Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Samenvatting

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Samenvatting

In de natuur, bacteriën zelden in een isolement bestaan, ze zijn in plaats omgeven door een divers scala van andere micro-organismen die de lokale omgeving te veranderen door het afscheiden van metabolieten. Deze metabolieten hebben het potentieel om de fysiologie en de differentiatie van hun microbiële buren moduleren en zullen waarschijnlijk een belangrijke rol in het opzetten en onderhouden van complexe microbiële gemeenschappen. We hebben een fluorescentie gebaseerde coculture scherm dergelijke chemisch gemedieerde microbiële interacties identificeren ontwikkeld. Het scherm omvat het combineren van een tl-transcriptionele reporter stam met milieu-microben op vaste media en waardoor de kolonies groeien in coculture. De fluorescerende transcriptionele reporter is ontworpen dat de gekozen bacteriestam fluoresceert wanneer het uitdrukken van een bepaald fenotype van belang (bijvoorbeeld biofilmvorming, sporulatie, virulentiefactor productie, enz..) Screening wordt uitgevoerd onder kweekomstandigheden where dit fenotype niet tot expressie (en dus de reporterstam typisch niet-fluorescerende). Wanneer een milieu microbe scheidt een metaboliet die dit fenotype activeert, diffundeert door de agar en activeert de fluorescente reporter construct. Hierdoor kan het inducerende-metaboliet producerende microbe te detecteren: zij zijn niet-fluorescerende kolonies meest proximaal van de fluorescerende kolonies. Zo, dit scherm kan de identificatie van milieuaspecten microben die dampdoorlatend metabolieten die een bepaalde fysiologische respons bij een reporter stam activeren produceren. Deze publicatie wordt beschreven hoe u: a) selecteer de juiste coculture screening voorwaarden, b) de voorbereiding van de verslaggever en milieu microben voor screening, c) voert de coculture scherm, d) isoleren vermeende inducerende organismen, en e) bevestigen hun activiteit in een tweede scherm. We ontwikkelden deze methode voor het screenen op bodemorganismen die biofilm matrix-productie in Bacillus subtilis activeren

Inleiding

Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen hoe de metabolieten die bacteriën afscheiden van invloed op de fysiologie en de ontwikkeling van naburige microben. Veel metabolieten zijn gekarakteriseerd op bioactieve effecten op andere microben. Twee goed beschreven voorbeelden omvatten antibiotica, die de groei van andere bacteriën remmen, en quorum sensing moleculen, die de globale genexpressie andere microben veranderen. Echter, bacteriën produceren vele andere kleine molecule natuurlijke producten die geen bekende bioactiviteiten ¹ hebben. Onze hypothese is dat bacteriën zijn geëvolueerd en bewaard de mogelijkheid om een ​​aantal van deze metabolieten omdat ze laten zij de cellulaire fysiologie van hun microbiële buren in het complexe microbiële gemeenschappen waarin meeste bacteriën bestaan ​​moduleren.

Bacillus subtilis celtypen

Wij hebben onze studies gericht op chemisch gemedieerde microbiële interacties die Bacil betrekkenlus subtilis. Dit is niet alleen vanwege zijn status als de Gram-positieve bacterie model en de daaruit voortvloeiende genetische tools beschikbaar voor de manipulatie ervan, maar ook vanwege zijn vermogen om te differentiëren in gekenmerkt celtypen. Voorbeelden omvatten cellen die: zwemmen, produceren de extracellulaire matrix die nodig is voor robuuste biofilmvorming, competent voor het opnemen van DNA uit de omgeving, en sporulerende onder andere ^2. Elk van deze celtypen expressie eigenschap transcriptionele regulon dat ze fysiologisch en / of fysisch verschillend van hun genetisch identiek siblings maakt. Onder vele groeiomstandigheden, meerdere celtypen samenleven als verschillende subpopulaties binnen een kolonie van B. subtilis cellen ^3. Hoewel veel soorten bacteriën analoog celtype heterogeniteit kunnen vertonen, dit fenomeen is bijzonder goed bestudeerd in B. subtilis.

In het bijzonder genen die zijn upregulated binnen elk van deze specifieke B. subtilis celtypen zijn geïdentificeerd. Identificeren van dergelijke genen opgereguleerd is essentieel voor het hier beschreven werk, omdat veel van deze microbiële fenotypes plaats moeilijk of onmogelijk direct waar te nemen. Bijvoorbeeld, we kunnen niet visueel een eigenschap detecteren zoals zwemmen op vaste (1,5%) agar platen, ook al is een subpopulatie van B. subtilis cellen produceren flagella onder die omstandigheden ^3. Een ander voorbeeld is biofilm matrix-productie. Matrix productie kan worden gevisualiseerd door kolonie morfologie (zo het resulteert in macroscopisch rimpelige kolonies), maar alleen op bepaalde groeimedium en na meerdere dagen groei ^4. Echter, door te weten welke genen opgereguleerd tijdens differentiatie, we kunnen transcriptionele reporters die als merkers voor cellulaire differentiatie in deze celtypes construeren.

Reporterconstructieproducten

Deze fluorescerende transcriptional reporters omvatten de promoters voor celtype specifieke genen besturen van de productie van een reportergen, bijvoorbeeld een fluorescerend eiwit. Voorbeelden zijn P _hag-YFP (voor het zwemmen cellen), P _TAPA-YFP (voor biofilm-matrix-producerende cellen), en P _SSPB-YFP (voor sporulerend cellen), waarbij P _x geeft de promotor regio voor gen-x. Deze reporter constructen geïntegreerd in een neutrale locus op chromosoom (figuur 1 en zie hieronder) zodat de natuurlijke regeling van het fenotype intact wordt gelaten. Echter, nu als een cel drukt dit fenotype, het drukt ook een fluorescerend eiwit. Dit zorgt voor een gemakkelijk gevisualiseerd uitlezen van de activering van bepaalde fenotypische gedrag, waardoor we het scherm voor microben die deze fysiologische respons te activeren. Hoewel dergelijke verslaggevers vaak worden gebruikt in de microbiologie, ze zijn niet in grote lijnen schermen om identif toegepasty metabole interacties tussen microben voordat deze methode werd beschreven ^5.

Er zijn een aantal belangrijke overwegingen bij het ontwerpen en bouwen van celtype-specifieke reporter stammen. Wij hebben uitsluitend transcriptionele fluorescente reporters gebruikt, hoewel andere soorten constructen zeker mogelijk. We ontmoedigen het gebruik van translationele fusies als merkers voor celtype differentiatie in ons scherm echter om twee redenen: 1) de wens om de natieve celtype-specifiek eiwit onverstoord verlaten, en 2) de erkenning dat een diffuse, cel- brede fluorescentie zal het makkelijker zijn op te sporen dan gelokaliseerde puncta binnen cellen (gemeen met translatiefusies).

Reportergen selectie

Na de beslissing om de transcriptie te gebruiken als een read-out, moet de reporter-gen worden geselecteerd (bijv. LacZ, fluorescentie, of luciferase). LacZ heeft het voordeel van de minst nodig specialeseerd materiaal te detecteren, maar er is een veel hogere waarschijnlijkheid van valse positieven onder milieu microben. In onze handen, het achtergrondniveau van Lac ⁺ organismen onder bodemmicroben was onbetaalbaar hoog (>> 10% van de bodem microben waren blauw (Lac ⁺⁾ op X-gal-platen; gegevens niet getoond). Het is mogelijk dat door titratie van de concentratie van X-gal in het medium, dit kan worden geoptimaliseerd om het gebruik van een X-gal reporter mogelijk, hoewel we dit niet geprobeerd. Luciferase met hoge gevoeligheid van detectie en de orthogonale reporter: er is bijna geen kans milieu microben inherent luminescerende. Toch vonden we het moeilijk om instrumenten te identificeren die onze instelling dat luminescentiedetectie toegestaan ​​over het hele Petri platen, zoals de meeste zijn ontworpen om alleen gelokaliseerde gebieden scannen in multi-well platen. Er kunnen ook complicaties visualiseren luminescerende kolonies op een wijze die ook toegestaan ​​gelijktijdige fysieke isolation induceren organismen. Hoewel het gebruik van vertrouwenspersonen kan dit mogelijk gemaakt hebben, we in plaats daarvan gekozen om fluorescerende transcriptionele verslaggevers, die zijn bewezen te werken in B. gebruiken subtilis, mits er afdoende gevoeligheid van detectie en lage valse positieve tarieven onder bodemorganismen, en mogen gebruiken van gemakkelijk beschikbare instrumentarium voor zowel visualisatie en isolatie procedures.

Fluorofoor selectie

De specifieke fluorofoor gekozen zal afhangen van uw bacteriën, agar groeimedium dat u gebruikt, en de specifieke fluorescentie filter stelt je beschikbaar hebt. Met onze instrumentatie, vonden wij dat zowel de B. subtilis kolonies zichzelf en de agar ze werden gekweekt op tentoongesteld minder achtergrond fluorescentie wanneer YFP (geel fluorescerend eiwit) filters werden gebruikt, het maken van die reporter superieur aan GFP (groen fluorescerend eiwit) in onze handen. Het codongebruik van fluorescente eiwittenvaak geoptimaliseerd voor eukaryoten, waardoor het belangrijk een fluorofoor ofwel bekend uit de literatuur te werken in bacteriën, of expliciet testen met een constitutieve promoter te selecteren. Een groot aantal steeds veranderende fluorescerend eiwit varianten beschikbaar ^6, die zijn beoordeeld in een aantal bronnen ^7,8, waarvan sommige leidraad uitdrukkelijk op het kiezen van een geschikt fluorescerend eiwit experiment ^9.

Promotor selectie

De keuze van een promotor zal grotendeels afhangen van uw mobiele type of fenotype van belang. Voor organismen zoals B. subtilis enkele celtype specifieke reporter genen in de literatuur vastgesteld. Voor andere bacteriestammen, onderzoekt microarray of transcriptie gegevens zal nodig zijn om informatie over welke genen in hoge mate gereguleerd onder de voorwaarden aan te bieden waar uw celtype van belang is gemanifesteerd. Een recente studie gecatalogiseerd de transcriptie van B. subtilis onder 104 verschillende groeiomstandigheden behulp tegelwerk microarrays ^10. Dit document geeft uitgebreide informatie over welke genen in hoge mate gereguleerd onder verschillende omstandigheden, die van onschatbare waarde is voor minder-goed gekarakteriseerd fenotypes.

In plaats van het in kaart brengen precieze promotor regio's voor elk gen van belang, we meestal gewoon gebruik maken van de reeks 200-500 bp stroomopwaarts van het gen als de promotor. De exacte volgorde lengte is afhankelijk van de genomische context: kortere gebieden worden gebruikt wanneer nodig om te voorkomen zowel stroomopwaarts coderende gebieden van aangrenzende open leesramen.

Neutrale loci en integratie

Hoe te handhaven de reporterconstruct in uw bacteriestam wordt de laatste vraag in het ontwerpen van een fluorescerende transcriptionele reporter stam. In bacteriën, worden genen van belang regelmatig onderhoudenop plasmiden antibiotische selectie. Echter, kan het niet mogelijk zijn om antibiotica te gebruiken tijdens coculture zonder het doden van de milieu-microben. Als plasmiden stabiel gehandhaafd in bacteriën, kan het mogelijk zijn de bacteriën groeien met een reporter-plasmide gedragen in aanwezigheid van antibiotica aan de reporter bereiden voor screening, en vervolgens elimineren antibiotica tijdens de co-cultuur zich in de hoop dat het plasmide zal voldoende gehandhaafd om voor fluorescentie. Echter, als plasmiden gemakkelijk verloren gaan in je bacterie, of verloren gaan onder stress omstandigheden, zal dit geen haalbare optie. In veel gevallen zal de beste oplossing voor de reporter construct geïntegreerd op het bacteriële chromosoom, die stabiele handhaving van de reporter kan zelfs in de afwezigheid van selectie. Om de integratie van de normale expressie of regulatie van uw gen van belang niet te verstoren, adviseren wij in een buitenbaarmoederlijke website integreren op het chromosoom dat can fungeren als een "neutrale locus." In B. subtilis deze integratie sites zijn genen die - wanneer veranderd - brengen een fenotype in bepaalde minimale media (waardoor integranten kunnen worden geïdentificeerd zonder antibioticum selectie), nog niet de groei of sporulatie prijzen in rijke media niet veranderen, en omvatten dergelijke genen als amyE, LACA, thrC, pyrD, gltA en saca (transporteren het vermogen om zetmeel te gebruiken, β-galactosiden, threonine, uracil, glutamaat en sucrose, respectievelijk) ^11-13.

Hoewel integratie in deze genen op betrouwbare wijze zijn gebruikt voor vele jaren B. subtilis (met name amyE en laca), kunnen soortgelijke kennis niet van genen in vele andere bacteriële soorten. Het gebruik van fagen hechtingsplaatsen zijn geweldig alternatief voor neutrale chromosoomintegratie websites: veel soortspecifieke ^14-16, alsook van de algemene integratie sites zoals de Tn7 aanhechtingsplaats (att Tn7) hebbengeïdentificeerd en gebruikt voor gen-inserties in vele bacteriesoorten ^17,18.

Milieu-microben

We maken gebruik van de bodem als een directe bron van milieu-microben voor onze coculture scherm. De bodem bevat een grote diversiteit aan microben, en veel van deze organismen rijke bron van natuurlijke producten. Door het gebruik van vloeibare suspensies van de bodem rechtstreeks op platen geplaatst met onze fluorescerende transcriptionele reporter stam (zonder voorafgaande isolatie van bacteriën uit de bodem), hebben we een aanzienlijke vereenvoudiging van de experimentele benadering. De bodem kan ofwel onmiddellijk na de oogst of bij -80 ° C voor toekomstig gebruik worden ingevroren. Onmiddellijk gebruik heeft het voordeel dat een grotere diversiteit aan microben potentieel kan worden gekweekt, ook die welke niet overleeft goed bevriezen. Het nadeel dat de concentratie van kweekbare bodemleven uit deze monsters onbekend is, waardoor het aantal scherm platen die worden gebruikt. Delayed gebruik heeft het voordeel dat de cfu / ml voor elke bron bodem vooraf kan worden bepaald, waardoor een optimale aantal kolonies worden gekweekt op elke zeefplaat. Het vereist echter dat de bodem organismen bestand zijn tegen bevriezing.

Merk op dat diversificatie van de inductor zwembad wordt onderzocht (dwz de bodem bronnen) lijkt effectiever te zijn op nieuwe interspecies interacties te identificeren dan een grondige screening op dezelfde grond: grotere fylogenetische diversiteit werd waargenomen in de klappen die in onze matrix-inductie scherm extra bodem bronnen werden onderzocht in plaats van screening dezelfde grond bronnen grondiger (EA Shank en R. Kolter, Harvard Medical School, niet gepubliceerde resultaten).

Overzicht

De hier beschreven benadering is eenvoudig qua technische eisen. Het gaat om: 1) het construeren van een fluorescerende transcriptionele reporter in B. subtilis of eenandere bacteriële species plaats, 2) het identificeren van voorwaarden waaronder de reporter niet geactiveerd is, 3) het bereiden van porties van deze reporter stam en organismen worden gescreend (in ons geval de bodem, maar andere bronnen kunnen worden gebruikt in plaats), 4) het mengen van deze twee microben op vaste media, 5) het identificeren en isoleren vermeende inducerende organismen, en 6) bevestigt dat deze organismen inderdaad dit fenotype in een secundaire screening kan activeren. Eenmaal geïdentificeerd, deze organismen en hun metabolieten geven ons met chemische hulpmiddelen om bacteriële gedrag te moduleren, om bacteriële fysiologie en microbiële interacties te bestuderen, en om potentieel fungeren als nieuwe steigers voor toekomstige therapeutische verbindingen.

Protocol

1. Selecteer een Reporter Gene en Construct een TL Transcriptionele Reporter

Voor B. subtilis:

1. Zie de Jupiter artikel in referentie ¹⁹ voor een protocol beschrijft de bouw van fluorescerende transcriptie verslaggevers in Bacillus subtilis.

Voor andere bacteriesoorten:

1. Vaststellen van een gen dat wordt gereguleerd tijdens de fysiologische reactie plaats. Dit kan worden gebaseerd op bestaande literatuur of transcriptionele analyse van de microbe onder bijzondere omstandigheden.
2. Construeer een fluorescerende transcriptionele reporter voor dit gen om op te treden als een graadmeter voor de verandering in fenotype. Dit construct moet de promotor van het gereguleerd gen besturen van de productie van een geschikt fluorescerend eiwit (zie figuur 1).
3. Integreer dit construct in een neutrale locus op het chromosoom. Dit zorgt ervoor dat inheemse regulatie van het gen van belang niet verstoord, en vermijdt de noodzaak plasmideselectie mechanismen (bv. antibiotica) die kunnen interfereren met de groei van microben milieu.

2. Bepalen Coculture Voorwaarden

Voor B. subtilis P _TAPA-YFP reporter:

1. Met 0,1 x LB, Lennox (1 g trypton, 0,5 g gistextract, 0,5 g NaCl per liter) medium voor deze verslaggever, omdat B. subtilis matrix productie minimaal op Luria Broth ^20. Dit medium kan B. subtilis kolonies groeien tot submillimeter maar waarneembare grootte, terwijl diverse taxa van de bodem om te groeien ^5.
2. Omvatten 100 mM MOPS buffer om mogelijke pH-veranderingen te minimaliseren.

Voor andere bacteriesoorten:

1. Gebruik gepubliceerde transcriptie gegevens of empirisch te toetsen diverse kweekomstandigheden naar een situatie waarin de microbe groeit identificeren maar de activation van de fluorescerende reporter is verwaarloosbaar (om de activering te worden gedetecteerd wanneer de verslaggever stam wordt gekweekt in coculture met het induceren van microben.)
2. Gebruik een medium met een laag gehalte aan nutriënten (vergeleken met traditioneel rich microbiologische media) bij milieurisico microben oligotrofe omgevingen (zoals grond), aangezien veel oligotrofe bacteriën groeien niet wanneer voorgesteld met hoge voedingsomstandigheden ^21. Een laag voedingsbodem vermindert ook kolonie grootte, het verhogen van de doorvoer van het scherm.
3. Selecteer een medium met een lage achtergrond fluorescentie en goede optische helderheid.
4. Optimaliseer groei temperatuur, zodat zowel de verslaggever stam en milieu microben tegelijkertijd groeien.
5. Overweeg het toevoegen van een buffermiddel. Het gebruik van buffer in de platen de mogelijkheid detecteren pH-gemedieerde veranderingen in de fysiologie ²² verminderen, tenzij deze interacties plaats.

3. Bereid Reporter Hoeveelheden

Voor B. subtilis P _TAPA-YFP reporter:

1. Streak reporter stam van -80 ° C ingevroren voorraad op een frisse LB plaat met een steriele tandenstoker of applicator stick.
2. Groeien 's nachts bij 30 ° C.
3. Voer seriële verdunningen in vloeibare cultuur achtergrond fluorescentie als gevolg van groei op een vast medium te minimaliseren:
   1. Inoculeer een 5 ml vloeibare cultuur van LB en te groeien met schudden bij 37 ° C.
   2. Wanneer de cultuur een OD ₆₀₀ ~ 0,6 bereikt, verdunnen in 5 ml vers LB tot een OD ₆₀₀ van 0.02.
   3. Groeien bij 37 ° C onder schudden totdat opnieuw culturen bereikt _OD600 -0,6.
   4. Herhaal seriële groei verdunningen in totaal 3x.
   5. Laat laatste reeksverdunning cultuur groeien tot OD ₆₀₀ ~ 0.4.
4. Glycerol toevoegen aan 15-20%.
5. Aliquot 50-200 ul in 0,5 ml microfugebuizen en invriezen bij -80 ° C.
6. Make gelijkwaardige porties voor de niet-fluorescerende ouder stam van de reporter (ze zullen tijdens de tweede test nodig zijn).

Voor andere bacteriesoorten:

1. Gebruik cellen die een lage achtergrond fluorescentie (dat wil zeggen groeien onder omstandigheden met weinig expressie van de promoter in de reporter).
2. Merk en monsters die bekende kve / ml (kolonievormende eenheden per ml) van de reporter stam te bevriezen, zodat een voldoende aantal kolonies kan worden geteeld op elke coculture scherm typeplaatje (zie paragraaf hierboven voor meer informatie).
3. Gelijkwaardige porties voor de niet-fluorescerende ouderlijke stam (ze zullen tijdens de tweede test nodig zijn).

4. Verkrijgen bodemmonsters

1. Verzamel bodem in steriele conische buizen of steriele zakken met behulp van een spatel, gooi de bovenste 0,5 cm van de blootgestelde oppervlakte bodem.
2. Voeg steriele zoutoplossing (0,85% NaCl) in een verhouding van 10 ml per 1 gvan de bodem om een ​​bodem slurry te maken.
3. Selecteer een methode om bacteriën te verjagen uit bodemdeeltjes: a) direct gebruik van verse monster of b) vertraagd gebruik na het bevriezen van het monster.
   1. Voor onmiddellijk gebruik, vortex slurry gedurende 1 minuut.
   2. Voor vertraagde gebruik, mengen bodem drijfmest in de blender gedurende drie 1 min cycli, het plaatsen van de mengbeker op ijs gedurende 1 minuut rust tussen mengen cycli.
4. Laat bodem drijfmest genoegen ~ 1 min.
5. Schuif bovenste waterlaag naar een nieuwe buis.
6. Glycerol In een eindconcentratie van 15-20%.
7. Aliquot 50-200 ul in 0,5 ml microfugebuizen en invriezen bij -80 ° C.

5. Bepaal kve / ml Bevroren Reporter en bodem Fracties

1. Ontdooi een bevroren bodem en verslaggever portie. Bodemmicroben kan worden ontdooid op ijs. Omdat B. subtilis lyses bij 4 ° C, moeten deze monsters snel ontdooid bij kamertemperatuur om de tijd bij lage temperatuur te minimaliseren.
2. Maak twee repliceren serial verdunningen (10 ^-8) in 0,1 x LB of andere isotone buffer.
3. Plaat 5 pl spots van elke seriële verdunning op agar platen van hetzelfde medium dat wordt gebruikt voor co-kweek screening.
4. Groeien bij kamertemperatuur (of de temperatuur die gaat gebruiken voor screening).
5. De volgende dag, tel het aantal kolonies op elke plek en bereken cfu / ml van elk van de bevroren monsters.

6. Bevestig Aliquoteren Concentraties voor Spread Screen Plates

1. Ontdooi een bevroren hoeveelheid zoals in stap 5.1.
2. Verdun tot 1 x 10 ^5, 2,5 x 10 ^5, 5 x 10 ^5, 1 x 10 ^6, en 2,5 x 10 ⁷ cfu / ml.
3. Voeg 50 ul plek van elke verdunning centrum van afzonderlijke platen. Deze platen zouden opleveren met de berekende optimum van 25.000 kolonies per plaat, en 2 - en 5 - maal minder, waardoor de beste werkelijke verdunning te bepalen.
4. Voeg ongeveer 20 steriele glazen (3 mm) kralen doorze zachtjes tikken op de plaat. Beads een meer gelijkmatige verdeling van kolonies over de plaat dan een gebogen glazen strooier doet.
5. Verspreid cellen door het houden van platen op de werkbank en schudden ze heen en weer, te draaien terwijl u werkt, totdat het vocht is opgenomen. Ga niet verder schudden de kralen zodra de plaat droog is, anders zal beginnen om de bacteriën te doden.
6. Flip platen over en gooi kralen in afval bekerglas met ethanol.
7. Laat platen te kweken voor de tijd van je test (bijvoorbeeld 24 uur) op de juiste temperatuur voor uw test (bv. 24 ° C / RT).
8. Met behulp van een dissectie stereoscoop, tel het aantal kolonies in twee of meer gezichtsveld.
9. Bereken het aantal kolonies per gebied en bepalen hoeveel kolonies op elke plaat.
10. Pas toekomst verdunningen als dat nodig is. Het werkelijke aantal kolonies is niet zo belangrijk als hetzelfde getal op elke vergelijkbare zeefplaat.

7. Bereid Coculture Plates

1. Dooi reporter hoeveelheid (en de bodem monster indien bevroren) als in stap 5.1.
2. Verdunnen reporter (aan concentraties geoptimaliseerd in hoofdstuk 6) in 0,1 x LB of andere lage voedingsstof, isotone oplossing.
   1. Voor bevroren grond: Verdun tot concentratie geoptimaliseerd in paragraaf 6 in 0,1 x LB of andere lage voedingsstof, isotone oplossing.
   2. Voor frisse bodem: Voeg verdunningen van verse grond drijfmest, gebaseerd op voorspelling dat de cfu / ml van de bodem slurry kan variëren van 10 ^-4 tot 10 ^-9 cfu / ml.
3. Spot 50 ul van de bodem en reporter verdunningen op midden van coculture scherm plaat. Ook plaat bodem alleen en verslaggever alleen als controles.
4. Verspreid met glaskralen zoals beschreven in stap 6,4-6,6.
5. Als er bekend kweekomstandigheden die de fluorescente reporter, strook of plaat activeert de reporter onder deze omstandigheden en worden gebruikt als een positieve controle bij de screening.
6. Incubeer bij 24 ° C gedurende 24-28 uur (of afhankelijk van uw reporter / test)

8. Scherm Coculture Platen voor Fluorescentie

1. Met behulp van helderveld verlichting, focus je stereoscoop zodat de kolonies zijn scherp.
2. Kijk naar de enige-bodem platen om te bepalen of uw grondmonster kolonies heeft Autofluorescente. Als dat zo is, kan deze grond resulteren in een hoog aantal valse meldingen (met een gelijktijdige verhoging van de secundaire screening).
   1. Gebruik een hoge verhouding van reporter: bodem in coculture platen om de kans dat een inductor wordt omringd door meerdere reporter kolonies, waardoor de kans zullen zij worden gedetecteerd als vals-positieven (figuur 2) te verhogen.
   2. Gebruik een ander fluorescerend eiwit (die uitzendt in een ander kanaal).
3. Bepaal de assay timing. Voor de meeste nieuwe reporters, de timing van de potentiële inductie onbekend, en dus moet empirisch worden bepaald.
   1. Begin screenen op fluorescentie zodra kolonies duidelijk zichtbaar met het ontleden stereoscoop (vergroting 30X ~) en verder onderzoek van de platen periodiek tot groei is beëindigd en / of achtergrondfluorescentie te hoog.
   2. Zodra het tijdvenster van potentiële inductie wordt bepaald voor een bepaalde verslaggever, moet het gelijk voor alle coculture platen die deze verslaggever, de vereenvoudiging van het toezicht op het scherm platen. Voor de B. subtilis P _TAPA-YFP verslaggever, het juiste moment om de platen te onderzoeken is tussen 24-28 uur na plating de cellen, want de B. subtilis P _SSPB-YFP reporter is tussen 26-32 uur groei.
4. Haal alles uit uw fluorescentie gevoeligheid:
   1. Zorg ervoor dat uw fluorescentie ontleden scope is in een donkere kamer of omringd door verduisterende gordijnen. Inductie zal waarschijnlijk minder intens dan een constitutief geproduceerd FP zijn en vereist een grotere gevoeligheidteit te detecteren.
   2. Wacht tot de fluorescentie lamp te stabiliseren en uw ogen aan te passen aan de duisternis voordat u fluorescentie detecteren van uw coculture platen (minstens 1-2 min).
5. Met behulp van een positieve controle (als je die hebt), zorgen ervoor dat de vergroting die u gebruikt kunt u fluorescentie te detecteren. De vergroting is meestal het beste als uw gezichtsveld ligt op ongeveer 30-50x je typische kolonie diameter (200-400X).
6. Schakel het felle licht en open de sluiter voor uw fluorescentie.
7. Nadat uw ogen aangepast aan de duisternis, langzaam de plaat heen en weer over uw gezichtsveld, op zoek naar lichtpuntjes.
   1. Begin met de bovenkant van de plaat en gebruik een zigzagpatroon op de plaat side-to-side bewegen als je beweegt naar de onderkant van de plaat.
   2. Oefen het verplaatsen van de plaat in helderveld om een ​​gevoel voor hoe langzaam om te verhuizen naar plaat te krijgen, en om zeker te zijn dat u over de gehele surgeconfronteerd gebied.
   3. Beweeg de plaat langzaam genoeg dat de koloniën niet wazig. Het is beter om het oppervlak oversample plaats missen gebieden.
   4. Na een volledige sweep, zet de plaat 90 ° en herhaal. Menselijke ogen zijn opvallend goed in het detecteren zelfs zwakke fluorescentie door middel van deze methode.
8. Als je fluorescentie te detecteren, stoppen met bewegen de plaat en ga terug en vind het fluorescerende gebied.
9. Door de helderveld langzaam, bepalen of de fluorescentie geassocieerd met een bacteriële kolonie (en niet autofluorescente bodem detritus of media componenten). Dan is de niet-fluorescerende kolonies proximaal van de fluorescerende kolonie zijn vermeende inducerende organismen.

9. Isoleer Vermeende opwekken Organismen

1. Eenmaal geïnduceerd (TL) kolonies geïdentificeerd, isoleren die kolonies die het inducerende verbindingen.
   1. Bij een voldoende hoge concentratie reporter kolonies groeien op de plaat(> 0,5:1 verslaggever: bodem kve), zal de vermeende inducerende kolonies worden omringd door meerdere fluorescerende kolonies (nogmaals, zie figuur 2).
   2. Wanneer de complexiteit van de co-cultuur groei maakt het dubbelzinnige die kolonie de inductor, isoleren meerdere mogelijkheden inducerende kolonies voor daaropvolgende testen in het secundaire scherm.
2. Lokaliseer de koloniën u wilt ophalen in het centrum van het gezichtsveld.
   1. Als ze dicht bij de rand van de plaat, draai de plaat zodat de lip van de plaat is weg van je dominante hand (dwz als u rechtshandig bent, zet de lip van de plaat aan de linkerkant). Hiermee kunt u naar de koloniën te benaderen op een lage hoek, die de nauwkeurigheid van je plukken verbetert.
3. Plaats verse platen om streak de vermeende inducerende organismen op in de buurt, evenals een afval beker te gebruiken tips weggooien in.
4. Het verlaten van de fluorescentie lamp op, zet het heldere licht langzaamop, zodat je kunnen identificeren (door vorm en positie), de tl-kolonie en de omliggende vermeende inducerende organismen zal zijn. Het kan nodig zijn om heen en weer te gaan met het licht een paar keer te kunnen naar de koloniën u wilt halen als er geen fluorescentie en alleen helder licht te identificeren.
5. Gebruik een glazen staaf (200 mm lang mm diameter x 5) op te halen een steriele, rond 200 ul gel-lading-punt en houd hem als een potlood. Dit is het plukken tool die je zal gebruiken om individuele kolonies te isoleren.
6. Rest je uiterlijke palm tegen het podium te stabiliseren op het werkvlak. Plaats uw andere hand op de innerlijke, duim zijkant van je hand naar je picking gereedschap stabiliseren.
7. Indien nodig, flip weer tussen weergaven fluorescentie en helderveld naar de koloniën u wilt ophalen identificeren.
8. Houden van de pipet tip boven de platen, beweeg het in uw gezichtsveld en centreren boven de kolonie u wilt plukken. De tip zal onscherp zijn.
9. Met behulp van de buitenste rand van je hand (die rust op de microscoop podium of werkblad), draai de pipet tip langzaam naar de kolonie om geplukt te worden. Raak het zeer licht, proberen te minimaliseren hoeveel andere kolonies de tip contacten.
10. Zonder te draaien het plukken gereedschap, streak op een gedeelte van een verse plaat. Verspreid met een zachte touch aan kerving voorkomen dat de agar. Door het aantal cellen overgebracht van deze methode is vrij klein (de kolonies veel kleiner dan typisch gemanipuleerd), een enkele continue strook resulteren in geïsoleerde kolonies.
11. Herhaal dit proces met de andere vermeende inducerende organismen.
12. Incubeer de platen bij 24 ° C (of de temperatuur van uw assay).

10. Streak Vermeende opwekken Organismen naar Geïsoleerde Single kolonies te verkrijgen

1. Met behulp van een stereoscoop, bepalen - op basis van kolonie structuur of de morfologie - of zijn er verschillende soorten kolonie bevat binnen elk van uw vermeende geplukt inducing organismen.
   1. Kijk naar de koloniën met behulp van een fase waarin je de kolonies van zowel boven als van beneden kan verlichten om potentiële kolonie verschillen te detecteren.
2. Restreak elk verschillend morfotype op een verse plaat en incubeer tot gegroeid.
3. Restreak nog een keer en laat groeien. Als verschillende morphotypes aanhouden, blijven restreak naar zuiverheid.

11. Hertest Vermeende opwekken Organismen in tweede scherm

1. Hertest alle vermeende induceren van organismen in een tweede scherm om te bepalen welke zijn het activeren van de tl-transcriptionele reporter. Het secundaire scherm bestaat uit een grasveld van microkolonies van de fluorescerende transcriptionele reporter stam, samen met controle platen, waarop vermeende inducerende organismen worden gepatcht of gevlekt.
2. Opzetten van drie identieke borden: een met een microkolonie gazon van het fluorescerende transcriptionele reporter stam (bij dezelfde concentratie eens werd gebruikt tijdens coculture screening), een met een microkolonie gazon van het wild-type ouderlijke stam zonder fluorescentie-reporter, en een die geen gazon.
   1. Markeer de bovenkant van de achterkant van elke plaat aan de plaat oriëntatie bepalen.
   2. Voeg positionele merkers voor de patches / vlekken, tot tien vermeende inducerende organismen worden getest op elke set platen (figuur 3).
   3. Dooi gazon porties (verslaggever en niet-fluorescerende ouderlijke stam) als in stap 5.1.
   4. Spreid 50 ui van een verdunning 5 x 10 ⁵ cfu / ml op gazon platen (of andere geoptimaliseerde verdunningen) met steriele kralen als in stap 6.4.
   5. Laat platen droog.
3. Patch of spot vermeende inducerende organismen:
   1. Selecteer patching als een eenvoudiger en snellere benadering is gewenst en is het aanvaardbaar om een ​​minder nauwkeurige aantal cellen gedeponeerd zijn. Patch:
      1. Raak een steriele tandenstoker om de kolonie te testen - niet pikken alle cellen.
      2. Patch (een kleine streep) op de lege bord.
      3. Herhaal patch met verse tandenstoker op reporter plaat.
      4. Herhaal patch met verse tandenstoker op controle bord.
   2. Selecteer spotten als een kwantitatieve en reproduceerbare benadering gewenst. Spotting kan het aantal afgezette cellen worden genormaliseerd (zie referentie 5 voor volledige details), en laat de relatieve sterkte van de verschillende inducerende organismen te vergelijken. Te herkennen:
      1. Resuspendeer vermeende inducerende organismen in 1 ml vloeibare media in een steriele plastic cuvet.
      2. Neem de OD ₆₀₀ van de resuspensions.
      3. Met behulp van de formule X = 250 ÷ (OD _600-0,5), voeg de volume X voor elke resuspensie tot 500 ul van vloeibaar medium om een oplossing te krijgen met een OD ₆₀₀ van 0,5. Deze methode vereenvoudigt de vereiste pipetteerstappen bij het uitvoeren van meerdere verdunningen te normaliseren OD's omdat je hetzelfde volume (50 kunt gebruiken0 pi) voor al uw verdunners.
      4. Spot 1 pi van elke OD-genormaliseerd resuspensie aan elk van de drie platen.
4. Laten groeien bij 24 ° C gedurende 24-28 uur (of afhankelijk van uw reporter / test).
5. Gebruik de fluorescerende dissectiemicroscoop om vermeende inducerende organismen die uw fluorescerende reporter stam maar niet uw ouderlijk toezicht stam activeren identificeren. Deze isolaten zijn uw positieve klappen - de milieu-microben die verbindingen die je fenotype van belang veroorzaken afscheiden.

Resultaten

Dit scherm werd gebruikt voor bodemorganismen identificeren afscheidende verbindingen die de fysiologie van B. veranderen subtilis. De hier beschreven resultaten richten op de matrix producerende cel type B. subtilis, die de eiwitten en exopolysaccharideproduktie die nodig zijn voor robuuste biofilmvorming in deze bacterie produceert. Wij selecteerden de promotor van het TAPA-sipW-TASA operon voor onze fluorescerende reporter construct (P _TAPA-YFP). Dit operon code...

Discussie

Een van de inherente beperkingen van dit protocol is doordat het op de cultivability van microbiële organismen. Zoals is goed gedocumenteerd ²⁴ meeste microbiële leven op aarde kan (nog) niet worden gekweekt onder kweekomstandigheden onderzocht om date. Zo zal een groot aantal interacties tussen micro-organismen die zich voordoen in een natuurlijke omgeving onopgemerkt gebruik van deze aanpak. Aangezien onze wens is om niet alleen te identificeren waarin dergelijke wisselwerkingen, maar bestuderen ook mechani...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Spectrophotometer			Elk spectrofotometer dat in staat is om OD600 absorptiewaarden te meten.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternatieve mediabronnen kunnen nodig zijn.
Glazen bolletjes, 3 mm	VWR	26396-508
Gel laadtips, rond	VWR	29442-666
Glazen staafjes	VWR	59060-069
Fluorescentie dissectie stereoscoop	Zeiss	N/A	De auteur gebruikte een Zeiss Stemi SV6 dissectie stereoscoop met een EXFO X-cite 120 fluorescente lichtbron, een long-pass YFP filter cube, een achromatisch 0.63X objectief, 10X oogstukken, en een Axio HRC HR digitale camera. Het meeste screenen werd gedaan met de focusring op 2.0-3.2X. Elke dissectie stereoscoop met fluorescentie mogelijkheden is prima, op voorwaarde dat je de juiste filters hebt voor de FP die je gebruikt. Het is het beste als er een sluiter is die je gemakkelijk laat schakelen tussen brightfield en fluorescense, evenals een stage die verlichting van boven en onder toelaat. Als je afbeeldingen wilt vastleggen, is een bijgevoegde camera ook noodzakelijk.