Subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina

Samenvatting

Celtransplantatie vertegenwoordigt een strategie voor de behandeling van netvliesdegeneratie die wordt gekenmerkt door fotoreceptorverlies. Hier beschrijven we een methode voor verrijking van transplanteerbare fotoreceptoren en hun subretinale enting in volwassen muizen.

Samenvatting

Slechtziendheid en blindheid als gevolg van het verlies van de lichtgevoelige cellen van het netvlies, d.w.z. fotoreceptoren, vormen de belangrijkste reden voor invaliditeit in geïndustrialiseerde landen. Vervanging van ontaarde fotoreceptoren door celtransplantatie is een mogelijke behandelingsoptie in toekomstige klinische toepassingen. Recente preklinische studies toonden inderdaad aan dat onrijpe fotoreceptoren, geïsoleerd van het neonatale netvlies van de muis op postnatale dag 4, het potentieel hebben om te integreren in het volwassen netvlies van de muis na subretinale transplantatie. Donorcellen genereerden een volwassen fotoreceptormorfologie inclusief binnen- en buitensegmenten, een rond cellichaam in de buitenste nucleaire laag en synaptische terminals in de nabijheid van endogene bipolaire cellen. Recente rapporten toonden inderdaad aan dat donorfotoreceptoren functioneel integreren in het neurale circuit van gastheermuizen. Voor een toekomstige klinische toepassing van een dergelijke celvervangingsbenadering moeten gezuiverde suspensussingen van de cellen van keuze worden gegenereerd en op de juiste positie worden geplaatst voor een goede integratie in het oog. Voor de verrijking van voorlopers van fotoreceptoren moet de sortering gebaseerd zijn op specifieke celoppervlakantigenen om genetische manipulatie van donorcellen te voorkomen. Hier tonen we magnetische-geassocieerde celsortering (MACS) - verrijking van transplanteerbare staaffotoreceptorprecursoren geïsoleerd van het neonatale netvlies van fotoreceptorspecifieke reportermuizen op basis van de celoppervlakmarker CD73. Incubatie met anti-CD73-antilichamen gevolgd door microparel geconjugeerde secundaire antilichamen maakte de verrijking van staaffotoreceptorprecursoren door MACS tot ongeveer 90% mogelijk. In vergelijking met flowcytometrie heeft MACS het voordeel dat het gemakkelijker kan worden toegepast op GMP-normen en dat grote hoeveelheden cellen in relatief korte tijdsperioden kunnen worden gesorteerd. Injectie van verrijkte celsuspensingen in de subretinale ruimte van volwassen wilde muizen resulteerde in een 3-voudig hogere integratiesnelheid in vergelijking met ongesorteerde celsuspensingen.

Inleiding

Visie is een van de belangrijkste zintuigen van de mens. Aantasting van deze zin en blindheid zijn een van de belangrijkste redenen voor invaliditeit in geïndustrialiseerde landen. De belangrijkste oorzaak voor slechtziendheid of blindheid is retinale degeneratie, gekenmerkt door fotoreceptorcelverlies, zoals kan worden waargenomen bij maculadegeneratie, retinitis pigmentosa, cone-rod dystrofie en andere aandoeningen. Tot op heden is een effectieve therapie om verloren gezichtsvermogen te herstellen niet beschikbaar. In 2006 en 2008 meldden twee verschillende laboratoria, onafhankelijk van elkaar, een succesvolle transplantatie van staaffotoreceptorprecursorencellen in volwassen wilde muizen retinas^1,2. Aldus, het voordoen van de mogelijkheid van fotoreceptor precursor celtransplantatie ook in een ontaard netvlies, om ontaarde fotoreceptoren te vervangen en het gezichtsvermogen te herstellen. Onlangs is namelijk aangetoond dat dergelijke getransplanteerde fotoreceptorprecursorcellen morfologische criteria van volwassen fotoreceptoren van het wilde type oproepen, zoals goed ontwikkelde buitenste segmenten³, synaptische terminals in de nabijheid van endogene bipolaire cellen en een rond cellichaam in de buitenste nucleaire laag^2-4, evenals het vermogen om functioneel te integreren in het neurale circuit van de gastheer^5-7. Een van de belangrijkste principes van deze strategie is het gebruik van postnatale dag 4 (PN 4, PN0 wordt gedefinieerd als dag van geboorte) jonge muizen netvlies, wat resulteert in een mengsel van verschillende celtypen voor transplantatie. Op de achtergrond van een toekomstige therapeutische toepassing moet dit mengsel worden gezuiverd voor fotoreceptorprecursorcellen. CD73 is beschreven als de eerste celoppervlakmarker specifiek voor jonge fotoreceptoren in het netvlies^8-10. Hier demonstreren we een fotoreceptor precursor celzuiveringsmethode op basis van deze celoppervlakmarker en met behulp van de magnetische celsorteertechniek (MACS). MACS kan voordelen hebben in vergelijking met fluorescerende geactiveerde celsorteertechnieken, vanwege snelle sorteertijden en de eenvoudigere aanpassing aan GMP-omstandigheden. We kunnen een verrijking van ~ 90% en een tot 3-voudig hogere integratiesnelheid aantonen bij het transplanteren van de verrijkte populatie naar de subretinale ruimte in volwassen wild-type netvlies. Macs-gebaseerde fotoreceptor precursor celverrijking en subretinale transplantatie zijn dus betrouwbare en veelbelovende technieken voor de ontwikkeling van een regeneratieve therapeutische strategie voor de behandeling van retinale degeneratie.

Protocol

Verklaring ethisch gebruik en verzorging van dieren:

Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de wetgeving van de Europese Unie en duitsland (Tierschutzgesetz) en hielden zich aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en vision-onderzoek. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de dierenethiekcommissie van de TU Dresden en de Landesdirektion Dresden (erkenningsnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Voordat u begint met celdissociatie en celsortering

1. Etiket drie reactiebuizen van 15 ml met: Was (W), Positieve fractie (+) en Negatieve fractie (-).

2. Retina dissociatie

1. Onthoofd de PN 4 pups met een schaar.
2. Spoel het hoofd van de pups kort af in 70% ethanol gevolgd door wassen in PBS.
3. Breng het hoofd over op koude HBSS en maak het oog enucleate (herhaal deze stap voor alle hoofden). Om te enucleeren, open de oogleden en fixeer het oog met gebogen tang op het oogzenuwgebied. Trek vervolgens het oog voorzichtig uit de baan.
4. Na het verleiden van alle ogen, isoleer het netvlies: introduceer een gesloten schaar in de oogzenuw en open de messen. Peal de RPE/chorid uit. Verwijder de lenzen en bloedvaten met behulp van een gebogen tang.
5. Breng het geïsoleerde netvlies over in een reactiebuis van 1,5 ml met de papaïneoplossing (geleverd door de papaïnedissociatiekit).
6. Incubeer het netvlies in de papaïneoplossing gedurende 30-60 minuten in een waterbad of shaker (400 tpm) bij 37 °C.
   1. Terwijl het netvlies incubeert in de papaïneoplossing, pipeteert u 1 ml eiceloplossing tot een reactiebuis van 15 ml (label "1").
   2. Voeg 60 μl DNase I (10 mg/ml) + 60 μl eiceloplossing (meegeleverd door de kit) + 520 μl EBSS toe aan een reactiebuis van 15 ml (label "2").
7. Breng na de incubatie van papaïne de papaïneoplossing met het gedeeltelijk verteerde netvlies over naar reactiebuis "2".
8. Voer met behulp van een vuur gepolijste pipet mechanische dissociatie uit (10x op en neer).
9. Pipetteer de eencellige suspensie naar reactiebuis "1". Probeer 2 lagen te genereren door de celsuspensie voorzichtig bovenop de eiceloplossing te legen.
10. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g (ongeveer 1.300 tpm).
11. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 500 μl MACS-buffer.

3. Celsorteren met behulp van magnetische gekoppelde celsortering (MACS)

1. Voeg X μl rat anti-CD73 antilichaam toe aan de 500 μl om een eindconcentratie van 10 μg/ml te bereiken.
2. Incubeer 5 minuten op ijs.
3. Vul de reactiebuis van 15 ml tot 10 ml met MACS-buffer en centrifugeer deze gedurende 5 minuten met een snelheid van 300 x g.
4. Verwijder het supernatant.
5. Resuspend de pellet in 480 μl MACS buffer en voeg 120 μl geiten anti-rat IgG microbeads toe.
6. Incubeer 15 min op ijs; niet roeren, schudden of mengen.
7. Vul de reactiebuis van 15 ml tot 5 ml met macs-buffer en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 300 x g.
8. Wanneer de reactiebuis wordt gecentrifugeerd:
   1. Stel een LS-kolom in de magnetische standaard in.
   2. Plaats het voorscheidingsfilter boven op de LS-kolom.
   3. Hydrateer het voorscheidingsfilter en de LS-kolom met 3 ml MACS-buffer en verzamel de MACS-buffer in de wasbuis (W).
9. Verwijder het supernatant.
10. Resuspend de pellet in 500 μl MACS buffer.
11. Plaats de celsuspensie van 500 μl in het filter, voeg vervolgens 1 ml MACS-buffer toe aan het filter en verzamel de negatieve fractie in de negatieve fractie (-) reactiebuis.
12. Voeg vervolgens 3 x 3 ml MACS-buffer toe aan de kolom om de cellen af te wassen die niet aan de kolom zijn gebonden
13. Zodra deze 9 ml door de LS-kolom zijn, verwijdert u de kolom van de magnetische standaard en installeert u deze bovenop de reactiebuis met positieve fractie (+).
14. Plaats snel 5 ml MACS-buffer in de LS-kolom en plaats de zuiger in de LS-kolom en druk deze naar beneden totdat de hele buffer door de kolom is.
15. Centrifugeer de reactiebuis met de positieve fractie gedurende 5 min bij 300 x g.
16. Verwijder het supernatant, resuspend in 500 μl MACS buffer en houd bij 4 °C.
17. Tel het totale aantal cellen met behulp van een gemeenschappelijk celtellingsapparaat.
18. Bereid een celsuspensie voor uit de positief gesorteerde fractie die 2 x 10⁵ cellen/μl in macs-buffer bevat en houd deze bij 4 °C

4. Transplantatie van MAC-gesorteerde fotoreceptorprecursorcellen in het netvlies van de muis

1. Zorg ervoor dat u alle volgende oplossingen bij de hand hebt: 1 ml steriel PBS of HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml steriel gedeï gedeïdiseerd H₂O, aliquots van de celsuspensiefracties bij 4 °C.
2. Verdoof de volwassen muis(d.w.z. 2-4 maanden oud) met een intraperitoneale injectie van medetomidinehydrochloride (0,01 mg/10 g lichaamsgewicht), ketamine (0,75 mg/10 g lichaamsgewicht). Doe vervolgens een subcutane injectie met Buprenorfine (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) voor pijnverlichting.
3. Verwijd pupillen met een daling van Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.
4. Bevestig de muis in de muiskophouder en plaats deze onder de stereomicroscoop.
5. Breng een druppel Visidic gel aan om uitdroging van het oog te voorkomen.
6. Maak een klein gaatje op de rand tussen sclera en hoornvlies (respectievelijk ora serrata)met een steriele naald van 30 G 1/2.
7. Snijd een gemeenschappelijke hoes in kleine (ongeveer 5 mm x 5 mm) stukken met behulp van een diamantpen, plaats een van deze stukken bovenop het hoornvlies, zodat het netvlies direct kan worden gevisualisatied.
8. Spoel de voorgesteriliseerde microliterspuit meerdere keren door met gedeioneerd water.
9. Laad de microliterspuit met 1 μl celsuspensie, steek de naald tangentially door het bindvlies en de sclera en plaats deze onder visuele controle in de neushelft van het netvlies.
10. Sla voorzichtig een gat in het netvlies totdat u de subretinale ruimte bereikt, injecteer de celsuspensie in de subretinale ruimte.
11. Let op de bulleuze ontkoppeling van het netvlies, die uniform moet zijn en ongeveer 1/4 van de netvliesruimte bedekt zonder bloedingen.
12. Trek de spuit voorzichtig terug, het netvliesgat sluit automatisch af.
13. Spoel de microliterspuit meerdere keren met gedeioneerd water.
14. Laat de muis los van de hoofdhouder.
15. Maak de muis wakker door atipamozole hydrochloride te injecteren voor omkering van het medetomidine hydrochloride-effect.
16. Plaats de muis voor de wektijd in een warme donkere kamer (ongeveer 25 °C).
17. De volgende 2 dagen na transplantatie moet Buprenorfine (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) 's ochtends en 's middags worden toegediend via subcutane injectie voor pijnverlichting.

Resultaten

Om het vermogen van staaffotoreceptoren te beoordelen om in het netvlies van de muis te integreren, werd een muisreporterlijn gebruikt, waarbij GFP wordt aangedreven door de neurale retina leucine rits (Nrl, Nrl-GFP) promotor¹¹. Nrl is de vroegste marker van staaffotoreceptoren die zijn expressie op E12.5 gedurende de volwassenheid begint, waardoor een specifieke etikettering van donorstaaffotoreceptorcellen mogelijk is.

PN 4 Nrl-GFP pups werden onthoofd en ogen werden ingekapseld. ...

Discussie

Subretinale transplantatie van fotoreceptorprecursorencellen is een betrouwbaar hulpmiddel om deze lichtgevoelige cellen in significante aantallen in het netvlies van de gastheer te integreren^1,2. Dit zou de oprichting van een celtherapie voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten in de toekomst mogelijk kunnen maken⁶. De donorpopulatie van cellen, momenteel geïsoleerd van PN 4 retinas, is een mengsel van verschillende celtypen, waaruit alleen de fotoreceptorprecursorcellen integreren na subretinale injectie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	geleverde DNase I wordt niet gebruikt in de methode
Gereinigd rat anti-muis CD73, clone TY/23	BD Pharmingen	550738	Voorraadconcentratie 0,5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads	Miltenyi	130-048-501	Totaal volume van 2 ml
PBS	Gibco	10010-015	Gebruikt om het totale aantal cellen te tellen
DNase I	Sigma	D5025-150KU
HBSS	Gibco	14025050	Gebruikt voor dissociatie van de retina's
Trypan blauw	Sigma	Fluka93595	Gebruikt om het totale aantal cellen te tellen
Vidisic	Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor	Pfizer	76579
Ketamine 10%	Ratiopharm	7538843
Antisedan	Pfizer	76590
Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%	University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters	Miltenyi	130-041-407
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303
QuadroMACS Separator	Miltenyi	130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette	Brand	74777 20	De punten van de pipet moeten vuur-gepolijst en geautoclaveerd worden.
MACS 15 ml buisjesstandaard	Miltenyi	130-091-052
Celtellingskamer	Carl Roth	T728.1
Steriele 15 ml buisjes	Greiner Bio-One	188271
Leica M651 MSD	Leica	M651 MSD	kan worden gebruikt in plaats van Olympus SZX10
Olympus SZX10	Olympus	SZX10	kan worden gebruikt in plaats van Leica M651 MSD
Olympus omgekeerde stereomicroscoop CKX41	Olympus	CKX41
Celcultuur kap Thermo Scientific MSC-Advance	Thermo Scientific	51025411
1,5 ml reactiebuisje	Sarstedt	727706400
2 ml reactiebuisje	Sarstedt	72695
Eppendorf Centrifuge 5702	VWR (Eppendorf)	521-0733
Muiskophouder	myNeurolab	471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in	BD Pharmingen	304000
Hamilton microliter spuit 5 µl, 75RN	Hamilton	065-7634-01	wordt geleverd zonder naalden
Hamilton RN speciale naald 34 G	Hamilton	065-207434	Blunt, 12 mm lengte
Vannas-Tübingen Veerscharen - 5 mm Bladen Recht	Fine Science Tools	15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie	Fine Science Tools	11272-40
Diamantstift	Tools-tech
15 mm x 15 mm Deksels	Sparks	MIC3366