Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50926

⸱

26 december 2013

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van hele-cel MALDI-TOF massaspectrometrie op eukaryote cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van deze techniek door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen te analyseren als reactie op hun micro-omgeving.

Samenvatting

MALDI-TOF is een veelgebruikte massaspectrometrietechniek in de chemie en biochemie. Het is ook toegepast in de geneeskunde om moleculen en biomarkers te identificeren. Recentelijk is het in de microbiologie gebruikt voor de routine-identificatie van bacteriën die zijn gekweekt uit klinische monsters, zonder voorbereidings- of fractioneringsstappen. Wij en anderen hebben deze whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrietechniek met succes toegepast op eukaryote cellen. Huidige toepassingen variëren van identificatie van celtypen tot kwaliteitscontrole-evaluatie van celcultuur en diagnostische toepassingen. Hier beschrijven we het gebruik ervan om de verschillende polarisatiefenotypen van macrofagen in reactie op cytokines of hittedode bacteriën te onderzoeken. Het maakte de identificatie mogelijk van macrofaagspecifieke vingerafdrukken die representatief zijn voor de diversiteit van proteomische reacties van macrofagen. Deze toepassing illustreert de nauwkeurigheid en eenvoud van de methode. Het protocol dat we hier beschreven hebben, kan nuttig zijn voor het bestuderen van de immuunrespons van de gastheer in pathologische omstandigheden of kan worden uitgebreid tot bredere diagnostische toepassingen.

Inleiding

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) is een populaire massaspectrometrietechniek om biologische monsters te bestuderen. Het gebruik van een laserstraal en een energie-absorberende matrix maakt een zachte ionisatieproces mogelijk: de verdamping en ontstaan van grote, meestal enkelvoudig geladen biomoleculen. Dit proces wordt desorbentie/ionisatie genoemd, wat het acroniem MALDI rechtvaardigt. Deze ionen worden vervolgens versneld door het aanbrengen van spanning en komen in een TOF-analysator terecht, die de scheiding van deze ionen en de kwantificering van hun respectieve massa's mogelijk maakt1.

MALDI-TOF MS is uitgebreid gebruikt in de biologie, chemie en geneeskunde om moleculen en biomarkers2-4 te identificeren of post-translationele modificaties op eiwitten5,6te monitoren7,8. Recentelijk hebben verschillende groepen MALDI-TOF MS toegepast op de identificatie van micro-organismen uit klinische monsters. Deze microbiologische toepassing wordt nu routinematig gebruikt in klinische omgevingen. Whole cell MALDI-TOF heeft veel voordelen in vergelijking met klassieke toepassingen van MALDI-TOF MS. Monsters met hele cellen worden direct verwerkt, waardoor tijdrovende stappen om grote hoeveelheden materiaal te fractioneren of te scheiden worden vermeden. Bovendien is er geen karakterisering van de verschillende pieken nodig: het hele spectrum wordt beschouwd als een vingerafdruk van het monster, en matching-algoritmen vergelijken het geteste spectrum met een database van referentiespectra.

Wij en anderen hebben deze whole-cell analysetechniek toegepast op eukaryotische cellen. Er kunnen veel toepassingen van deze techniek worden afgeleid: (1) identificeren van de belangrijkste celtypen uit een gemengd monster9-11; (2) beoordelen van de levensvatbaarheid van celculturen in de tijd (inclusief kwaliteitscontrole in industriële toepassingen)12; (3) monitoren van activeringstoestanden van een enkele celtype13; (4) beoordelen van de maligne transformatie van een klinisch monster14,15.

Hier beschrijven we het gebruik van whole-cell MALDI-TOF MS om de verschillende polarisatiefenotypes van macrofagen in reactie op cytokinen of hitte-gedode bacteriën te verkennen. Macrofagen spelen een centrale rol in de immuunrespons op microbiële pathogenen. Ze detecteren infectieuze agentia in de weefsels via patroonherkenningreceptoren die in staat zijn om geconserveerde microbiële patronen te detecteren, zoals lipopolysaccharide (LPS)16. Macrofagen zijn professionele antigeen-presenterende cellen die interageren met T-cellen om de adaptieve immuunrespons op te starten. T-cellen beïnvloeden macrofagen door cytokinen af te geven die de microbiëcide activiteit van macrofagen versterken of reguleren. Door analogie met de Th1/Th2 lymfocytpolarisatie zijn inflammatoire, microbiëcide en tumoricide macrofagen geclassificeerd als M1 macrofagen en immunoregulator macrofagen als M2 macrofagen17-19. De term M1 verwijst naar de klassieke activering van macrofagen door type I cytokinen, zoals interferon (IFN)-γ en tumornecrosefactor (TNF), of bacteriële producten, zoals LPS18,20-23, terwijl macrofagen geactiveerd door alternatieve routes (interleukine (IL)-4, IL-10, Transforming Growth Factor-β1 worden beschouwd als M2 macrofagen19,24,25. De hoge fenotypische en functionele plasticiteit van macrofagen in reactie op hun micro-omgeving maakt deze macrofagen bruikbaar om subtiele veranderingen te analyseren door een MALDI-TOF MS-aanpak.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

In het huidige protocol wordt de whole-cell MALDI-TOF-techniek gebruikt om een massaspectrum te verkrijgen dat wordt beschouwd als een vingerafdruk van het monster. Een bio-informatica-analyse maakte de vergelijking en classificatie van deze vingerafdrukken mogelijk. Er waren drie hoofdonderdelen in dit protocol:

  1. De voorbereiding van de biologische monsters: controlemacrofagen en macrofagen gestimuleerd met verschillende agonisten.
  2. De analyse van elk type monster met technische replica's door whole-cell MALDI-TOF MS.
  3. De bio-informatica-analyse van ruwe gegevens.

Bereid steriele oplossingen voor voor celisolatie en -kweek. Bereid alle reagentia voor en bewaar ze bij 4 °C

1. Bereiding van menselijke monocyten

  1. Bereid het celkweekmedium. Voeg 55 ml van humaan serum AB+ of foetaal bovien serum (FBS) en 5 ml van de antibioticumoplossing (penicilline op 10.000 UI/ml en streptomycine op 10.000 μg/ml; uiteindelijke concentratie van 100 UI/ml voor penicilline en 100 μg/ml voor streptomycine) toe aan RPMI 1640 medium (500 ml).
    1. Isoleer perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) uit leukopacks (leukeconcentraten).
      1. Bereid 50 ml buizen met 15 ml Ficoll. Verdun het bloed in zoutoplossing (vol/vol, 1/10). Deponeer 30 ml verdunde PBMC's op Ficoll zoals eerder beschreven26.
      2. Centrifugeer bij 700 x g gedurende 20 min. Herstel PBMC's op het grensvlak tussen Ficoll (dichtheid van 1,077 g/ml) en verdund plasma. Verdun PBMC's in kweekmedium en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
    2. Bereid CD14+ monocyten uit PBMC's met behulp van magnetische kralen gecoat met anti-CD14-antilichamen.
      Opmerking: Houd producten en cellen bij 4 °C totdat monocyten zijn verkregen.
      1. Bereid een loopbuffer voor die bestaat uit fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2, 0,5% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA).
      2. Los voorzichtig pellet PBMC's (107 cellen per test) op in 80 μl loopbuffer.
      3. Voeg 20 μl CD14 MicroBeads toe aan PBMC's. Meng en incubeer PBMC's gedurende 15 min. Was PBMC's met 5 ml loopbuffer en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Los voorzichtig pellet PBMC's op in 500 μl loopbuffer voor 108 PBMC's.
        Opmerking: gebruik 500 μl loopbuffer voor PBMC-concentraties lager dan 108 PBMC's.
      4. Ga door met magnetische scheiding.
        Opmerking: voor minder dan 2 x 108 PBMC's, gebruik MS-kolom; voor meer dan 2 x 108 PBMC's en minder dan 2 x 109 PBMC's, gebruik LS-kolom.
      5. Spoel voorkolom en kolom met loopbuffer (500 μl voor MS-kolom of 3 ml voor LS-kolom). Voeg PBMC's toe aan de voorkolom (wacht tot ongelabelde cellen door de kolom gaan). Spoel 3 keer met loopbuffer (500 μl voor MS-kolom of 3 ml voor LS-kolom). Verwijder de voorkolom.
      6. Plaats de kolom op 15 ml buizen. Voeg loopbuffer toe (1 ml voor MS-kolom of 5 ml voor LS-kolom) op de kolom en elueer CD14+ cellen door druk uit te oefenen op de kolom.
      7. Centrifugeer het eluaat bij 300 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg. Was het monocyten-pellet met 10 ml kweekmedium.
        Opmerking: Analyseer de zuiverheid van de monocytenvoorbereiding met behulp van anti-CD14-antilichamen en stromcytometrie (klassiek hoger dan 95%).
  2. Differentiatie van monocyten in macrofagen.
    1. Incubeer monocyten (106 monocyten per putje in 6 putjesplaten) in 3 ml kweekmedium dat 10% humaan serum AB+ bevat bij 37 °C. Na 4 dagen vervangt u het kweekmedium dat humaan serum bevat door 3 ml kweekmedium dat 10% FBS bevat gedurende 3 extra dagen.
    2. Identificeer de verkregen celpopulatie als monocyte-afgeleide macrofagen (MDM's) door middel van stromcytometrie (zie Figuur 1).
      1. Vervang het kweekmedium door 3 ml PBS. Schap MDM's met een rubberen politieman en verzamel MDM-suspensies. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min. Voeg PBS met 2% BSA toe aan gepelletiseerde MDM's en schud voorzichtig de celsuspensie. Pas de celconcentratie aan (106 MDM's in 200 ml PBS) en incubeer bij 4 °C.
      2. Voeg 10 ml anti-CD14-antilichamen en 10 ml anti-CD68-antilichamen toe aan de MDM-suspensie en incubeer bij 4 °C gedurende 20 min in het donker.
        Opmerking: deze antilichamen moeten worden gelabeld met twee verschillende fluorochromen die consistent zijn met stromcy

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het doel van het huidige protocol is om de nauwkeurigheid van whole-cell MALDI-TOF MS aan te tonen bij het beoordelen van de responsiviteit van macrofagen op hun micro-omgeving.

Figuur 1 beschrijft de preparatie van gestimuleerde macrofagen uit bloedmonsters. Figuur 2 representeert de analyse van monocyten en MDM's via flowcytometrie. Merk op dat monocyten CD14 tot expressie brachten, maar geen CD68 (Figuur 1A). Omgekeerd brachten MDM's CD68 t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft het gebruik van MALDI-TOF-MS op eukaryote hele cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van de methode door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen in reactie op hun micro-omgeving te analyseren.

Het succes van het protocol is afhankelijk van enkele cruciale stappen. Ten eerste kan elke oplossingsverontreiniging het spectra veranderen. Het is bijvoorbeeld belangrijk om cellen in PBS te wassen om kweekmedium en serumeiwitten te verwijderen voordat ze op het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren. RO, JLM en CC zijn uitvinders van een internationaal patent WO 2011/154650, genaamd "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Dankbetuigingen

Richard Ouedraogo wordt ondersteund door een subsidie van het Ministère de la Santé (PHRC 2010). We danken Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops en Nicolas Amstrong voor hun technische assistentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Referenties

  1. Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
  2. Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
  3. Diamandis, E. P. Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations. Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  4. Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic. 11 (20), 2577-2591 (2005).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  7. Carbonnelle, E., et al. Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification. J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).
  8. Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains. J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).
  9. Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).
  10. Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PloS One. 5 (10), 13691 (2010).
  11. Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping. Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).
  12. Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).
  13. Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages. J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).
  14. Amann, J. M., et al. Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).
  15. Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis. Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).
  16. Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections. Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).
  17. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).
  18. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  19. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  20. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
  21. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).
  22. Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms. J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).
  23. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).
  24. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  25. Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).
  26. Delaby, A., Gorvel, L., et al. Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency. J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).
  27. Gibb, S., Strimmer, K. MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data. Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van monocytenCD14-positieve cellenflowcytometrieMALDI-targetpreparatieCHCA-matrixspectrale analyseM1-M2-discriminatie
Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.