten cellen en diermodellen, hoewel hier richten we ons op een typische muismodel voor het bijhouden muizen immuuncellen. De belangrijkste onderwerpen voor mobiele etikettering worden beschreven, omdat deze voor alle modellen relevant zijn. Ook worden verschillende beeldparameters genoemd, hoewel de details zullen verschillen afhankelijk van het MRI systeem en de specifieke configuratie. Ten slotte hebben we onder andere een beeldverwerking protocol voor kwantificering. Variaties voor deze, en andere delen van het protocol, worden beoordeeld in het hoofdstuk discussie. Op basis van de hier beschreven gedetailleerde procedure, moet de gebruiker het protocol aan te passen voor elk specifiek celtype, cellabel, diermodel, en imaging opstart. Merk op dat de pROTOCOL kan ook worden aangepast voor menselijk gebruik, zolang klinische beperkingen wordt voldaan.

Inleiding

In vivo cell tracking is essentieel voor de optimalisatie en monitoring van cellulaire therapieën ^1. Door de invasieve aard, weergave biedt uitstekende mogelijkheden om cellen in vivo te controleren. Magnetic Resonance Imaging (MRI) is onafhankelijk van ioniserende straling en zorgt voor een superieure imaging resolutie en intrinsieke wekedelencontrast. MRI-gebaseerde cell tracking is al klinisch gebruikt om dendritische cellen bij patiënten met melanoom ² volgen. Conventionele MRI wordt uitgevoerd op de ^1H kern, aanwezig in de mobiele water in de weefsels worden uitgevoerd. Het is ook mogelijk om MRI te voeren op andere actieve kernen, zoals ^{13C, 19F} en ²³ Na. Echter slechts ^19F MRI wordt toegepast om in vivo cell tracking omdat daarmee de hoogste gevoeligheid na ¹ H. Aangezien MRI detecteerbaar endogeen ^19F in weefsels maakt hoge signaal selectiviteit voor dedetectie van exogene ¹⁹ F contrastmiddelen en maakt kwantificering van fluorconcentratie rechtstreeks van de beeldgegevens. Voor een gedetailleerde bespreking van ¹⁹ F MRI, zie ^3-5. Een belangrijk probleem met ^19F MRI is de noodzaak om en optimaliseren geschikte ^19F cel etiketten, hoewel verscheidene labels ontwikkeld met een trend naar multimodale middelen ^6.

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op studies door onze groep ^7-9, inclusief de eerste artikelen die in vivo kwantitatief ^19F MRI-gebaseerde mobiele ^10,11 volgen beschreven. De algemene procedure van cell tracking met ^19F MRI wordt samengevat in figuur 1. We beschrijven een algemeen protocol voor de etikettering en de beeldvorming van dendritische cellen (DC's) met behulp van een op maat gemaakte perfluorocarbon contrastmiddel ^8. De beeldvormingstechniek is algemeen toepasbaar voor verschillende celtypen, etiketten en diermodellen. Deceltype en diermodel beschreven dienen slechts als voorbeeld, en dus we geen details over de cel isolatie en etikettering, maar zich op de beeldvormingstechniek. Wijzigingen zullen nodig zijn voor elk label, celtype, diermodel, en imaging worden ingesteld, en deze zijn te vinden in de literatuur of moet worden geoptimaliseerd door de onderzoekers. Enkele algemene wijzigingen in de discussie.

Protocol

Opmerking: Alle experimenten en procedures waarbij dieren moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante ethische richtlijnen uitgevoerd en conform met standaard verzorging van dieren en humane eisen.

1. Cell Labeling (Standard Protocol met co-incubatie)

1. Voeg ¹⁹ F label ⁸ onrijpe DCs bij een concentratie van 4 mg/10 ⁶ cellen (in 2 ml medium). Roer voorzichtig te mengen.
2. Incubeer de cellen met het label voor 3 dagen voor het rijpen en het oogsten van de DC's.
3. Verzamel de DC's en verwijder overtollig label door wassen minstens 3x in PBS. Tel de cellen.
4. Resuspendeer in een klein volume PBS voor injectie of verdere tests.

Opmerking: Dit protocol relevant zijn voor deze specifieke DCs en label. De procedure werd geoptimaliseerd in een andere publicatie ⁸ en omvatte hier alleen de stappen om een monster te bereiden beeld, aangezien de nadruk van dit protocol is de beeldvorming. Hlingen, het protocol voor isolatie, cultuur en etikettering van een specifiek celtype zal ofwel moeten worden gevonden in de literatuur of geoptimaliseerd door de onderzoeker. Een overzicht van alle andere ^19F labels die zijn gebruikt in de literatuur elders ⁶ gepresenteerd.

2. Bepaling van ¹⁹ V / cel met behulp van ¹⁹ F-NMR

1. Plaats een bekend aantal gelabelde cellen (typisch meer dan 0,5 x 10 ^6, of een nummer dat resulteert in voldoende signaal) in een NMR-buis.
2. Voeg 10 ul van 5% trifluorazijnzuur (TFA). Indien de resonantiefrequentie van TFA ongeschikt vanwege overlap met het label, een alternatieve oplosbare verbinding, bij voorkeur met een ¹⁹ F resonantie.
3. Het monster wordt in een NMR-spectrometer en het verkrijgen van de ¹⁹ F-spectrum. Zorg ervoor dat de bandbreedte voldoende is voor zowel de TFA (referentie) en de agent.

Opmerking: De TR moet lang genoeg zijn voor f zijnull ontspanning van de referentie en het monster draait (ongeveer 5 keer _T1 relaxatietijd van de langste T ₁ component in de buis, meestal TR ~ 5-8 sec). Sommige spectrometers vereisen D ₂ O voor een frequentie signaal van het slot. Een standaard ¹⁹ F spectrum is voldoende. Uitgebreide middeling of hoger aantal cellen is noodzakelijk wanneer cel opname van het label is slecht of als mobiele nummers zijn laag. Het spectrum moet in het midden tussen de referentie en relevante label pieken, tenzij correcties worden aangebracht voor gedeeltelijke excitatie.

4. Bereken de relatieve oppervlakken onder de pieken van de referentie en het monster (of de belangrijkste piek van het monster), en berekent vervolgens de gemiddelde aantal ¹⁹ F's / cel in de steekproef.

Opmerking: Het hele proces moet worden herhaald en gemiddeld uitvoerig genoeg om statistische significantie te bereiken. Dit kan ook worden gedaan met behulp van spectroscopie direct aan de MRI-scanner. However, mee dat deze procedure blijkt dat alleen de gemiddelde ¹⁹ F laden voor een groot aantal cellen, niet de variabiliteit tussen cellen. Controle uniformiteit van celopname vereist de aanwezigheid van een fluorescerend onderdeel op de ^19F middel, zodat celopname kan worden geanalyseerd middels microscopie of flowcytometrie.

3. Overwegingen voor Experimental Design - celinjectie

Vanwege de relatief lage sensitiviteit van ^19F MRI voor cell tracking, een diermodel waarbij de cellen gelokaliseerd in grote aantallen is noodzakelijk voor een succesvolle in vivo beeldvorming. Typische gevoeligheid waarden variëren van 1,000-100,000 cells/voxel/1 uur scantijd ^6, met een mobiele lading in het bereik van 10 ¹¹ -10 ¹³ fluoratomen.

Het aantal en beeldvorming sessies moet zorgvuldig worden gepland, omdat dit beïnvloedt de keuze van verdoving. Merk op dat isofluraan niet suitabl zijne voor ^19F MRI indien ^19F resonantiefrequentie van isofluraan dicht bij die van het etiket gebruikte verbinding. isofluraan kan toch geschikt zijn wanneer het beeldvormende sessies zijn kort genoeg om significante opbouw voorkomen. Verscheidene alternatieve anesthetica zijn in de literatuur ^10,11; voorbeeld is in de beeldvormingstechniek. Anesthetica kunnen moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende muizenstammen en ziektemodellen.

4. Ontwerp van een externe ¹⁹ V Reference

1. Gebruik een externe verwijzing met een bekend gehalte van ¹⁹ V signaal voor kwantificering ^12. Kies de signaalintensiteit van de verwijzing ruwweg vergelijkbaar met die verwacht van het subject zijn.

Opmerking: In het algemeen is het eenvoudigste als de referentieverbinding is hetzelfde als de cel label, de relaxatieparameters passen. Als spectroscopische sequenties of sequenties zonder ruimtelijke lokalisatie worden toegepast dan acompound met een verschillende chemische verschuiving nodig zijn.

2. Wijzig de plaatsing, grootte en vorm van de referentie nodig, afhankelijk van het gebied van belang (ROI). Opmerking: Het is over het algemeen het gemakkelijkst om buizen te gebruiken met een gelijke dwarsdoorsnede voor de verwijzing.

5. Imaging and Mouse Voorbereiding

1. Verdun handel verkrijgbaar ketamine en xylazine 01:10 v / v met fysiologische zoutoplossing om voorraadoplossingen van 10 mg / ml ketamine en 2 mg / ml xylazine verkregen.
2. Zet de verwarming in de scanner (meestal warme lucht) om ervoor te zorgen de boring zal warm zijn voordat de muis wordt afgebeeld.
3. Injecteer 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine intraperitoneale anesthesie initiëren. Opmerking: Deze doses werden getest CD1 (ICR) en NU-Foxn1 ^nu 8 weken oude mannelijke muizen. Andere stammen moet lichtjes verschillende doses die moeten worden geoptimaliseerd in een afzonderlijk experiment. Deze dosis wordt de muis verdoofd houden voor eenbout 45 min. Opmerking: De diepte van de anesthesie is meestal voldoende als het dier vertoont geen reactie op een voet knijpen.
4. Eenmaal verdoofd, plaats het dier in een dier cradle en immobiliseren om beweging tijdens MRI voorkomen. Indien nodig, de positie van de externe verwijzing naast het dier. Zowel de referentie en de ROI (verwachte locatie van de geïnjecteerde cellen) moet in het midden van de spoel. Het dier moet worden aangesloten op de temperatuur en de ademhaling controle voor fysiologische monitoring tijdens het scannen.
5. Bedek de ogen van de muis met steriele oogzalf om uitdroging te voorkomen tijdens lange beeldvorming sessies.
6. Als de beeldvorming tijd meer dan 40 minuten, bereiden extra katheters voor injectie van extra ketamine / xylazine voordat het dier kan wakker worden. Positie twee afzonderlijke subcutane katheters met de werkende oplossingen van ketamine en xylazine. Met deze katheter de muis geven een extra 2,5 mg ketamine elke 20 minuten na de eerste 40 min. Eventueel anesthesie verder verlengd door injectie van additionele 0,5 mg xylazine door de katheter 100 min. na de eerste injectie. In alle gevallen moet experimenteel niet meer bedraagt ​​dan 3 uur, behalve misschien onder terminale narcose.
7. Zorg ervoor dat de muis direct na de eerste injectie wordt verwarmd en gehandhaafd op 37 ° C lichaamstemperatuur. Met dit protocol, <80% bloedoxygenatie werd ontdekt onder atmosfeer lucht laten ademen. Om te voorkomen bijwerkingen van de verlaagde bloed oxygenatie, gebruik 100% zuurstof (0,3 L / min). Lichaamstemperatuur en ademhaling moet worden gecontroleerd in het gehele experiment en tot volledig herstel van het dier. Merk op dat de spontane ademhaling onder ketamine / xylazine is zeer hoog (200-250/min). Onregelmatigheden in de ademhaling, in plaats van de ademhaling, kan aangeven dat een hogere dosis nodig is om een ​​geschikte toestand van verdoving te handhaven. De muis zal spontaan ontwaken binnen 20-30 min after de laatste dosis verdovingsmiddel.

Opmerking: cell tracking, moet beeld is hetzelfde dier meer dan eens. In dat geval moet de beeldvorming sessies worden gepland met aandacht voor de tijd die nodig is voor de goedkeuring van anesthesie van het systeem en het gebruik van dieren richtlijnen van het instituut.

6. Imaging

¹ H aanpassingen en imaging

1. Plaats het dier in de scanner, zodat de ROI is in de isocentrum met een lage resolutie, anatomische scan met verschillende slice oriëntaties (een localizer).
2. Gebruik de reguliere shimming protocol op ¹ H, bijvoorbeeld een wereldwijde shim op het hele volume in de spoel.
3. Pas de referentiepuls waarderingsverschil (RW), dwz het zendvermogen gemeten in dB voor een 1 msec Hermite 90 ° RF puls, met behulp van de aanpassing scan door de verkoper.

Opmerking: Deze aanpassing zalafhankelijk van de aard van RF spoel en is essentieel voor ^19F MRI aangezien het signaal van de ^19F frequentie meestal te laag voor directe aanpassingen. Bijgevolg moet een schatting van de RG worden gemaakt van metingen op de ^1H signaal. Voor RF transmissie met een oppervlaktespoel, moet de ^1H RG aangepast om een vlak evenwijdig aan de spoel door het deel van belang voor een volume spoel met homogene B ₁ profiel de exacte instelling van de correctie minder belangrijk.

4. Het volgende protocol van ¹⁹ F referentiepuls versterkingsinstelling werkt alleen als beide ^1H en ¹⁹ F RF-transmissie met hetzelfde (enkel of dubbel-tuned) RF-spoel wordt uitgevoerd. Voor een dergelijke beeldvorming setup, moet de spoel profiel (B ₁ zend veld) op ¹ H evenredig met de ¹⁹ F spoel profiel, wanneer een vaste RG wordt toegepast, dat wil zeggen B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} met een proportionality constante C.
   1. Om te bevestigen dat spoel profielen evenredig zijn voor een specifieke opstelling, het verwerven van een ^1H en een ¹⁹ F flip hoek kaart (zie volgende paragraaf op B ₁ correctie) op een buis met een sterk geconcentreerde ¹⁹ V, bijv. TFA in water (1:1 v / v) met behulp van identieke velden-of-view (EPB), vooraf (figuur 3).
   2. Met dezelfde RG, controleren of beide kaarten zijn identiek behalve voor de globale factor C.
   3. Zodra de ^1H RG wordt bepaald, rekening mee dat dit aantal naar beneden.
5. Voer een conventionele ^1H MRI-scan als een anatomische referentie voor de ¹⁹ F beeldvorming. Afstemmen van het systeem om de ¹⁹ F frequentie van de cel marker en het uitvoeren van een ¹⁹ F MR scannen. Idealiter zou de ¹⁹ F MRI-scan hebben dezelfde veld-of-view en slice selectie als de ^1H MRI, maar meestal met een lagere resolutie. Het dier kan zodra de verbeelding nieuw leven worden ingeblazenng voltooid. Beeldverwerking kan dan offline worden uitgevoerd.
6. Bepaal de ¹⁹ F RG via de relatie dB _19F = dB _1H -20 * log ₁₀ (C). Schat de ¹⁹ F-agent frequentie in een aparte in-vitro experiment.

Opmerking: In vivo, kan de exacte frequentie enigszins afwijken van experiment om te experimenteren door verschillende shimming voorwaarden. Chemische verschuiving artefacten de exacte frequentie moet daarom in elk experiment worden bepaald door ¹⁹ F MRS, indien mogelijk, te voorkomen. Een typische scan zeer laag ¹⁹ V signaal zou global (puls-verwerven) spectroscopie (TR = 200 msec, NEX = 3000, TA = 10 min, BW = 50 kHz) zijn. NEX, aldus TA, kan drastisch worden verminderd voor hoge ¹⁹ V signaal. De ^19F middel frequentie wordt bepaald uit het spectrum na Fouriertransformatie en fasecorrectie. NEX verwijst naar het aantal excitaties, TA is de acquisitietijd en BW is debandbreedte.

Opmerking: Typisch imaging parameters ⁹ op een 11.7T/16 cm toegewijde dier scanner zijn: een anatomische ^1H beeldvorming scan met een turbo spin-echo (TSE) sequentie met TR / effectieve echo tijd (TE _eff) = 2200 msec/42.8 msec, 8 echo's per excitatie, NEX = 2, 10 opeenvolgende, 1 mm dikke plakken, FOV = 1.92 x 1.92 cm ^2, 128 x 128 matrix, dat wil zeggen een resolutie van 150 x 150 x 1000 micrometer ^3, TA = 1 min, BW = 50 kHz en een lineaire fase coderingsschema. werden ¹⁹ F beelden die met dezelfde sequentie en bijpassende geometrie, maar bij lagere in-plane resolutie en lagere BW (NEX = 256, 48 x 48 matrix, dat wil zeggen een resolutie van 400 x 400 x 1000 um ^3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B ₁ correctie
   Met behulp van een RF-spoel met inhomogene B ₁ profiel, bijvoorbeeld een oppervlakte spoel, kan belemmeren kwantificering van ¹⁹ F-gegevens, aangezien het signaal is afhankelijkniet alleen ^19F concentratie ging van de afstand van de spoel. Schaf een B ₁ kaart op de ^1H kanaal om achteraf correcte ¹⁹ F data. Hiertoe moeten ^1H en ^19F spoel profielen identiek, behalve de evenredigheidsfactor C en voldoende ^1H achtergrond signaal wordt in gebieden van ¹⁹ F. Een voorbeeld protocol voor de correctie van een ¹⁹ F spin-echo sequentie wordt gepresenteerd, met behulp van een single-tuned Tx / Rx oppervlaktespoel tunable zowel ^1H en ¹⁹ F en met proportionele B ₁ profielen ^13.
   1. Schaf een ^1H flip hoek kaart met de twee flip-hoek methode ^14. Verwerven van een gradiënt echo scan met zeer lange TR (> 3 maal ¹ HT ₁₎ met een geschatte flip hoek van iets minder dan 90 °. Dicht bij de spoel. Schaf een tweede gradiënt echo scannen met een RG = dB _1H -6, dat wil zeggen twee keer de fliphoek van de eerste scan.
   2. Bereken het ^1H kantelhoek, α, bij voxel (x, y, z) via het signaal intensiteiten (SI) van de eerste en tweede gradiënt echo scans: α (x, y, z) = Arcos (SI _{GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^14. De ^19F kantelhoek identiek (behalve de factor 1 / C) door proportionele B ₁ profielen. Volgens Faraday principe van wederkerigheid ^15, de demping van ¹⁹ F signaalintensiteit van een spin-echo sequentie (excitatie flip hoek α, heroriënteren flip hoek 2α) tijdens de signaalontvangst is att _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). De verzwakking als gevolg van imperfecte excitatie att _Tx (x, y, z) ~ sin ³ (α (x, y, z)) ^16. De algehele verzwakking wordt geschreven als att = attRx * attTx = α * sin ³ (α) / 90 °. Merk op dat het genormaliseerd tot 1 bij perfecte 90 ° / 180 ° excitatie / heroriëntering kantelhoek. De B ₁ gecorrigeerde19F beeldsignaal intensiteiten SI _{19F, corr} berekend via SI _{19F, corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / att (x, y, z).
   3. Om signaalintensiteiten te vergelijken van verschillende experimenten, plaats een referentiebuis met gedefinieerde ^19F concentratie in het gezichtsveld, en het normaliseren SI _{19F, corr} het gemiddelde signaal in de referentie.

Opmerking: Andere ¹ HB ₁ / flip hoek mapping methoden kunnen worden gebruikt en verschillende ¹⁹ V pulssequenties vereisen aanpassingen van att _{Tx, 19F.} Elke vorm van B1 correctie regeling zal extra fout introduceren in de cel kwantificering procedure. Als nauwkeurige cel kwantificering is het belangrijkste uitgangspunt, kan een RF spoel met homogene B1 profiel worden gebruikt om dit deel van het protocol te omzeilen.

7. Beeldverwerking

1. Het maken van ¹ H en ¹⁹ F overlay beelden
   1. De beeldgegevens exporterenvoor de laatste ¹ H en ¹⁹ F magnitude beelden van de scanner.
   2. Open de bestanden in een beeldbewerkingsprogramma, zoals ImageJ (freeware, NIH).
   3. Voeren beeldaanpassingen als nodig (bijsnijden, helderheid, contrast) houden van de aanpassingen hetzelfde voor alle afbeeldingen. De ¹⁹ F beelden zal doorgaans moeten worden opgeschaald naar een hogere resolutie aan de overeenkomstige ^1H beelden overeenkomen.
   4. Render de ¹⁹ F afbeeldingen in valse kleuren (selecteer een andere look-up tafel, onder het menu 'beeld' in Afbeelding J) en dan overlay op de overeenkomstige ^1H afbeeldingen in om het signaal te lokaliseren.
2. ¹⁹ F Kwantificering
   1. Selecteer een ¹⁹ F afbeelding (image magnitude) de desbetreffende cellen en de referentie zichtbaar.
   2. In een programma zoals Image J, trekken ROI over de relevante cellen, de referentie en een gebied buiten het onderwerp (lawaai).
   3. Gebruik de opdracht Analyserenen vervolgens Meet (of gewoon Ctrl + M) naar het gemiddelde pixelintensiteit berekenen binnen deze regio's, en hun omgeving. Laat S (cellen) verwijzen naar de gemiddelde pixelintensiteit het ROI over de cellen. Vermenigvuldig dat met het volume (= oppervlakte x slice dikte) om het totale signaal te berekenen.
   4. Bereken de SNR, bijvoorbeeld met de formule SNR = 0,65 x S (cellen) / σ, waarbij σ de standaardafwijking van pixel intensiteit per ROI buiten het monster dat vrij is van chemische verschuiving artefact (typisch in de achtergrond lucht) ^17. Indien de SNR onder 5 kan een correctie voor het signaal vanwege het geluid nodig en kan worden uitgevoerd zoals elders ^{11 10} beschreven.
   5. Anders berekent de totale hoeveelheid ¹⁹ F die het signaal van het ROI van de referentiewaarde door het oppervlak van de referentie in het segment van slicedikte (om het volume te berekenen) door de concentratie van ¹⁹ F in de referentie vermenigvuldigen,die bekend en homogeen verondersteld te zijn.
   6. Vermenigvuldig die waarde door het totale signaal in het ROI over de cellen, gedeeld door het totale signaal via verwijzing naar de hoeveelheid ^19F berekenen de cellen.
   7. Bereken het aantal cellen door te delen dat getal met de waarde ¹⁹ F / cel, die werd berekend in punt 2.

Resultaten

Hier tonen we de typische resultaten voor een protocol waarbij de overdracht van ^{19F-gelabelde} cellen homing een drainerende lymfeklier. Figuur 2 toont een ^{19F-NMR-spectrum} van 10 ⁶ gemerkte cellen met een TFA referentie. De beeldvorming opstart werd uitgevoerd zoals beschreven in het protocol (Figuur 3). Voor de in vivo beeldvorming, gebruikten we een referentie uit een afgedichte cilinder met hetzelfde etiket voor de cellen geplaatst tussen de...

Discussie

Het protocol hier beschreven wordt de algemene procedure voor in vivo ¹⁹ F MRI cell tracking. Ondanks de beschreven co-incubatie methode, zijn er verschillende protocollen voor het labelen van cellen met een ^19F middel. Echter, de co-incubatie meest gebruikt en kan verder worden geoptimaliseerd bijvoorbeeld door toevoeging van transfectie agentia ^6. De werkelijke cel labeling protocol afhankelijk van het celtype. Enige sleutel etikettering stappen worden beschreven in h...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	oogzalf
Materiaalnaam
MRI-scanner	Bruker Biospec
NMR-spectrometer	Bruker Biospec