Verrijking en zuivering van menselijke embryonale stamcellen door detectie van celoppervlakantigenen met behulp van de monoklonale antilichamen TG30 en GCTM-2

Samenvatting

We beschrijven het gebruik van de monoklonale antilichamen TG30 (CD9) en GCTM-2 voor de gecombineerde detectie van celoppervlakantigenen via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor de identificatie en verrijking van levende menselijke embryonale stamcellen (hESC) met behulp van positieve selectie en ook het gebruik van negatieve selectie om hESC's uit een gemengde celpopulatie te zuiveren.

Samenvatting

Menselijke embryonale stamcellen (hESC) kunnen zichzelf voor onbepaalde tijd in vitrovernieuwen en met de juiste signalen kunnen worden geïnduceerd om te differentiëren in mogelijk alle somatische cellijnen. Gedifferentieerde hESC-derivaten kunnen mogelijk worden gebruikt in transplantatietherapieën voor de behandeling van een verscheidenheid aan celdegeneratieve ziekten. HESC-differentiatieprotocollen leveren echter meestal een mengsel op van gedifferentieerde doel- en off-target celtypen en resterende ongedifferentieerde cellen. Voor de vertaling van gedifferentieerde hESC-derivaten van het laboratorium naar de kliniek is het belangrijk om onderscheid te kunnen maken tussen ongedifferentieerde (pluripotente) en gedifferentieerde cellen en methoden te kunnen genereren om deze populaties te scheiden. Veilige toepassing van hESC-afgeleide somatische celtypen kan alleen worden bereikt met pluripotente stamcelvrije populaties, omdat resterende hESC's tumoren kunnen induceren die bekend staan als teratomen na transplantatie. Hiertoe beschrijven we hier een methodologie om pluripotentie geassocieerde celoppervlakantigenen te detecteren met de monoklonale antilichamen TG30 (CD9) en GCTM-2 via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor de identificatie van pluripotente TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESCs met behulp van positieve selectie. Met behulp van negatieve selectie met onze TG30/GCTM-2 FACS-methodologie konden we ongedifferentieerde hESC's detecteren en zuiveren in populaties die een zeer vroege differentiatie ondergaan (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). In een verdere studie, pluripotente stamcel-vrije monsters van gedifferentieerde TG30^Neg-GCTM-2^Neg cellen geselecteerd met behulp van ons TG30/GCTM-2 FACS protocol niet teratomen vormen eenmaal getransplanteerd in immuun-gecompromitteerde muizen, ter ondersteuning van de robuustheid van ons protocol. Aan de andere kant hadden TG30/GCTM-2 FACS-gemedieerde opeenvolgende passaging van verrijkte pluripotente TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESCs geen invloed op hun vermogen om zichzelf in vitro te vernieuwen of hun intrinsieke pluripotentie. Daarom bieden de kenmerken van onze TG30/GCTM-2 FACS-methodologie een gevoelige test om sterk verrijkte populaties van hPSC te verkrijgen als input voor differentiatietesten en om potentieel tumorogene (of resterende) hESC uit derivatencelpopulaties te verwijderen.

Inleiding

HPSC (hPSC) omvatten menselijke embryonale stamcellen (hESC) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hIPSC). HPSC kan zichzelf voor onbepaalde tijd vernieuwen in geschikte cultuuromstandigheden zonder hun vermogen te verliezen dat bekend staat als "pluripotentie". Pluripotentie wordt gedefinieerd als het potentieel voor een cel om zich te onderscheiden in in wezen elke somatische cellijn, inclusief cellen die representatief zijn voor elk van de drie embryonale kiemcellagen. Het opmerkelijke potentieel van hPSC biedt een middel voor een grote verscheidenheid aan celgebaseerde toepassingen, waaronder therapeutische opties. Er zijn bijvoorbeeld aandoeningen met celdood en degeneratie, waarbij de normale functionaliteit van cellen in het menselijk lichaam wordt aangetast, zoals bij hartfalen, ruggenmergletsels, diabetes, de ziekte van Parkinson, sommige kankers en andere klinische pathologieën. Patiënten die aan deze aandoeningen lijden, kunnen mogelijk worden behandeld door gezonde en functionele somatische cellen te transplanteren die zijn afgeleid van hPSC in het laboratorium. De huidige hPSC-differentiatieprotocollen zijn echter niet 100% efficiënt en leveren een mix op van gedifferentieerde doel- en off-target celtypen, evenals resterende hPSC's die geen differentiatie hebben ondergaan, in plaats daarvan blijven ze zichzelf vernieuwen^1-3. De aanwezigheid van zelfs een klein aantal hPSC in een monster van van hPSC afgeleide somatische cellen bestemd voor transplantatie bij patiënten vormt een ernstig klinisch risico, aangezien deze cellen door hun inherente aard weefsels van alle drie de embryonale kiemlagen kunnen vormen, mogelijk in vivo een type tumor kunnen vormen dat bekend staat als een teratoom. Daarom kunnen alleen doelcelpopulaties waarvan is vastgesteld dat ze vrij zijn van pluripotente stamcellen als veilig worden beschouwd voor transplantatie bij patiënten. Er zijn verschillende benaderingen gerapporteerd om mogelijk de zuivering van resterende hPSC's na differentiatie te bereiken (zie Polanco en Laslett⁴voor beoordeling ). We hebben eerder het gebruik gemeld van de monoklonale antilichamen TG30 (CD9) en GCTM-2 gekoppeld aan fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om pluripotente stamcellen te identificeren en te onderscheiden van cellen die een vroeg stadium van differentiatie ondergaan in culturen van^{hESC-lijnen 5-7}.

Een voordeel van het gebruik van antilichamen om celoppervlakantigenen te detecteren, is dat de doelcellen meestal levensvatbaar zijn na het binden en/of labelen van antilichamen. Daarom kunnen doelcellen worden verzameld na antilichaametikettering en opnieuw worden gecultiveerd voor uitbreiding en verdere toepassingen vóór transplantatie. Een voorbehoud voor celoppervlakantigenen uitgedrukt op hPSC is dat ze niet exclusief zijn voor het pluripotente stadium en in veel gevallen tijdelijk opnieuw worden uitgedrukt tijdens de ontwikkeling en daarom zullen worden gedetecteerd in sommige gedifferentieerde celtypen. Daarom, als het doel is om antilichamen te gebruiken om menselijke pluripotente cellen op te sporen en te zuiveren uit een monster van hPSC-afgeleide cellen, mogen geselecteerde antilichamen niet ook reageren met antigenen op de specifieke gedifferentieerde celtypen die bestemd zijn voor transplantatie. Helaas zijn er beperkte aantallen antilichamen die celoppervlakmarkers detecteren op live hPSC's ^4,waardoor de selectiemogelijkheden beperkt zijn. Bovendien hebben enkele studies erop gewezen dat detectie van één enkele celoppervlakmarker niet voldoende is om alle hPSC te elimineren, wat suggereert dat elke poging om alle hPSC pluripotente subpopulaties te elimineren, moet vertrouwen op methoden die twee of meer antilichamen gebruiken die verschillende epitopen detecteren, uitgedrukt door hPSC's ^9-10. Zoals hierboven vermeld, zijn alleen hPSC-afgeleide cellen die kunnen worden bepaald als pluripotente stamcelvrije celpopulaties geschikt voor menselijke transplantatie. Het bereiken van dit niveau van strengheid kan niet worden bereikt met een enkele doorgang door een antilichaamgemedieerde celsorteertechnologie. Herkweek van de verrijkte populatie van gedifferentieerde doelcellen en daaropvolgende rondes van celsortering kan nodig zijn om definitief pluripotente stamcelvrije monsters te verkrijgen.

In ons laboratorium hebben we twee hES-celoppervlakantistoffen, TG30 (CD9) en GCTM-2, uitgebreid gekarakteriseerd voor de detectie van levende pluripotente cellen. Onze studies hebben aangetoond dat gecombineerde detectie van zowel TG30 als GCTM-2 sterk correleert met de expressie van canonieke pluripotentie-geassocieerde genen in ^{hESC-lijnen 5-7}. TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling heeft consequent aangetoond dat hESC-culturen een kwantitatieve continue gradiënt van TG30/GCTM-2 expressie ^5-7vormen . We hebben willekeurig vier populaties (P) cellen binnen deze TG30/GCTM-2 gradiënt vastgesteld: P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) en P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) ^5-7. Onze karakterisering van deze P4-, P5-, P6- en P7-celpopulaties heeft aangetoond dat de P6- en P7-subfracties een groot aantal pluripotentie-geassocieerde genen uitdrukken en efficiënt stamachtige kolonies vormen wanneer ze na FACS ^2-3worden herkweekt . Aan de andere kant drukken P4 -cellen (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) een groot aantal differentiatiemarkers uit en vormen ze de spontaan gedifferentieerde celtypen die typisch voorkomen in uitdijende culturen van hESC-lijnen ^5-6. We hebben besloten om de potentialiteit van onze TG30/GCTM-2 FACS te testen voor de selectieve eliminatie van resterende hPSC's na differentiatie in een vroeg stadium, en ook voor de verrijking van pluripotente stamcelpopulaties. Het hieronder beschreven protocol laat zien hoe gedifferentieerde P4 -cellen (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) na FACS kunnen worden verzameld en herculturen om het zuiveren van pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) te bereiken. Verder leggen we ook de verzameling en hercultuur van pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen uit om een verrijkte cultuur van pluripotente cellen te verkrijgen, die vervolgens kan worden gebruikt als een gedefinieerde inputpopulatie om mogelijk de efficiëntie en consistentie van differentiatietesten te verhogen.

Protocol

Het volgende protocol werd uitgevoerd met behulp van hESC-MEL1¹¹ standaard bulkculturen van de StemCore-faciliteit aan de Monash University (Melbourne). Deze cellijn wordt routinematig gekweekt op een laag mitotically inactivated muis embryonale fibroblasten (MEF's) in bFGF aangevuld hESC/KOSR media⁷ en wordt gehandhaafd met enzymatische dissociatie (Collagenase) elke 5-7 dagen⁸. hESC-culturen die in kolven van 75 cm² (T75) tot ~80% samenvloeiing zijn gegroeid, worden gebruikt als inputpopulaties voor dit protocol. Alle hieronder beschreven celmanipulatieprocedures moeten onder aseptische omstandigheden worden uitgevoerd in een met HEPA gefilterde bioveiligheidskast van klasse II.

Bereid twee dagen voordat u een TG30/GCTM-2 FACS-test uitvoert, de T75-kweekplaten (beschreven in rubriek 1) voor die moeten worden gebruikt voor de herkweek van cellen die na FACS zijn teruggewonnen (beschreven in rubriek 4).

1. Zaaien van MEF's en bereiding van mef-geconditioneerd medium

1.1 DAG -2: Beplating van MEF's in T75-kolven

1. Pipet 10 ml 0,1% w/v gelatine in elke T75 kolf en kantel om het oppervlak gelijkmatig te coaten.
2. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bioveiligheidskast.
3. Aspirate gelatineoplossing.
4. Voeg 20 ml MEF-medium toe aan de kolf en 30 min voor 30 min in een celkweekincubator tot 37 °C/5% CO_2.
5. Plaat mitotically inactivated MEFs op bereide kolf(en) bij de volgende dichtheden. Voor 1/3 MEF dichtheid zaad 1,4 x 10⁴ cellen/cm² (T75= 1 x 10⁶ MEF's). Voor mefzaad met volledige dichtheid 5,3 x 10⁴ cellen/cm² (T75 = 4 x 10⁶ MEF's).

Opmerking: We gebruiken routinematig MEF's die mitotisch werden geactiveerd door γ-bestraling. Michalska¹²vindt u een protocol voor de voorbereiding van door γ bestraalde MEF 's .

6. Bestraalde MEF-culturen 's nachts bestralen bij 37 °C/5% CO_2. De 1/3 kolven kunnen gedurende 1-4 dagen worden geïncubeerd zonder mef-medium verandering. Deze kolven worden gebruikt voor het opnieuw spatten van post-FACS-cellen (zoals in protocol 4). Volle MEF-kolven worden 's nachts geïncubeerd om CM te genereren volgens de onderstaande in stap 1.2.

1.2 DAG -1: Bereiding van mef-geconditioneerd medium (CM)

1. Aspireer MEF-medium uit volmef T75 kolven.
2. Voeg voorgequilibreerd 25 ml hESC/KOSR medium toe, aangevuld met 5 ng/ml humane FGF-2 per T75 kolf. Incubeer bij 37 °C/5% CO₂ gedurende 24 uur.
3. Verzamel MEF-geconditioneerd medium (CM) in een steriele weefselkweekbuis, vul CM aan met 10 ng/ml humane FGF-2 en filtreer met een polyethersulfonfilter van 0,22 μm.
4. Om extra CM te produceren, herhaalt u stap 1.2.2 en 1.2.3 dagelijks op dezelfde MEF-cultuur gedurende een week.

Vervang op de dag van het uitvoeren van een TG30/GCTM-2-test mef-medium in 1/3 MEF T75-kolven door CM en vóór het zaaien van hESC's of hESC-derivaten die uit de procedure zijn teruggewonnen, zoals hieronder beschreven. CM wordt vers gebruikt of maximaal 2 weken bij 4 °C bewaard. CM wordt gebruikt in dit protocol omdat het in onze handen de levensvatbaarheid van de cellen na FACS verhoogt in vergelijking met niet-geconditioneerde media (resultaten niet weergegeven).

2. Het uitvoeren van een TG30/GCTM-2 FACS-test: Dissociatie van hESC Bulkculturen in enkele cellen

Opmerking: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 medium bij 4 °C.

1. Aspireer de hESC/KOSR-media uit twee T75-kolven met een gekweekte hESC-lijn.
2. Spoel de cellen in elke T75 af met 10 ml DPBS en aspireer om te verwijderen.
3. Voeg 3 ml TrypLE Express dissociatieoplossing toe aan elke T75 kolf. Incubeer bij 37 °C/5% CO₂ gedurende 5 min.
4. Stoot de zijkant van de kolven om volledige loslating van de cellen te verkrijgen. Kijk onder de microscoop. Als cellen niet gemakkelijk losbarsten, incubeer dan nog eens 2-3 minuten bij 37 °C/5% CO₂.
5. Voeg 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bij 4 °C) toe aan elke T75 kolf. Gebruik een steriele pipet van 10 ml om de gedissocieerde cellen voorzichtig meerdere keren tegen de kolfwand te tritureren om een overwegend enkele celsuspensie te bereiken.
6. Plaats een celzeef van 70 μm op een steriele polypropyleenbuis van 50 ml. Gebruik een steriele pipet van 10 ml om de hESC-eencellige suspensuspensus die uit de twee T75-kolven zijn gepoold, door de zeef te dwingen.
7. Gooi de celzeef weg, vervang het buisdeksel en centrifugeer de gepoolde hESC-suspensie gedurende 2 minuten op 1.000 x g.
8. Gooi supernatant weg en was de cellen door de pellet voorzichtig te resuspenderen in 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (voorgekauwd bij 4 °C).
9. Voer een tweede centrifugeerbeurt uit op 1.000 x g gedurende 2 min.
10. Gooi supernatant weg, voeg 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (voorgekauwd bij 4 °C) toe en tritureer voorzichtig aan resuspendcellen. Leg de buis van 50 ml op ijs. Deze buis zal worden gebruikt voor de sorteermonster immunostaining procedure hieronder beschreven.
11. Neem 20 μl van de hESC-suspensie met één cel (stap 2.10) voor het tellen van celgetallen met behulp van een hemotocytometer. U mag een opbrengst van 10-15 miljoen cellen per T75 kolf verwachten.

Opmerking: FBS wordt in dit deel van het protocol gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen na FACS te vergroten.

3. Immunofluorescente kleuring van celoppervlakantigenen TG30 en GCTM-2

1. Aliquot 150 μl (~100.000 cellen) van een hESC-eencellige suspensie (vanaf stap 2.11) in elk van de zes microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Deze zes aliquots zullen worden gebruikt voor de kleuringsregelaars die nodig zijn om de test op de FACS-machine te kalibreren. De resterende ~9 ml celsuspensie is uw sorteermonster waarin de gedissocieerde cultuur wordt gesuspendeerd voor detectie van TG30 en GCTM-2, volgens de tabellen 1 en 2.
2. Voer bindingsreacties uit van primaire antilichamen in 20% FBS/DMEM-F12. De uiteindelijke reactievolumes moeten ~9 ml zijn voor het sorteermonster en 200 μl voor de besturingselementen. Neem isotypecontroles op als primaire antilichamen. Plaats buizen horizontaal op ijs en meng zachtjes gedurende 30 minuten op een schommelplatform.
3. Centrifugeer primaire antilichaamreacties bij 1.000 x g gedurende 2 min.
4. Gooi supernatant weg en was de cellen door de pellet opnieuw te spoelen in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (voorgekauwd bij 4 °C) voor het sorteermonster en 200 μl voor de controles.
5. Voer een tweede draai uit op 1.000 x g gedurende 2 min.
6. Voer bindingsreacties uit van secundaire antilichamen bij 20% FBS/DMEM-F12. De uiteindelijke reactievolumes moeten 2,5 ml zijn voor het sorteermonster en 200 μl voor de controles. Bereid de PE-antimuis CD90.2 reactiebuis in dit stadium voor. Plaats buizen horizontaal op ijs en meng zachtjes gedurende 30 minuten op een schommelplatform.

Opmerking: Tijdens deze incubatietijd is het handig om CM te verzamelen en 1/3 MEF T75-kolven met CM te bereiden zoals in rubriek 1.2.

7. Centrifugeer secundaire antilichaamreacties bij 1.000 x g gedurende 2 min.
8. Gooi supernatant weg en was de cellen TWEEMAAL door de pellet opnieuw te spoelen in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (voorgekauwd bij 4 °C) voor het sorteermonster en 200 μl voor de controles.
9. Voer een spin uit op 1.000 x g gedurende 2 minuten na elke wasbeurt en plaats buizen op ijs.
10. Gooi supernatanten en resuspend celkorrels weg in 20% FBS/DMEM-F12 aangevuld met propidiumjodide (PI) bij 0,3 μg/ml. Gebruik 2-3 ml voor het sorteermonster en 300 μl voor de bedieningselementen.

Opmerking: Voeg GEEN PI toe aan de stuurbuis met niet-aangetaste cellen.

11. Gebruik een P1000 micropipet om elke afzonderlijke celsuspensie te forceren door een celzeef met een deksel van 35 μm, gekoppeld aan 5 ml buispolystyreen rondbodemtestbuizen.
12. Centrifugeer bij 50 g/min om de resterende celsuspensie op de zeefdeksels te forceren.
13. Resuspendeer elke enkele cel suspensie door op de zijkanten van de buizen te tikken en op ijs te plaatsen. Uw cellen zijn nu klaar voor FACS. Ga alsjeblieft meteen verder.

4. Post-FACS Cultuur van TG30/GCTM-2 Subfractiecellen in 75 cm² (T75) Kolven

1. We hebben eerder gemeld hoe u een FACS-machine instelt voor TG30/GCTM-2 immunoprofiling⁷. De procedure maakt het mogelijk levensvatbare enkelvoudige HESC 's, vrij van MEF 's, en binnen de poorten van P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low), P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) en P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) - zie figuur 1E. Stel de FACS-machine in voor TG30/GCTM-2 FACS zoals in ons vorige rapport om de celsubfracties te herstellen die vervolgens moeten worden gebruikt.
2. Voeg 1 ml CM, bereid zoals in stap 1.2, toe aan elk van de twee 5 ml polystyreen ronde onderste reageerbuizen voordat u cellen uit de FACS-machine verzamelt. Plaats op ijs.
3. Herstel elk 400.000 cellen uit gedifferentieerde P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) en pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) celsubfracties met behulp van TG30/GCTM-2 FACS.
4. Centrifugeer de opvangbuizen gedurende 5 minuten op 1.000 x g.
5. Aspireer de supernatanten. Voeg 1 ml voorgequilibreerde 37 °C/5% CO₂ CM toe om elke celkorrel opnieuw te gebruiken met behulp van een P1000-micropipettor. Zaai de cellen voor elke fractie op een voorgequilibreerde 1/3 MEF T75 kolf met CM (bereid volgens stap 1.2)
6. Kweek bij 37 °C/5% CO₂ gedurende 24 uur in een celkweekincubator.
7. Aspireer CM dagelijks en vervang door vers bereide CM (zoals in stap 1.2) gedurende ongeveer twee weken. Culturen van pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen tonen menselijke stamachtige kolonies na een week en bereiken ~ 80% samenvloeiing na 9-11 dagen. Culturen van P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) cellen groeien meestal als een gazon van fibroblast-achtige cellen die samenvloeiing bereiken na 11-13 dagen. In dit stadium kunnen, indien nodig, P4- en P7-celculturen worden gebruikt voor TG30/GCTM-2 FACS-gemedieerde opeenvolgende recultuur van P4- of P7-subfracties (zie figuren 2 en 3).

Resultaten

hESC-derivaten die pluripotent stamcelvrij zijn, kunnen worden verkregen door opeenvolgende doorlaat van cellen uit de subfractie P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg).

Eerdere rapporten hebben aangetoond dat in hESC-standaardculturen een mengsel van subpopulaties naast elkaar bestaat met een expressiegradiënt van genen geassocieerd met pluripotentie^5,6,13. Gecombineerde detectie van celoppervlakantigenen zoals TG30 (CD9) en GCTM-2 maakt het mogelijk om een aantal subsets van cellen te discrimineren in het pluripotente stadium en in verschillende stadia van vroege differentiatie, zoals aangegeven door hun expressie van stamcelmarkers en afstammingsspecifieke transcriptiefactoren^5,6,13. In overeenstemming met eerdere rapporten konden we P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) en P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen discrimineren in de hESC-MEL1-lijn die voor deze studie werd gebruikt (Figuur 1). Met dit resultaat zijn we verder gegaan met het verzamelen van gedifferentieerde P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) cellen en pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen voor verdere kweek in studies die hieronder worden beschreven.

We onderzochten of we met behulp van een negatieve selectiebenadering ongedifferentieerde hESC's konden zuiveren van celpopulaties die een zeer vroege differentiatie ondergaan (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). We gebruikten een gedefinieerd aantal P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) cellen die achtereenvolgens werden gekweekt na FACS (figuur 2A) gedurende ongeveer twee weken, en opnieuw werden geëmuleerd met behulp van TG30/GCTM-2 FACS voordat we bij elke passage opnieuw spetterden. De resultaten toonden aan dat de P4-subfractie verrijkt voor TG30^Neg-GCTM-2^Neg gedifferentieerde celtypen na opeenvolgende passaging, en een kleine aanwezigheid van P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen bij de initiële passage(figuur 2A,passage 1) uiteindelijk verdwenen na verdere passaging, waardoor pluripotente stamcelvrije monsters werden (figuur 2A, Passage 3).

Verrijking van pluripotente hESC-cellen kan worden bereikt door het verzamelen van cellen TG30^Hi-GCTM-2^Hi cellen.

Op basis van eerdere waarnemingen met behulp van deze test verwachten we een verrijking van pluripotente hESC's door P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen te verzamelen die hESC-kolonies zouden moeten vormen. Daarom hebben we ook TG30/GCTM-2 FACS-gemedieerde opeenvolgende passaging van pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen onderzocht. In deze P7-culturen werd TG30/GCTM-2 FACS-immunoprofiling uitgevoerd voorafgaand aan het opnieuw spatten van cellen bij elke passage en werden alleen P7 -TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen opnieuw gekweekt. Op deze manier merkten we op dat de meerderheid van de cellen zich bevond in de subfracties die verband houden met pluripotentie (P6 en P7),wat wijst op een verrijking van pluripotente cellen die ook een capaciteit behielden om te differentiëren en een klein percentage P4 -GCTM-2^Neg) cellen te genereren (Figuur 3A). Bovendien vertoonden culturen van P7-cellen een groot aantal hESC-achtige kolonies tijdens het passeren (figuur 3B), wat ook wijst op het behoud van de pluripotentietoestand.

Figuur 1. Representatieve sorteerstrategie voor het verkrijgen van TG30/GCTM-2 FACS-subfracties. (A): Gedissocieerde hES-celsuspensingen worden gesorteerd als enkele cellen en potentiële klonten of doubletten worden afgesloten met de voorwaartse spreiding voor hoogte en oppervlakte (FSC-H en FSC-A). B): Potentieel vuil wordt verwijderd met FSC-A en SSC-A en alleen intacte cellen worden verder gesorteerd. C): Niet-vieerbare cellen zijn uitgesloten op basis van propidiumjodide (PI) fluorescentie (FSC-A en FL3-A). D): MEF-feedercellen werden uitgeschakeld door negatieve selectie op basis van expressie van muis CD90.2-PE (FL2-A en SSC-A). E): De geïsoleerde levensvatbare hESC-fractie, vrij van MEF-feeders, wordt uiteindelijk gefractioneerd in P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)en P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) subpopulaties. De negatieve poort (TG30^Neg-GCTM-2^Neg, genaamd P4) werd ingesteld op basis van achtergrondautofluorescentie voor de niet-aangetaste cellen en ook op isotyperegelaars. F): Percentages van de verschillende gated subpopulaties die typerend zijn voor een TG30/GCTM-2 flow cytometrie analyse. Klik hier om grotere figuur te bekijken.

Figuur 2. Representatieve opeenvolgende culturen van spontaan gedifferentieerde P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) cellen uit de hESC-MEL1 lijn. (A): Representatieve TG30/GCTM-2 FACS-plots met gated subsets van cellen (P4, P5, P6 en P7) gediscrimineerd door het niveau van gedetecteerde expressie van TG30- en GCTM-2-celoppervlakmarkeringen. Een initiële populatie van 400.000 hESC-derivaten met P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) immunoprofiling wordt verzameld uit bulkculturen van hESC-MEL1 lijn. Deze P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) cellen worden achtereenvolgens na FACS gepasseerd in omstandigheden die ondersteunend zijn voor hESC-vernieuwing in T75-kolven, tot het bereiken van confluency (11-13 dagen). Voorafgaand aan elke passage wordt TG30/GCTM-2 FACS uitgevoerd om alleen de P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) gedifferentieerde celtypen te verzamelen en te herculturen. B): Typische morfologie van het gazon van gedifferentieerde P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) cellen na 14 dagen. C): Sporadische hESC-achtige kolonies gezien na 14 dagen vermengd met het gazon van P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) cellen alleen bij passage 1, worden hoogstwaarschijnlijk gegenereerd door het besmetten van P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om grotere figuur te bekijken.

Figuur 3. P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen afgeleid van hESC-lijnen kunnen achtereenvolgens na FACS worden gepasseerd zonder hun intrinsieke pluripotente eigenschappen te verliezen. Representatieve TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling van de verschillende opeenvolgende passages, met de gediscrimineerde subsets van cellen (P4, P5, P6 en P7) volgens het expressieniveau van TG30 en GCTM-2. A): Een startpopulatie van 400.000 cellen met P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) kenmerken wordt opgehaald uit bulkculturen van de hESC-MEL1 lijn. Pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen worden achtereenvolgens na FACS gepasseerd in omstandigheden die ondersteunend zijn voor hESC-vernieuwing in T75-kolven, tot het bereiken van ~80% samenvloeiing (9-11 dagen). TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling wordt uitgevoerd voorafgaand aan het opnieuw spatten van cellen bij elke passage en alleen de P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen worden opnieuw gecultiveerd. De resultaten tonen aan dat P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen hun pluripotente kenmerken behouden met daaropvolgende passaging, inclusief conservering van (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) expressie, het vormen van hESC-achtige kolonies (weergegeven in B) en het behoud van het vermogen om te differentiëren zoals kan worden afgeleid uit de recapitulatie van een kleine fractie van gedifferentieerde P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) in elk van de FACS. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om grotere figuur te bekijken.

Monster (reactievolumes)	Primair antilichaam	Secundair antilichaam	PE Rat Anti-Muis CD90.2 b	Propidium Jodide c
Sorteermonster (~9 ml voor primaire ABs, 2,5 ml voor secundaire ABs)	(TG30 + GCTM-2) een	AF 488 geit anti-muis IgG2a + AF 647 geit anti-muis IgM	+	+
Controle-1: TG30 (200 μl)	TG30	AF 488 geit anti-muis IgG2a	-	+
Controle-2: GCTM-2 (200 μl)	GCTM-2	AF 647 geit antimuis IgM	-	+
Controle-3: Antimuis CD90.2 (200 μl)	-	-	+	+
Controle-4: Fycoerythrin (PE) (200 μl)	Muis IgG2a isotype	R-phycoerythrin geit anti-muis IgG2a	-	+
Controle-5: Muis Immunoglobuline isotype (200 μl)	Muis IgG2a isotype + IgM isotype	AF 488 geit anti-muis IgG2a + AF 647 geit anti-muis IgM	-	+
Controle-6: Niet-aangetaste cellen (200 μl)	-	-	-	-

Tabel 1. Sorteermonster en besturingselementen voor FACS-sortering. ^een Sorteermonster wordt gelijktijdig met TG30- en GCTM-2-antilichamen ge immunostained. ^b PE-antimuis CD90.2 wordt gebruikt om muiscellen te herkennen en MEF's uit hESC's te verwijderen tijdens FACS¹⁴. ^c Niet-vieerbare cellen worden uitgesloten met propidiumjodide bij een eindconcentratie van 0,3 μg/ml. Reagens toegevoegd (+), niet toegevoegd (-) aan reactiebuis.

antistof	gastheer	Isotype	Werkverdunning
TG30 (1,4 mg/ml)	muis	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (hybridoma supernatans)	muis	Igm	1:5 ~ 1:10 a
AF 488 geit anti-muis IgG2a	geit	Polyklonaal	1:500
AF 647 geit antimuis IgM	geit	Polyklonaal	1:500
R-phycoerythrin (PE) geit antimuis IgG2a	geit	Polyklonaal	1:1,000
Antimuis CD90.2	rat	IgG2b	1:100
Gezuiverde Muis IgG2a, κ Isotype Controle	muis	IgG2a	1:200
Gezuiverde Muis IgM, κ Isotype Controle	muis	Igm	1:200

Tabel 2. Antilichaamdetails en verdunningen voor FACS-sortering. ^a Door de extreem hoge expressie van GCTM-2 op het celoppervlak van hESC's is het niet mogelijk om verzadiging te bereiken met dit antilichaam. Elke partij GCTM-2 hybridoma supernatant moet worden getitreerd aan de hand van een standaardcontrole of een vorige batch om vergelijkbare resultaten te verkrijgen met hESC's op schaal en om overkleuring te voorkomen.

Naam van het medium	compositie
hESC/KOSR-medium	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) aangevuld met 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Nonessential Amino Acids, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml human fibroblast growth factor 2 (FGF-2) en Pen/Strep op 1x.
MEF-medium	Dulbecco's Modified Eagle Medium, hoge glucose (DMEM) aangevuld met 10% Foetale Runderserum (FBS), 2 mM GlutaMAX en Pen/Strep op 1x.

Tabel 3. Samenstelling van cultuurmedia.

Discussie

In de klinische context zijn gedifferentieerde somatische celtypen het uiteindelijke gewenste product voor transplantatie en therapeutische toepassingen, en hPSC zijn een zelfvernieuwende en schaalbare bron om die somatische cellen of hun voorlopers in het laboratorium te genereren. De aanwezigheid van resterende ongedifferentieerde hESC's met een inherent potentieel voor teratoomvorming is een veiligheidsrisico bij het overwegen van hESC-afgeleide somatische cellen voor transplantatie bij patiënten. Voor een overzicht van deze en andere risico's in verband met celtherapie zie Sharpe et al. ¹⁶ Om dergelijke toepassingen te realiseren, is het daarom absoluut noodzakelijk dat onderzoekers doelcelpopulaties willen genereren die ook pluripotent stamcelvrij zijn. Hiertoe tonen we hier aan dat het met behulp van onze TG30/GCTM-2 FACS-methodologie mogelijk is om te controleren op de aanwezigheid van pluripotente cellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) in een differentiërende celpopulatie en levensvatbare hESC-gedifferentieerde derivaten te verkrijgen die kunnen worden verrijkt en gehercultureerd post-FACS. Hoewel het niet mogelijk is om 100% pluripotente stamcelvrije monsters te verkrijgen met een enkele pas van ons protocol, kunnen verrijkte hESC-derivaten opnieuw worden gecultiveerd en na opeenvolgende passaging wordt 100% somatische celzuiverheid bereikt. De aangetoonde levensvatbaarheid van somatische cellen voor expansie na FACS maakt het mogelijk om voldoende cellen te produceren die geschikt zijn voor potentiële transplantatietherapieën.

De bemoedigende resultaten van deze pilotstudie brachten ons ertoe om een uitgebreider onderzoek uit te voeren met behulp van ons TG30/GCTM-2-protocol in een vergelijkende studie met verschillende door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) lijnen¹⁵. In die studie ontdekten we dat pluripotente stamcelvrije monsters verkregen met behulp van ons TG30/GCTM-2 FACS-protocol geen teratomen veroorzaakten bij transplantatie in immuunarme muizen. Daarom kunnen we vol vertrouwen stellen dat met het gebruik van dit in vitro protocol, vroege fase differentiatie celculturen bepaald om vrij te zijn van pluripotente TG30^Hi-GCTM-2^Hi cellen ontwikkelen geen teratomen in vivo. Dit ondersteunt sterk de robuustheid van onze test en biedt een mogelijke aanpak om het risico op teratoomvorming te elimineren voorafgaand aan het gebruik van hPSC-afgeleide cellen in klinische toepassingen.

Omgekeerd laten we ook zien dat de TG30/GCTM-2 FACS-test kan worden gebruikt om een pluripotente celpopulatie op te halen met een hoog expressieniveau van deze twee oppervlakteantigenen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Eerdere studies hebben aangetoond dat TG30^Hi-GCTM-2^Hi cellen de hoogste correlatie vertonen met OCT4^hi expressie en het hoogste aantal hESC-achtige kolonies vormen^5,6,13,15. We redeneren daarom dat het pluripotentienetwerk wordt geactiveerd op de maximale niveaus in TG30^Hi-GCTM-2^Hi expressing cellen. Wij zijn van mening dat het gebruik van ons TG30/GCTM-2 FACS-protocol en het ophalen van P7 -TG30^Hi-GCTM-2^Hi) cellen grootschalige zuivering van verrijkte levende hESC-culturen mogelijk zou kunnen maken, als input voor differentiatietesten.

Concluderend tonen we hier de potentie van onze FACS-assays aan op basis van de gecombineerde expressie van oppervlakteantigenen TG30 en GCTM-2 voor zowel het zuiveren als verrijken van hESC's. Toekomstige studies met protocollen voor gerichte differentiatie van hPSC's zullen waarschijnlijk ook informatief zijn over deze potentialiteit. We zijn ons ervan bewust dat in sommige assays waarbij gedifferentieerde hESC-derivaten tijdelijk TG30 (CD9) of GCTM-2 uitdrukken, deze twee antilichamen mogelijk niet geschikt of voldoende zijn om pluripotente cellen op een bepaald moment in de test⁶uit een gedifferentieerde populatie te zuiveren . Daarom is er een voortdurende behoefte om nieuwe antilichamen te vinden die specifiek levende hESC's herkennen om de mogelijke beperking van kruisreactie met sommige gedifferentieerde celtypen te overwinnen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Long Name: Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Long Name: GlutaMAX supplement
Nonessential Amino Acids	Life Technologies	11140050	Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution
Mercaptoethanol	Life Technologies	21985023	Long Name: 2-Mercaptoethanol
DPBS	Life Technologies	14190250	Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium
TrypLE Express	Life Technologies	12604039	Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red
AF-488	Life Technologies	A21131	Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM
PE-anti IgG2a	Life Technologies	P21139	Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate
DMEM	Life Technologies	11965-092	Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water	Life Technologies	15230-089.	Long Name: Sterile Distilled Water
PI	SIGMA	P4864	Long Name: Propidium iodide solution
FBS	SIGMA	12203C	Long Name: Fetal Bovine Serum
Gelatin	SIGMA	G-1890	Long Name: Gelatin from porcine skin
Human FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm	Millipore	SCGPU02RE	Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
70 μm Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube	Becton Dickinson	352235	Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
5 ml Polystyrene round bottom test tube	Becton Dickinson	352054	Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile
IgG2a Isotype Control	Becton Dickinson	554126	Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control
IgM Isotype Control	Becton Dickinson	553472	Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
8-peaks calibration	Becton Dickinson	559123	Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks)
50 ml sterile Polypropylene tube	Greiner Bio-One	227261	Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask	Greiner Bio-One	658175	Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Long Name: TG30 Antibody, clone TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is
Tabel 4. Lijst van materialen en reagentia
FACS machine	Becton Dickinson		FACSVantage SE met FACSDiva-optie
Inverted microscope	Olympus		IX71
Tabel 5. Lijst van apparatuur.