Methodenartikel

Procedures voor het identificeren van Besmettelijke Prions na passage door het spijsverteringsstelsel van een vogelsoort

DOI:

10.3791/50853

⸱

6 november 2013

 ,  ,  , 
1Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, USDA

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aaseters hebben potentieel om besmettelijke overdraagbare spongiforme encefalopathie prionen translokeren in hun uitwerpselen te ziektevrije gebieden. We detail methoden die worden gebruikt om te bepalen of de muis aangepast scrapie prionen infectieus blijven na passage al is het spijsverteringskanaal van de Amerikaanse kraaien (Corvus brachyrhynchos), een gemeenschappelijke consument van dode dieren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infectieuze prion (PrP Res) materiaal is waarschijnlijk de oorzaak van fatale, neurodegeneratieve overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE) ziekten 1. Overdracht van TSE ziekten, zoals chronische wasting disease (CWD), wordt geacht te zijn van dier tot dier 2,3 en uit omgevingsbronnen 4-6. Aaseters en carnivoren hebben potentieel om PrP Res materiaal translocatie door de consumptie en de uitscheiding van CWD-besmette kadavers. Recent werk heeft passage van PrP Res materiaal gedocumenteerd door het spijsverteringsstelsel van de Amerikaanse kraaien (Corvus brachyrhynchos), een gemeenschappelijke Noord-Amerikaanse scavenger 7.

We beschrijven procedures die gebruikt worden om de doorgang van PrP Res materiaal documenteren door Amerikaanse kraaien. Kraaien werden gavaged met RML-stam-muis aangepast scrapie en hun uitwerpselen werden verzameld 4 uur na maagsonde. Crow ontlasting werden vervolgens samengevoegd en intraperitoneaal geïnjecteerdC57BL / 6 muizen. Muizen werden dagelijks gecontroleerd totdat ze uitgedrukt klinische symptomen van muis scrapie en werden daarna gedood. Asymptomatische muizen werden gevolgd tot 365 dagen na de inenting. Western blot analyse werd uitgevoerd om ziektestatus bevestigen. Resultaten bleek dat prionen infectieus blijven na een reis door het spijsverteringsstelsel van kraaien en aanwezig in de ontlasting zijn, waardoor de ziekte in de test muizen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE) zijn fatale besmettelijke neurodegeneratieve aandoeningen die dieren beïnvloeden, huisdieren en mensen. De ziekteverwekker van TSE-ziekten lijkt verkeerd gevouwen of pathogene isovormen (PrP Res) van prion-eiwitten 1 zijn. Dierlijke TSE-ziekten omvatten Chronic Wasting Disease (CWD) bij muildierhert (Odocoileus hemionus), wit-staart hert (virginianus), elanden (Cervus elaphus), en elanden (Alces Alces), scrapie bij schapen en geiten, boviene spongiforme encefalopathie ( BSE) in vee; overdraagbare encefalopathie van de nerts in gekweekte nertsen; katachtige spongiforme encefalopathie bij katten; exotische hoefdieren spongiforme encefalopathie in exotische dierentuin herkauwt van de familie Bovidae, en spongiforme encefalopathie bij niet-humane primaten 8. De single menselijke ziekte TSE, variant van de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, is zeldzaam en gedacht te worden overgenomen door het consumeren van PrP Res-Contaminated eten 9. Op dezelfde manier kan BSE mensen besmetten als besmet rundvlees wordt verbruikt 10. Van alle TSE-ziekten, scrapie en CWD zijn de enige twee met zelfdragende epidemieën en de bronnen van infectie word aangenomen dat van dier tot dier 2,3,11 en uit omgevingsbronnen 4-6. Uit onderzoek blijkt dat de meeste TSE-ziekten vereisen opmerkelijk langere incubatie door natuurlijke blootstelling gebeurtenissen van PrP Res materiaal manifestatie van klinische symptomen 2-4,6,8 en schijnbare soort barrières te minimaliseren, maar het potentieel voor, tussen soorten transmissie 12-14 niet elimineren .

Het identificeren van mechanismen voor de verspreiding van besmettelijke prion (PrP Res) materiaal is uiterst belangrijk voor het beantwoorden van vragen over het TSE-ziekten bewegen over het landschap. Experimentele onderzoeken hebben gesuggereerd dat 15,16, pluimvee en varkens 17, en Amerikaanse kraaien (Corvus brac insectenhyrhynchos) 7,18 zijn passieve dragers of Verspreiders van PrP Res materiaal. Passage van PrP Res materiaal door het spijsverteringsstelsel van kraaien is onlangs gedocumenteerd, het aantonen van de rol die zij kunnen spelen bij de verspreiding van TSE-ziekten 7. Deze resultaten maken het aannemelijk dat kraaien, een aaseter, zou kunnen tegenkomen, consumeren, en transporteren infectieus materiaal via uitwerpselen depositie, naar ziektevrije gebieden.

De procedures die we hier laten zien werden gebruikt om de passage van PrP Res materiaal te documenteren door het spijsverteringsstelsel van kraaien en zal de toepassing van deze methoden om andere aaseter en carnivoor soortspecifieke modellen in gerelateerde toekomstig onderzoek aanzienlijk vergemakkelijken. In deze studie werden conventionele methoden gebruikt om een onconventionele middelen van mensenhandel PrP Res materiaal, die kunnen bijdragen tot de verspreiding en de totale lasten van PrP Res materiaal te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons protocol is een bewerking van degene die we eerder gepubliceerde 7. Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA), Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC).

1. Kraai Gavaging

  1. Schatten doorlooptijd van 'pseudo hersenmateriaal' door het spijsverteringskanaal van de Amerikaanse kraaien.
    1. Meng 5 ml gekookt en roerei hele eieren met blauwe kleurstof en maagsonde 1 kraai met een 2 in maagsonde naald (figuur 1).
    2. Controleer kraai elke 30 min, totdat blauw / groen-gekleurde ontlasting niet meer worden uitgescheiden.
  2. Verkrijgen geïnfecteerde en terminaal zieke RML (Chandler stam) geïnfecteerde C57BL / 6 muis hersenen.
  3. Genereer een 20% gew / vol normale en geïnfecteerde muizen-homogenaat in een kogel mixer homogenisator met 1xfosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en glaskralen, centrifugeer bij 3000 xg gedurende 1 min tot grotere deeltjes te verwijderen. Verwijder de supernatant en verdun met een gelijk volume van 1 x PBS tot een 10% gew / vol in steriele PBS genereren. Invriezen bij -80 ° C totdat het nodig is.
  4. 17 uur voorafgaand aan de maagsonde verwijderen voedsel, maar geen water, uit kraai pennen.
  5. Willekeurig toewijzen kraaien behandelingsgroepen en mondeling maagsonde elke kraai met 5 ml van een normaal of een besmette muis hersenhomogenaat met behulp van een 2 in maagsonde naald.
  6. Transfer kraaien individuele kooien en het verzamelen en bundelen alle uitwerpselen binnen elke kooi voor 4 uur na maagsonde (figuur 2).
  7. Homogeniseren samengevoegde feces voor elke kraai in een kogel blender homogeniseerder met glaskralen totdat een gelijkmatige textuur wordt bereikt. * Crow uitwerpselen zijn meestal vloeibaar en kan gemakkelijk worden gemengd.
  8. Voor elk object, verdun 500 gl fecale homogenaat in 9,5 ml 1x PBS gedurende een totaal volume van 10 ml.
  9. Centrifugeer de fecale homogenate gedurende 15 minuten bij 1400 xg en verwijder de bovenstaande vloeistof.
  10. Om het gevaar van een secundaire microbiële infectie minimaliseren, behandel supernatant met 1 pl van 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (Invitrogen, NY) per 100 pl homogenaat dan plaats onder UV licht bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten te verminderen risico van virale en bacteriële besmetting. Na blootstelling aan UV, ultrasone trillingen monsters in een 3000 Mp sonicator bij instelling 70 gedurende 30 seconden op het membraan van de overige microben verstoren.

2. Muis Enten

  1. Willekeurig muizen kent de volgende behandelingsgroepen (tabel 1):
    1. Groep 1 - Positieve behandelde muizen intraperitoneaal geïnoculeerd (IP) met 1 ml van fecale homogenaat van kraaien oraal gavaged met 5 ml besmette muis hersenen.
    2. Groep 2 - Negatieve behandelde muizen ingeënt IP met 1 ml van fecale homogenaat van kraaien oraal gavaged met 5 ml normale muis hersenen.
    3. Verdunnen infected en normale muizenhersenen homogenaat voor groepen 3 en 4 tot 1:100 w / v in 1x PBS.
    4. Groep 3 - positieve controle muizen geïnoculeerd IP met 1 ml geïnfecteerde muizen-hersenhomogenaat.
    5. Groep 4 - Negatieve controle muizen geïnoculeerd IP met 1 ml normaal muizen-hersenhomogenaat.
Behandeling Groep Aantal dieren
Groep 1 Scrapie + Crow Uitwerpselen 100
Groep 2 Scrapie - Crow Uitwerpselen 25
Groep 3 Scrapie + Mouse Brain 10
Groep 4 Scrapie - Mouse Brain 5

. Tabel 1 Scrapie status van inoculum (positief +, negatief -) en het aantal gebruikte dieren 7.

  1. Intraperitoneaal te enten muis:
    1. Nekvel muis door het dorsale nek bont met duim en wijsvinger en voorzichtig draaien om buikzijde bloot.
    2. Elevate achterste eind van de muis, zodat het hoofd iets lager.
    3. Steek 25 G naald 1 cm door de huid, 1 cm lateraal van de middellijn, en 1-2 cm juist voor de SI-gewricht met behulp van een naald vergrendeling spuit.
    4. Injecteer 1 ml te enten langzaam in muis lichaamsholte.

3. Muis Monitoring

  1. Monitor muizen dagelijks tot ze klinische symptomen van muis scrapie uit te drukken. Klinische verschijnselen kunnen zijn: kyfose, ataxie, stijve staart, gebrek aan verzorging, vermagering, en lethargie.
  2. Score muizen voor elk van de 6 klinische symptomen als zichtbare tekenen zijn evident, waarbij 0 = geen zichtbare, 1 = matig, 2 = ernstig.
  3. Euthanaseren muizen als totale dagelijkse scores voor elk teken bereiken ≥ 8 voor 1 dag, ≥ 6 continu gedurende 3 dagen, of 365 dagen na inoculatie (dpi).
  4. Harvest hersenen onmiddellijk na euthanasia en bewaar bij -70 ° C.
  5. Een scrapie diagnose te bevestigen, verteren hersenstalen met 3 pl van een 50 ug / ml proteïnase-K-oplossing (PK) als volgt verdund: 3.1. pl PK, 12,5 ui 500 mM EDTA, pH 8, 109,39 pl 1x PBS gedurende 30 min bij 45 ° C, daarna het inactiveren PK door toevoeging van 8 pi laadbuffer en incubatie monsters bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Samples op een 12% SDS-PAGE gel, Electrophorèse transfer naar Immobilon PVDF membraan en blokkeren met 5% magere melk in 0,2% Tween 20 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Sonde daarna met Bar224 anti-PrP monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan mierikswortel peroxidase, verdund in superblok, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Spoel membraan gedurende 1 uur met PBS 0,2% Tween 20. Visualiseren, incubeer Western blot 5 min met chemiluminescentiesubstraat en beeld op een G-box gel-documentatiesysteem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De procedures die aantonen dat het spijsverteringsstelsel kraaien PrP Res infectiviteit 4 uur niet elimineert na orale gavage van scrapie hersenhomogenaat 7. Alle twintig kraaien die werden gavaged met PrP Res materiaal vervolgens overgebracht PrP Res materiaal via ontlasting te muizen. Zieke muizen werden geïdentificeerd door manifestatie van klinische muis scrapie symptomen en bevestiging ziekte werd voltooid door Western blotanalyse.

Onderzoek v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We tonen een procedure om doorgang van PrP Res materiaal te documenteren door het spijsverteringsstelsel van kraaien. We gebruikten gebruikelijke werkwijzen om te bepalen of kraaien de mogelijkheid om PrP Res materiaal verplaatsen naar ziektevrije geografische gebieden. Anderen hebben weerstand van PrP Res geëvalueerd om 19-21 en knaagdieren 22,23 spijsverteringssappen, die beide niet in geslaagd om het te elimineren herkauwers. Toekomstige toepassing van deze techn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen S. Werner bedanken voor de kraaien die in deze studie en USDA, APHIS, WS, NWRC dierenverzorgers voor dierlijke zorg en monitoring. Vermelden of het gebruik van een product impliceert niet USDA goedkeuring. Financiering voor deze studie werd verstrekt door USDA, APHIS, de Veterinaire Diensten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RML Chandler strain mouse-adapted scrapieRocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 muizenHilltop Lab Animals
Amerikaanse kraaienin het wild gevangen
Pen/StrepInvitrogen15140-122
Fosfaat gebufferde SalineInvitrogen70011-044
SonicatorMisonix
Proteinase-K oplossingRoche3115887001
Loading bufferInvitrogenNP0007 en 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gelInvitrogenNP0342
Immobilon PVDF membraanMillipore1SEQ00010
Tween 20Sigma AldrichP2287
Bullet blender homogenisatorBraintree ScientificBBX24B
2,3 mm Zirconia/silica kralenBioSpec Products11079125Z
Bar224 anti-PrP monoklonaal antilichaamCayman Chemical10009035
SuperblockThermo Scientific37517
chemiluminescent substraatMilliporeWBKLS0500
G-box gel documentatie systeemSyngene

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Miller, M. W., Williams, E. S., et al. Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming. Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).
  3. Miller, M. W., Williams, E. S. Horizontal prion transmission in mule deer. Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).
  4. Sigurdson, C. J., Adriano, A. Chronic Wasting Disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).
  5. Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. Environmental sources of prion transmission in mule deer. Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).
  6. Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure. PLoS ONE. 4 (6), e5916(2009).
  7. VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos). PLoS ONE. 7 (10), e45774(2012).
  8. Imran, M., Mahmood, S. An overview of animal prion diseases. Virology Journal. 8 (493), (2011).
  9. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion disease. PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26(2006).
  10. Bruce, M. E., et al. Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).
  11. Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy. Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).
  12. Collinge, J. The risk of prion zoonoses. Science. 335 (6067), 411-413 (2012).
  13. Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. Prion agent diversity and species barrier. Veterinary Research. 39 (47), (2008).
  14. Harrington, R. D., Baszler, T., et al. A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison). The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).
  15. Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. Mites as vectors for scrapie. Lancet. 347 (9008), 1114(1996).
  16. Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. Fly larvae and pupae as vectors for scrapie. Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).
  17. Matthews, D., Cooke, B. C. The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish. Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).
  18. Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease. Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).
  19. Scherbel, C., Pichner, R., et al. Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle. Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).
  20. Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep. Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).
  21. Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels. Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).
  22. Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models. Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).
  23. Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie. Veterinary Research. 40 (1), 4(2009).
  24. Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).
  25. Bjorndal, K. A. Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate. Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).
  26. Clark, R. G., Gentle, G. C. Estimates of grain passage time in captive mallards. Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).
  27. Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity. Primates. 33 (3), 399-405 (1992).
  28. Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer. Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).
  29. Pulford, B., Spraker, T. A., et al. Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification. Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).
  30. Hicks, R. E. Guano deposition in an Oklahoma crow roost. Condor. 81 (3), 247-250 (1979).
  31. Aldous, S. E. Winter habits of crows in Oklahoma. Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PrPRes materiaalpassage via het spijsverteringsstelselAmerikaanse kraaienfecesverzamelingintraperitoneale injectiebio assay in muizenWestern blot analysemonitoring van klinische symptomenProteinase K digestie

Gerelateerde artikelen