Implanteren georganiseerde arrays van microwires voor gebruik in een enkele eenheid elektrofysiologische opnames presenteert een aantal technische uitdagingen. Methoden voor het uitvoeren van deze techniek en de apparatuur die nodig zijn beschreven. Ook is het nuttig gebruik van de georganiseerde Microwire arrays op te nemen van verschillende neurale subregio's met een hoge ruimtelijke selectiviteit besproken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een procedure voor het implanteren van georganiseerde Arrays van microwires voor Single-unit Opnamen in Awake, Gedragen Dieren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In vivo elektrofysiologische opnames in de wakkere, gedraagt dier zorgen voor een krachtige methode voor het begrijpen van neurale signalering bij de single-cell niveau. De techniek maakt het mogelijk om onderzoekers tijdelijk en regionaal onderzoeken specifieke afvuren patronen om opgenomen actiepotentialen correleren met de lopende gedrag. Bovendien kan een enkele unit registraties worden gecombineerd met een overvloed aan andere technieken om uitgebreide uitleg van neurale functies te bewerkstelligen. In dit artikel beschrijven we de anesthesie en de voorbereiding voor Microwire implantatie. Vervolgens hebben we een opsomming van de benodigde apparatuur en chirurgische stappen om nauwkeurig plaats een Microwire array naar een doel structuur. Tot slot beschrijven we kort de voor de registratie van elke afzonderlijke elektrode in de array apparatuur. De vaste Microwire arrays beschreven zijn zeer geschikt voor chronische implantatie en zorgen voor longitudinale opnamen van neurale gegevens in vrijwel elke gedrags preparatiop. We bespreken tracing elektrode tracks naar Microwire posities evenals manieren om Microwire implantatie combineren met immunohistochemische technieken om de anatomische specificiteit van verkregen resultaten te verhogen driehoeksmeting.
Inleiding
Elektrofysiologische registraties kunnen wetenschappers de elektrische eigenschappen van biologische cellen te onderzoeken. In het centrale zenuwstelsel, waarbij elektrische impulsen dienen als signaleringsmechanisme, deze opnamen van bijzonder belang voor het begrijpen van neurale functie 1-2. Tijdens de single-unit registraties in gedragen dieren, een micro-elektrode die in de hersenen is ingebracht is in staat om veranderingen op te nemen in de opwekking van een neuron van actiepotentialen in de tijd.
Terwijl veel technieken laten ons toe om de hersenactiviteit te registreren, single-unit elektrofysiologie is een van de meest precieze methoden doordat resolutie bij de enkel neuron niveau. Wanneer een hoge mate van ruimtelijke specificiteit gewenst is, kan microwires worden gebruikt om afzonderlijke sub-kernen of ensemble van cellen in de brain3 richten. Single-unit opnames ook profiteren van hoge tijdsresolutie wegens opnames zijn nauwkeurig op de microseconde niveau. En, in vivo eenkielzog opnames laten intact circuit interacties, met het natuurlijke milieu van afferente en efferente projecties, systemische chemische en hormonale invloeden, en fysiologische parameters. Neurale signalen worden afgeleid van zintuiglijke input, motorische gedrag, cognitieve verwerking, neurochemistry / farmacologie, of een combinatie. Dienovereenkomstig, de scheiding van sensorische, motorische, cognitieve, en chemische invloeden vereist doordachte experimenten met effectieve risico's en controles die kunnen toestaan dat voor de beoordeling van elk van de bovengenoemde invloeden. Al met al, opnames in gedragen dieren mogelijk maken onderzoekers om de integratie van meerdere bronnen van informatie te observeren binnen een functionerende schakeling en een meer omvattend model van circuit functie afleiden.
Enkele eenheid opnamen ook kampen met een aantal nadelen, waarvan een experimentator moet zich bewust. Eerst en vooral, kunnen opnames moeilijk uit te voeren zijn. Inderdaad, eigenschappen van the headstage versterkers en de geïmplanteerde microwires waarmee ruimtelijke en temporele specificiteit in deze opnames maakt opnamen gevoelig voor de invloed van externe elektrische signalen (bijvoorbeeld elektrische "ruis"). Dienovereenkomstig, het vermogen om problemen op te lossen in een elektrofysiologische systeem vereist een goed ontwikkelde technische kennis van elektrofysiologische principes en apparaten. Het is ook belangrijk op te merken dat, onder bepaalde omstandigheden, opgenomen elektrische signalen in extracellulaire opnames kan de optelling van verschillende neurale signalen vertegenwoordigen. Bovendien kan gegeneraliseerd enkele eenheid activiteit populatie activiteit in een doelwit gebied vaak beperkt door de mate van cellulaire heterogeniteit binnen het doelgebied (maar zie Cardin 4). Bijvoorbeeld, zou elektroden de nadruk echter op het opnemen van hoge amplitude output vormen in plaats van andere cellen. De interpreteerbaarheid van single-unit registraties wordt verhoogddoor het combineren opnames met andere technieken, waaronder, maar niet beperkt tot, elektrische (orthodromic of antidromic), chemische (bijv. iontoforetische of ontwerper receptor) of optogenetic stimulatie 4, tijdelijke neurale inactivations, sensorimotorische onderzoeken 5, ontkoppelingsprocedure of immunohistochemie 3.
In het protocol dat volgt zullen wij de materialen en stappen die nodig sommen een georganiseerde Microwire array in ratten geïmplanteerd (hoewel het protocol kan worden aangepast voor gebruik in andere soorten). De procedure en de stijl van vaste arrays gebruikt in ons laboratorium hebben betrouwbare Longitudinale opnames bewezen en kan opnames van hetzelfde neuron houden voor meer dan een maand tijd 6-8. Dit maakt deze procedure ideaal voor de behandeling van driefase reacties op experimentele stimuli, plastische veranderingen in de neurale reacties, of mechanismen van leren en motivatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De grootste zorg moeten worden genomen om aseptische omstandigheden te handhaven (zoals beschreven in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren 9) tijdens de voorbereiding voor en het uitvoeren van de volgende procedure. Het volgende protocol is in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite, Rutgers University goedgekeurd. Er wordt geschat dat de daaropvolgende procedures 3-6 uur zal nodig hebben om te voltooien.
Implantatie van de Microwire Array:
- Plaats dieren verdoofd met 50 mg / kg natriumpentobarbital (ip) en toedienen 10 mg / kg atropine methylnitraat (IP; Glycopyrrolaat gesubstitueerd kan zijn) en 0,25 mg penicilline (300.000 U / ml im) respiratoire functie te behouden en voorkomen van infectie respectievelijk.
Opmerking: Bij de 3-6 uur lengte van deze implantatiechirurgie wordt natriumpentobarbital gebruikt omdat het kosteneffectief en beperkt de menselijke blootstelling aananesthetica (zoals kan optreden bij langdurig gebruik van gas anesthetica), terwijl het toch langdurige anesthesie. Substitutie van andere anesthetica aanvaardbaar. - Controleer of de verdoving effect heeft gemaakt met de staartknijptest voordat u verder gaat.
- Indien nodig, geeft afwisselend injecties van ketamine hydrochloride (60 mg / kg IP) en natriumpentobarbital (5-10 mg / kg IP) anesthesie tijdens de operatie te handhaven.
- Scheer de hoofdhuid met behulp van een # 22 scalpel.
- Ontsmet de geschoren hoofdhuid met povidonjood.
- Geef subcutane injecties van bupivacaine (~ 1 mg / kg SC verdeeld over 4 injectieplaatsen) plaatselijk verdoven de hoofdhuid. Laat 5-10 minuten voor de plaatselijke verdoving door te voeren.
- Plaats een oogheelkundige smeermiddel over de ogen om vocht vast te houden tijdens de anesthesie.
- Beveilig het dier in het oor bars en neus klem van een stereotaxische apparaat.
- Gebruik visuele oriëntatiepunten (bijvoorbeeld een horizontale balk op de stereotaxic frame) tot ongeveer het niveau van hoofd van het dier. Deze stap is alleen bedoeld om ongeveer op het niveau van de schedel.
- Maak een insnijding langs de middellijn van de hoofdhuid met behulp van een # 11 scalpel gemonteerd op een scalpel houder. De incisie moet uitstrekken van net achter de oren om het achterste gedeelte van het neusbeen.
- Met behulp van een dissectie spatel, schakelt de schedel van alle resterende weefsel totdat beide laterale schedel kammen en de achterste schedel nok zijn bereikt.
- Trek de huid rond de incisie met behulp van een aantal hemostats (6x).
- Maak de schedel van een bloed en laat ze drogen. Als de resterende bloeden optreedt, beëindigen de resterende bloeden met een kleine cauterizing tool. Ervoor zorgen dat de schedel blijft schoon en droog maakt de tandheelkundige acryl gebruikt in de volgende stappen om permanent te binden aan de schedel.
- Mark bregma en lambda (figuur 2D) door interpolatie het snijpunt van de schedel hechtingen. Een ontleden microscope moeten deze posities nauwkeurig markeren.
- Bevestig een klein puntig voorwerp (bijvoorbeeld een pen of tandheelkundige boor) een stereotaxische arm en laat het aan de dorsale / ventrale (DV) bepalen coördinaat van bregma en lambda.
- Stel de neus klem totdat het DV-coördinaten van bregma en lambda zijn binnen 100 urn (0,1 mm) van elkaar.
- Eenmaal genivelleerd, noteer de anterior / posterior (AP), mediale / laterale (ML) en DV-coördinaten van bregma samen met de positie van de neus klem. Controleer de coördinaten van nauwkeurigheid, de rest van de operatie is afhankelijk van de nauwkeurigheid van deze coördinaten.
- Gebruik de gemeten coördinaten aan de ML-en AP-coördinaten van de vier hoeken van de "schedel venster" ten opzichte van bregma (dwz craniotomy; Figuur 1) te berekenen. Het venster schedel is een zeer precies te positioneren rechthoek waardoor de Microwire array zal passeren.
- Gebruik de berekende coördinaten ter gelegenheid van hetschedel venster coördineert op de schedel met een puntig stereotaxisch gehechtheid en vulpen inkt. Om precies te merken verkrijgen toepassing slechts een kleine hoeveelheid inkt naar de punt van de markeergereedschap met een katoenen applicator.
- Boor de schedel raam door het verwijderen van het bot in een reeks kleine lagen.
- Begin met het boren van de gemarkeerde hoeken van het venster wanneer de merken zijn geplaatst.
- Vervolgens sluit de hoeken en een overzicht van de raam.
- Ten slotte duidelijk uit het gebied binnen de omtrek tot in de diepte van de dura mater. Het gat moet breder (dwz schuine) in de oppervlakkige lagen van de schedel om ervoor te zorgen dat het raam onderhoudt een geschikte breedte van boven naar beneden.
- Gebruik microforceps om alle resterende botsplinters, puin, of dura mater verwijder voorzichtig in de schedel venster. Deze stap is zeer belangrijk, omdat deze stukjes materiaal de integriteit van de matrix kan beschadigen tijdens het dalen. Eenmaal gewist, moet men th houdene venster vochtig met bacteriostatische zoutoplossing voor de rest van de operatie.
- Plaats markeringen op de schedel voor 5 schedel schroeven en 1 begane draad (figuur 1). Deze posities zijn afhankelijk van de beoogde hersengebied. De headstage zullen de meeste veilig als een schroef op elk van de 5 schedelbeenderen wordt geplaatst. Plaats zowel de schedel schroeven en aardedraad op locaties die niet zal bemoeien met de Microwire reeks plaatsing.
- Boor gaten voor de schedel schroeven en zet de schroeven op zijn plaats. Schroeven moeten worden verlaagd tot slechts 3-4 draden vertonen (of, indien met andere dan de aanbevolen schroeven, diep genoeg om de dikte van de schedel array stabiliteit doorkruisen maar niet te diep om cortex beschadigen). Reinig de schroefdraad van de schroeven na plaatsing.
- Boor een gat voor de aardingskabel. Laat de draad langzaam (meer dan 1-2 min) naar het doel DV coördineren en bevestig de draad op zijn plaats met behulp van tandheelkundige acryl.
- Acryl voegen rond de dradenvan de schedel schroeven. Voordat de acryl droogt, verwijder eventueel overtollig cement dat uit de buurt van de grond draad of schedel schroeven stroomt. Laat 15 min voor de tandheelkundige acryl te drogen / uitharden.
- Bevestig de array om de stereotaxische arm. Zet de array en oriënteren zodat het vierkant zal door de grenzen van de schedel venster.
- Plaats zoutoplossing in de schedel venster zodat het niveau met de schedel. Verlaag de array totdat het creëert een kuiltje in de zoutoplossing. Deze coördinaat wordt gebruikt als schedel-niveau voor de array. Gebruik deze waarde voor de berekening van de uiteindelijke DV-coördinaat van de array.
- Verlaag de array langzaam totdat het bereikt zijn definitieve DV coördineren. Stop elke 1mm verlagen en wacht enkele minuten zodat hersenweefsel te herstellen van kuiltjes en het onderste gedeelte van de polyethyleenglycol (PEG) los op de array (PEG wordt gebruikt om de draden tijdelijk houden hun conformatie terwijl het verlagen en lost langzaam in zoutoplossing).
- Wanneer de array 1mmverwijderd van de doelstelling, zakken langzamer totdat de uiteindelijke doelstelling is bereikt. Verlaging van 0,1-0,2 mm in een tijd alvorens het weefsel rusten gedurende 5 minuten is bedoeld om het weefsel op de doelplaats en proximale synaptische verbindingen behouden. Als het materiaal beschikbaar is, kan de precisie verlaging van de array bijgestaan met een gemotoriseerde manipulator.
- Los de resterende PEG en gebruiken tandheelkundige acryl om de microwires in plaats van cement. Voeg meerdere lagen van cement om ervoor te zorgen dat de draden goed vast en laat 15-20 minuten voor het cement uitharden voordat u verder gaat. Dit zorgt ervoor dat de kabels niet worden verdrongen uit hun definitieve plaatsing.
- Bouw de rest van headstage het dier met behulp van tandheelkundige acryl. Gebruik de acryl te omsluiten de schedel schroeven, aardedraad, en de aansluiting voor de microwires. Laat het acryl hoed voldoende uitharden voordat u verder gaat.
- Hecht de hoofdhuid incisie met behulp van absorbeerbare hechtingen en beheren 2 ml of bacteriostatische zoutoplossing (sc) om hydratatie te herstellen van een operatie.
- Verwijder het dier uit het oor bars en plaatsen het onderwerp in een schone omgeving. Observeer het dier vaak tijdens het postoperatieve herstel tot thermoregulatie en motoriek zijn hersteld. Na herstel van de anesthesie, verplaats het dier in single-behuizing voor de rest van de post-operatieve herstel.
- Geef dieren dagelijks postoperatieve bewaking en zorg in de dagen na de procedure. Herstel van deze procedure is optimaal wanneer zeven of meer dagen zijn niet toegestaan.
- Geef dieren injecties van Carprofen (5mg/kg) en Enrofloxacin (5-10 mg / kg) of equivalenten daarvan gedurende herstel volgens het schema aanbevolen door de behandelende dierenarts.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een lijst van de uitrusting die gebruikt wordt door dit laboratorium voor het opnemen van elektrofysiologische signalen zijn te vinden in tabel 3. Na herstel van een operatie, zijn single-eenheden geregistreerd door de stekker een unity-gain headstage in de geïmplanteerde connector. Deze headstage is via een kabel naar een commutator, dat in staat is vrije rotatie zonder onderbrekingen in de elektrofysiologische opname door het gebruik van elektrische sleepringen. De commutator kan onderwerpen vrij te b...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Extracellulaire registraties vormen een krachtige experimentele techniek die in vrijwel elke experimentele opstelling in de neurowetenschappen kunnen worden opgenomen. Draden die zijn geïmplanteerd in georganiseerde arrays kunnen worden gevolgd als hun assen passeren de hersenen en in hun doelgebied (figuur 5A). Wanneer een klein, post-experimentele laesie is gecreëerd op de niet-geïsoleerde Microwire tip om een kleine ijzeren storting te maken van de roestvrij staaldraad, kan men nauwkeurig de locati...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het National Institute on Drug Abuse kent DA 006886 (MOW) en DA 032270 (DJB).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tabel 1. Lijst van chirurgische materialen. | |||
| Gaas | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Wattenstaafjes | Fisher (Puritan) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropine Methylnitraat | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacin) | Butler Shein (Bayer) | 1040007 | |
| Ketaminehydrochloride | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidon-jood) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Brandinstrument | Stoelting | 59017 | |
| Dissectiemicroscoop | Nikon | SMZ445 | |
| Tandartsboor | Buffalo | 37800 | |
| Bacteriostatische zoutoplossing | Bulter Schein | 8973 | |
| Juweliersschroeven | Stoelting | 51457 | |
| Microwire-array | Microprobes | Custom (Flexibel) | |
| Aarddraad | Omnetics | Custom Plug | |
| Tandheelkundig acryl | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Absorbeerbare hechtdraden | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (oftalmische zalf/smeermiddel) | Fisher (Henry Schein) | 008897 | |
| Tabel 2. Lijst van chirurgische instrumenten. | |||
| 2x Microforceps | George Tiemann Co. | #160-57 | Meervoudig gebruik (bijv. puin verwijderen in schedelvenster) |
| 2x Forceps | George Tiemann Co. | #160-93 | Meervoudig gebruik (bijv. hechtingen leggen) |
| 6x Hemostats | George Tiemann Co. | #105-1125 | Insnijden en openen |
| 1x Kleine schaar | George Tiemann Co. | #105-411 | Hechtingen snijden na het leggen |
| 1x Weefseltange | George Tiemann Co. | #105-222 | Weefsel vasthouden tijdens het hechten |
| 1x Naaldhouder | George Tiemann Co. | #105-1259 | Naald vasthouden |
| 1x Scalpelhouder (met #11-mesje) | George Tiemann Co. | #105-80 (met #105-71-mesje) | Insnijden in de schedel |
| 1x #22 Scalpelmesje | George Tiemann Co. | #160-381 | Scheren van de hoofdhuid |
| 1x Chirurgische spatel | George Tiemann Co. | #160-718 | Schrapen van de schedel om weefsel op de schedel te verwijderen |
| Machine-/Juweliersschroeven | Verschillende | N/A | 0/80 x 1/8” |
| Tabel 3. Lijst van apparatuur voor het opnemen van elektrofysiologische signalen. | |||
| Microwire-array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N/A (onderdeelnummer gebaseerd op de array-kenmerken) | Craniaal geïmplanteerd in het doelgebied voor opname. Arrays worden aangepast op basis van de gewenste draadverwijdering, lengte, etc. |
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Initiële versterking van het neurale signaal; maakt de propagatie van kleine neurale signalen mogelijk. |
| Commutatie (en optionele vloeistofzwaaiarm) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Laat dieren vrij draaien terwijl het elektrische signaal naar de voorversterker wordt gevoerd |
| Voorversterker | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Versterkt het neurale signaal differentieel tegen een referentie-elektrode. |
| Filter en versterker | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Bandpass-filters en versterkt het differentieel versterkte signaal verder. |
| Acquisitiecomputer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Voert software en hardware uit voor het verzamelen van gedrags- en neurale gegevens. |
| A/D-kaart | Data Translation (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitaliseert neurale signalen voor computersampling. |
| Digitale I/O-kaart | Measurement Computing (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Verzamelt gedragsinputs en -outputs |
Referenties
- Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , Academic Press. (2009).
- Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. , Raven Press. (1995).
- Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
- Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. , (2013).
- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
- Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).
- Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).
- Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
- Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).
- Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 Forthcoming.
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (1997).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
