Methodenartikel

Covalente binding van BMP-2 op oppervlakken met een Zelf-geassembleerde monolaag Aanpak

DOI:

10.3791/50842

⸱

26 augustus 2013

 ,  , 
1Department of Biophysical Chemistry, Institute for Physical Chemistry, University of Heidelberg, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems at Stuttgart

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een werkwijze voor het bewerkstelligen van een efficiënte immobilisatie van BMP-2 op oppervlakken. Onze benadering is gebaseerd op de vorming van een zelf samengestelde monolaag op de covalente binding van BMP-2 via zijn vrije amine residuen bereiken. Deze methode is een nuttig hulpmiddel om signalering te studeren aan het celmembraan.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is een groeifactor ingebed in de extracellulaire matrix van botweefsel. BMP-2 fungeert als trekker van mesenchymale celdifferentiatie in osteoblasten, waardoor het stimuleren van genezing en de novo botvorming. Het klinisch gebruik van recombinant humaan BMP-2 (rhBMP-2) samen met steigers is opgeheven recente controverses, gebaseerd op de wijze van presentatie en de hoeveelheid te leveren. De hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige en efficiënte manier om BMP-2 te leveren in vitro studies op cellen. We beschrijven hoe je een zelf-geassembleerde monolaag bestaande uit een heterobifunctionele linker vormen, en tonen de daaropvolgende binding stap om covalente immobilisatie van rhBMP-2 te verkrijgen. Met deze benadering is het mogelijk om een ​​aanhoudende presentatie van BMP-2 met behoud van de biologische activiteit van het eiwit. In feite, het oppervlak immobilisatie van BMP-2 kan gerichte onderzoek door voorkoming onspecifieke advertentiesorption, terwijl het verminderen van de hoeveelheid groeifactor en, met name, belemmeren ongecontroleerd vrijkomen van het oppervlak. Zowel korte en lange termijn signalering gebeurtenissen veroorzaakt door BMP-2 plaatsvinden wanneer cellen worden blootgesteld aan oppervlakken presenteren covalent geïmmobiliseerd rhBMP-2, waardoor deze benadering geschikt in vitro naar celreacties op BMP-2 stimulatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is een lid van de transformerende groeifactor (TGF-β) familie en fungeert als inductor van de novo botvorming en regulator van verschillende weefsels tijdens de embryonale ontwikkeling en volwassen homeostase 1-3. Elke monomeer van de homodimeer biologisch actieve BMP-2-eiwit bevat een "cysteïne knoop" motief, die sterk geconserveerd in alle BMP 4. Zes van de zeven cysteïneresten vormen intramoleculaire disulfide bindingen die elk monomeer stabiliseren, terwijl de zevende cysteine ​​betrokken bij dimerisatie, die een intermoleculaire binding tussen de twee monomeren 5,6. Deze zeer geconserveerde cysteïne knoop wordt de driedimensionale structuur van het eiwit BMP-2 en bepaalt de unieke eigenschappen, zoals resistentie tegen hitte, samenstelling en zure pH 7-9. BMP-2 bindt aan serine / threonine kinase transmembrane receptoren, waardoor signaaltransductie induceren 10-12. Afhankelijk van de wijze van receptor oligomerisatie worden verschillende signaalwegen geactiveerd: een Smad-onafhankelijke signalering cascade leidt tot alkalische fosfatase-inductie via p38 signalering, terwijl een Smad-afhankelijke route geactiveerd door fosforylatie van de receptor resulteert in Smad complexe nucleaire translocatie en activering van transcriptie van specifieke doelgenen, zoals de remmer van differentiatie (Id) 12-14.

In bone, BMP-2 induceert de differentiatie van mesenchymale stamcellen in osteoblasten stimuleren zo de genezing en de novo botvorming. Momenteel, recombinant tot expressie BMP-2 is klinisch toegepast om de genezing van gebroken websites te verbeteren. Een gemeenschappelijke strategie botweefsel is het gebruik van injecteerbare groeifactoren, die minder invasief dan de lokale systemen. In vivo studies en klinische toepassingen hebben aangetoond dat de korte biologische halfwaardetijd, niet-specifieke localization en snelle lokale klaring van BMP-2 kan leiden tot verschillende lokale, buitenbaarmoederlijke en systemische problemen 15. Tot een effectieve presentatie, het insluiten of immobilisatie van BMP-2 in of op grondstoffen te verkrijgen noodzakelijk voor de lokale en langdurige afgifte op de doelplaats. Langdurige afgifte kan worden bereikt met niet-covalente retentie benaderingen, zoals fysieke insluiting, adsorptie of ion complexering 16. Het is echter bekend dat niet-specifieke adsorptie van eiwitten aan oppervlakken leidt tot denaturatie van de moleculen 17. Voor de covalente binding van groeifactoren, hebben verschillende soorten dragers zijn ontwikkeld in het afgelopen decennium. Het gebruik van bifunctionele koppeling moleculen die amino-of carboxylgroepen van het eiwit gericht is bijvoorbeeld een type aanpak die niet noodzakelijkerwijs vereist eiwitmodificatie zijn immobilisatie bereiken. In feite, terwijl eiwitmodificatie biedt het voordeel van het controleren eiwit oriëntatie,de introductie van kunstmatige domeinen peptide tags en ​​plaatsspecifieke ketens kunnen veranderen de biologische activiteit van groeifactoren 17. Aldus denaturatie omzeilen door de wisselwerking met het dragermateriaal, oppervlakken worden vooraf gefunctionaliseerd, bijvoorbeeld met een zelf-geassembleerde monolaag (SAM) van een verbindende molecule, gevolgd door koppeling van de gewenste factor 18. We hebben een SAM-gebaseerde benadering covalent immobiliseren BMP-2 op een oppervlak doelwit zijn vrije amine residuen en hebben aangetoond dat het geïmmobiliseerde eiwit behoudt zowel de korte en lange termijn biologische activiteit 19. Dit protocol is een eenvoudige en efficiënte manier om BMP-2 te leveren aan cellen in vitro naar de mechanismen die optreden met de celmembraan en reguleren intracellulaire signalering verantwoordelijk voor osteogene signalering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synthese van 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MU-NHS)

  1. Voeg druppelsgewijs een oplossing van 500 mg N-hydroxysuccinimide en 30 mg 4 - (dimethylamino) pyridine in 10 ml aceton (pa) tot 1 g 11-mercaptoundecanoic zuur in 40 ml dichloormethaan (pa) bij kamertemperatuur (RT).
  2. Koel het reactiemengsel tot 0 ° C en voeg druppelsgewijs 1,1 g N, N'-dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml dichloormethaan (onder stikstofatmosfeer). Houd de reactie bij lage temperatuur gedurende 1 uur en vervolgens roer bij kamertemperatuur geroerd.
  3. Filtreer het precipitaat en drogen onder verminderde druk. Zuiver het product door flitschromatografie met petroleum benzeen en ethylacetaat (pa) in een verhouding van 01:01.

2. Bereiding van goud Homogene lagen

  1. Schoon dekglaasjes nauwkeurig doekjes en ultrasone trillingen ze 5 min in een oplossing die een 1:1 mengsel van ethylacetaat (pa) en methanol (pa). Rinse substraten met methanol en drogen onder een stikstofstroom.
  2. Plaats de schone substraten in het sputter coating apparaat. Evacueren de kamer. Verwijder de bovenste chroomoxide laag van chroom doel door sputteren voor 60 sec. Plaats de monsters onder de metalen balk en smeer ze met een 10 nm chroomlaag, gevolgd door het coaten met een 40 nm goudlaag.

3. Oppervlak Immobilisatie van BMP-2

  1. Los MU-NHS in N, N-dimethlyformamide (DMF) tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 1 mM en incubeer goud substraten in de MU-NHS oplossing bij kamertemperatuur gedurende 4 uur onder stikstofatmosfeer.
  2. Sonicaat oppervlakken in DMF gedurende 2 minuten, spoel met DMF en MeOH en drogen onder een stikstofstroom.
  3. Bereid een voorraadoplossing van rhBMP-2 in steriele 4 mM HCl met een concentratie van 100 ug / ml (opslag fracties bij -80 ° C). Voor werkende verdunningen (3,5 ug / ml) Verdun de voorraadoplossing in PBS / NaCl (PBS bevattende 1 M NaCl) en eendjust tot pH 8,5 onmiddellijk voor gebruik.
  4. Incubeer gefunctionaliseerde oppervlakken MU-NHS in de rhBMP-2 werkoplossing bij 4 ° C overnacht. Verwijder supernatant incubatie. Sonicaat oppervlakken in PBS / NaCl gedurende 2 minuten en was 3x met steriele PBS / NaCl.

4. Oppervlaktekarakterisering

  1. Om niet-specifieke adsorptie van antilichaam blokkeren, incubeer oppervlakken met een 5% BSA (w / v) in PBS oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie met een anti-BMP-2-antilichaam (1:100 in 1% (w / v ) BSA / PBS oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was oppervlakken tweemaal met PBS en ultrasone trillingen gedurende 30 sec.
  2. Incubeer substraten met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:1000 in 1% (w / v) BSA / PBS oplossing) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, vervolgens tweemaal wassen met PBS.
  3. Gebruik Ampliflu Red test om HRP enzymatische activiteit te meten bij 570 nm met een plaat lezer.

5. Analyse van biologische activiteit

  1. Seed 1 x 10 5 muis C2C12 myoblasts per putje in 6-well plates in kweekmedium, bestaande uit een hoog glucose DMEM dat pyruvaat gesupplementeerd met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 ° C / 5% CO2.
  2. Verhongeren cellen in serumvrij DMEM gedurende 3-5 uur vóór het zaaien op de oppervlakken voorzien van geïmmobiliseerde BMP-2.
  3. Voor het onderzoek naar de korte termijn signalering inductie, vervang het medium door 200 ul vers serum-vrij DMEM en plaats de geïmmobiliseerde BMP-2 vlakken boven de cellen. De ondergrond moet met fijne punt pincet worden behandeld om te voorkomen krassen.
  4. Verwijder voorzichtig oppervlakken en zuig het medium met een pipet, was de cellen tweemaal met PBS. Overgaan tot analyse van cel responsen.
  5. Voor de analyse van langdurige biologische activiteit, cellaag op oppervlakken en kweken ervan bij 37 ° C / 5% CO 2 bij lage serum (2% FBS) gedurende zes dagen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In onze opstelling, werd goud gekozen als hulpstof omdat het zorgt voor een biologisch niet-specifieke, maar chemisch afstembare systeem. Bovendien kan de toepassing van zelf-assemblerende monolagen kleven veel voordelen: SAMs spontaan absorberen via hun "head-groepen" metalen en vorm monolagen met weinig defecten, terwijl hun functionele eindgroepen verder kan worden gemodificeerd. Aldus verschaffen zij een platform om de eigenschappen van de interface kunnen afstemmen op een gecontroleerde maar zeer flexibel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we de bereiding van oppervlak gefunctionaliseerd met bioactieve rhBMP-2. Deze benadering omvat twee stappen: 1) de initiële vorming van een zelf-assemblerende monolaag (SAM) van een bifunctionele linker aan het gouden oppervlak, 2) covalente immobilisatie van het rhBMP-2-eiwit. In eerdere werk, we gevalideerde de effectieve binding van de bifunctionele linker en de groeifactor, en toonde aan dat het oppervlak geïmmobiliseerd rhBMP-2 behoudt zijn biologische activiteit 19. De bioact...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken prof. dr. JP Spatz (Department of Biofysische Chemie, Universiteit van Heidelberg en het ministerie van nieuwe materialen en Biosystems, Max Planck Institute for Intelligent Systems, Stuttgart) voor zijn vriendelijke ondersteuning. De financiële steun van het Max-Planck-Gesellschaft en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 naar EAC-A.) Zijn ook sterk erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
N-hydroxysuccinimideSigma-Aldrich130672 
4-(dimethylamino)pyridinSigma-Aldrich522805 
AcetonAppliChemA2282 
11-mercaptoundecaanzuurSigma-Aldrich674427 
DichloormethaanMerck106050 
N,N'-dicyclohexylcarbodiimideSigma-AldrichD80002 
PetroleumbenzeenMerck 
GlasdekselsCarl RothM 875 
EthylacetaatAppliChemA3550 
MethanolCarl Roth4627 
N,N-dimethylformamideCarl RothT921 
rhBMP-2R&D Systems355-BMCarrier-free; expressed in E.coli
PBSPAAH15-002 
NaClCarl RothHN00.2 
Poly(dimethyl siloxaan) (PDMS)Dow Corning 
Sylgard 184 siliconelastomeerkitDow Corning 
Anti-rhBMP-2SigmaB9553 
Geitenanti-muis IgG-HRPSanta Cruzsc-2005Secundair antilichaam
Ampliflu Red assaySigma90101 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), vloeibaarGibco41966Hoge glucose
Fetaal bovien serum (FBS)SigmaF7524Steriel gefilterd, celkweek getest
Pen/StrepGibco15140 
Trypsine 0,05% (1x) met EDTA 4NaGibco25300 
Glycine (0,1 M)Riedel-de Haën33226 
IGEPAL CA-630 (1%)SigmaI8896Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesiumchloride (MgCl2)(1 mM)Carl RothHNO3.2 
Zinkchloride (ZnCl2) (1 mM)Carl Roth3533.1 
p-nitrofenylfosfaat (pNPP)SigmaS0942Fosfatase substraat
Anti-myosine zware keten (MHC)Developmental Studies Hybridoma Bank, Universiteit van IowaMF20Monoklonaal antilichaam
Alexa Fluor 488 Geitenanti-muis IgGInvitrogenA11001 
DAPISigmaD9542 
Apparatuur
Ultrasoonbad (Sonorex Super RK 102H), Frequentie 35 kHzBANDELIN electronic GmbH Co. KG 
MED 020 SputteringsysteemBAL-TEC AGCoatvoorwaarden
Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate readerTecan 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9(2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BMP 2 Covalent BindingSelf assembled MonolayerGold Substrate PreparationM U N H S LinkerBMP 2 ImmobilizationAntibody Binding AssaySMAD 1 5 8 PhosphorylationAlkaline Phosphatase ActivityMyosin Heavy Chain StainingFluorescence Microscopy

Gerelateerde artikelen