Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van hele-cel MALDI-TOF massaspectrometrie op eukaryote cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van deze techniek door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen te analyseren als reactie op hun micro-omgeving.

Samenvatting

MALDI-TOF is een veelgebruikte massaspectrometrietechniek in de chemie en biochemie. Het is ook toegepast in de geneeskunde om moleculen en biomarkers te identificeren. Recentelijk is het in de microbiologie gebruikt voor de routine-identificatie van bacteriën die zijn gekweekt uit klinische monsters, zonder voorbereidings- of fractioneringsstappen. Wij en anderen hebben deze whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrietechniek met succes toegepast op eukaryote cellen. Huidige toepassingen variëren van identificatie van celtypen tot kwaliteitscontrole-evaluatie van celcultuur en diagnostische toepassingen. Hier beschrijven we het gebruik ervan om de verschillende polarisatiefenotypen van macrofagen in reactie op cytokines of hittedode bacteriën te onderzoeken. Het maakte de identificatie mogelijk van macrofaagspecifieke vingerafdrukken die representatief zijn voor de diversiteit van proteomische reacties van macrofagen. Deze toepassing illustreert de nauwkeurigheid en eenvoud van de methode. Het protocol dat we hier beschreven hebben, kan nuttig zijn voor het bestuderen van de immuunrespons van de gastheer in pathologische omstandigheden of kan worden uitgebreid tot bredere diagnostische toepassingen.

Inleiding

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) is een populaire massaspectrometrietechniek om biologische monsters te bestuderen. Het gebruik van een laserstraal en een energie-absorberende matrix maakt een zachte ionisatieproces mogelijk: de verdamping en ontstaan van grote, meestal enkelvoudig geladen biomoleculen. Dit proces wordt desorbentie/ionisatie genoemd, wat het acroniem MALDI rechtvaardigt. Deze ionen worden vervolgens versneld door het aanbrengen van spanning en komen in een TOF-analysator terecht, die de scheiding van deze ionen en de kwantificering van hun respectieve massa's mogelijk maakt¹.

Protocol

In het huidige protocol wordt de whole-cell MALDI-TOF-techniek gebruikt om een massaspectrum te verkrijgen dat wordt beschouwd als een vingerafdruk van het monster. Een bio-informatica-analyse maakte de vergelijking en classificatie van deze vingerafdrukken mogelijk. Er waren drie hoofdonderdelen in dit protocol:

1. De voorbereiding van de biologische monsters: controlemacrofagen en macrofagen gestimuleerd met verschillende agonisten.
2. De analyse van elk type monster met technische replica's door whole-cell MALDI-TOF MS.
3. De bio-informatica-analyse van ruwe gegevens.

Bereid steriele oplossingen voor voor ....

Resultaten

Het doel van het huidige protocol is om de nauwkeurigheid van whole-cell MALDI-TOF MS aan te tonen bij het beoordelen van de responsiviteit van macrofagen op hun micro-omgeving.

Figuur 1 beschrijft de preparatie van gestimuleerde macrofagen uit bloedmonsters. Figuur 2 representeert de analyse van monocyten en MDM's via flowcytometrie. Merk op dat monocyten CD14 tot expressie brachten, maar geen CD68 (Figuur 1A). Omgekeerd brachten MDM's CD68 t.......

Discussie

Dit protocol beschrijft het gebruik van MALDI-TOF-MS op eukaryote hele cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van de methode door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen in reactie op hun micro-omgeving te analyseren.

Het succes van het protocol is afhankelijk van enkele cruciale stappen. Ten eerste kan elke oplossingsverontreiniging het spectra veranderen. Het is bijvoorbeeld belangrijk om cellen in PBS te wassen om kweekmedium en serumeiwitten te verwijderen voordat ze op het.......