Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Aplysia Ganglia voorbereiding voor elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen

8.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51075

⸱

13 januari 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

In dit artikel

Samenvatting

Zeeslak Aplysia californica is veel gebruikt als een neurobiologisch model voor de studies op cellulaire en moleculaire basis van gedrag. Hier wordt een methodologie beschreven voor het verkennen van het zenuwstelsel van Aplysia voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen van geïdentificeerde neurale circuits.

Samenvatting

Een grote uitdaging in de neurobiologie is het begrijpen van de moleculaire onderbouwing van neurale circuits die een specifiek gedrag bepalen. Zodra de specifieke moleculaire mechanismen zijn geïdentificeerd, kunnen nieuwe therapeutische strategieën worden ontwikkeld om afwijkingen in specifiek gedrag veroorzaakt door degeneratieve ziekten of veroudering van het zenuwstelsel te behandelen. De zeeslak Aplysia californica is zeer geschikt voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire gedragsbasis, omdat neurale circuits die ten grondslag liggen aan een specifiek gedrag gemakkelijk kunnen worden bepaald en de afzonderlijke componenten van het circuit gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd. Deze voordelen van Aplysia hebben geleid tot verschillende fundamentele ontdekkingen van neurobiologie van leren en geheugen. Hier beschrijven we een voorbereiding van het Aplysia zenuwstelsel voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van individuele neuronen. Kortom, ganglion ontleed uit het zenuwstelsel wordt blootgesteld aan protease om de ganglionschede te verwijderen, zodat neuronen worden blootgesteld, maar neuronale activiteit behouden zoals bij het intacte dier. Dit preparaat wordt gebruikt om elektrofysiologische metingen van enkele of meerdere neuronen uit te voeren. Belangrijk is dat na de opname met behulp van een eenvoudige methodologie, de neuronen rechtstreeks van de ganglia kunnen worden geïsoleerd voor genexpressieanalyse. Deze protocollen werden gebruikt om gelijktijdige elektrofysiologische opnames uit te voeren van L7- en R15-neuronen, hun reactie op acetylcholine te bestuderen en de expressie van creb1-gen te kwantificeren in geïsoleerde enkelvoudige L7-, L11-, R15- en R2-neuronen van Aplysia.

Inleiding

Het menselijk brein is buitengewoon complex met bijna 100 miljard neuronen en biljoenen synaptische verbindingen. Er zijn bijna een gelijk aantal niet-neuronale cellen die interageren met neuronen en hun functie in de hersenen reguleren. Neuronen zijn georganiseerd in circuits die specifiek gedrag reguleren. Ondanks de vooruitgang in ons begrip van hersenfuncties en neurale circuits, is er weinig bekend over de identiteit van circuitcomponenten die een specifiek gedrag controleren. Kennis van de identiteiten van verschillende componenten van een circuit zal ons begrip van zowel cellulaire als moleculaire basis van gedrag aanzienlijk vergemakkelijken en helpen bij het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën voor neuropsychiatrische aandoeningen.

De zeeslak Aplysia californica is een werkpaard geweest voor het bepalen van neuronale circuits die ten grondslag liggen aan specifiek gedrag1-14. Het Aplysia zenuwstelsel bevat ongeveer 20.000 neuronen die zijn georganiseerd in 9 verschillende ganglia. De neuronen van Aplysia zijn groot en kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd op basis van hun grootte, elektrische eigenschappen en positie in de ganglia. Aplysia heeft een rijk repertoire aan gedragingen die bestudeerd kunnen worden. Een van de goed bestudeerde gedragingen is de kieuwontwenningsreflex (GWR). De centrale componenten van deze reflex bevinden zich in abdominale ganglia. Onderdelen van de GWR-circuits zijn in kaart gebracht en bijdragen van verschillende componenten zijn bepaald. Belangrijk is dat GWR-circuits associatief en niet-associatief leren ondergaan5,6,15-19. Tientallen jaren van onderzoek naar deze reflex hebben ook verschillende signaleringsroutes geïdentificeerd die een sleutelrol spelen in leren en geheugen20-24.

Verschillende preparaten van Aplysia werden gebruikt om cellulaire en moleculaire basis van geheugenopslag te bestuderen. Deze omvatten het intacte dier2,3, semi-intact preparaat1,7,13,14,16 en reconstitutie van belangrijke componenten van neurale circuits25-29. Een verminderde voorbereiding voor het verkennen van Aplysia ganglia voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van geïdentificeerde neuronale circuits wordt hier beschreven. De volgende vier geïdentificeerde neuronen werden bestudeerd. R15, een barstend neuron, L7 en L11, twee verschillende motorneuronen en R2, een cholinerge neuron werden bestudeerd. R2 is het grootste neuron beschreven in het ongewervelde zenuwstelsel. Kortom, deze methodologie omvat proteasebehandeling van ganglia, elektrofysiologische metingen voor en na farmacologische behandelingen en isolatie van enkele neuronen voor kwantitatieve analyse van genexpressie. Deze methodologie stelt ons in staat om moleculaire analyses te combineren met gelijktijdige opname van meerdere neuronen. Deze methodologie werd met succes gebruikt om reacties van R15- en L7-neuronen op acetylcholine (Ach) te bestuderen door gepaarde intracellulaire opnames. Na elektrofysiologische metingen werden R15 en L7 en andere geïdentificeerde neuronen zoals L11 en R2 geïsoleerd voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) analyse van expressie van CREB1, een transcriptiefactor die belangrijk is voor geheugenopslag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van abdominale ganglia, elektrofysiologische metingen en isolatie van enkele geïdentificeerde neuronen uit abdominale ganglion van Aplysia californica

  1. Houd Aplysia in het laboratoriumaquarium met circulerend kunstmatig zeewater (ASW) bij 16 °C onder 12:12 licht:donker.
  2. Isolatie van abdominale ganglion.
    1. Verdoof dieren door 380 mM MgCl2-oplossing gedurende 5-10 minuten te injecteren (overeenkomend met 30-35% van het lichaamsgewicht van het dier).
    2. Identificeer het abdominale ganglion op basis van zijn positie in het centrale zenuwstelsel24,28.
    3. Verwijder de ganglia door chirurgische ingreep en bewaar onmiddellijk in kunstmatig zeewater bestaande uit 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2,2,5 mM NaHCO3en 10 mM HEPES (pH 7,4).
  3. Protease behandeling.
    1. Incubeer abdominale ganglion gedurende 30 minuten bij 34 °C±0,5 in een Petrischaal met 0,1% protease (dispase) verdund in ASW zoals hierboven beschreven.
      OPMERKING: De hoeveelheid van het gebruikte protease moet worden gestandaardiseerd met de leeftijd en het gewicht van de dieren. Over het algemeen zouden oudere en grotere dieren meer protease nodig hebben.
  4. Verwijdering van gangliaschede.
    1. Na de enzymbehandeling de ganglia vastmaken aan de Sylgard Silicone-basis van een celkamer (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) en doordrenkt met ASW (debiet: 150 μl/min) bij kamertemperatuur (18 °C±2 ).
      OPMERKING: Om de zichtbaarheid van geïdentificeerde neuronen te vergroten, plaatst u het ganglion op de bovenkant van een polycarbonaat glazen cilinder (figuur 1) (diameter Ø = 2 mm gemodificeerde celkamer) die gemakkelijk van onderaf kan worden verlicht met behulp van een verrekijker stereomicroscoop met 20X en 40X vergroting.
    2. Verwijder voorzichtig de huls van het ganglion met behulp van tangen en microscissors.
  5. Gelijktijdige elektrofysiologische opname van twee neuronen.
    1. Identificeer neuron van belang.
    2. Impale het neuron met een enkele intracellulaire scherpe microelectrode met weerstand 10-15 MΩ gevuld met 3 M KCl oplossing.
    3. Registreer neuronale activiteit (10 kHz-bandpas) met behulp van een intracellulair opnamesysteem.
    4. Verwerk de opnamegegevens met behulp van elektrofysiologiesoftware zoals Axograph.
      OPMERKING: Men kan eenvoudig opnemen vanuit meerdere neuronen. Neuronen L7, L11 of R15 en R2 zijn gemakkelijk te identificeren op basis van hun positie. Twee versterkers en twee micromanipulatoren zijn nodig voor het gelijktijdig opnemen van twee L7- en R15-neuronen (figuur 2).
  6. Drugstoepassing.
    1. Breng het medicijn naar keuze aan in de celkamer door voorzichtig te pipetten of injecteer rechtstreeks in neuronen.
    2. Voer elektrofysiologische metingen uit.
      OPMERKING: Afhankelijk van het experimentele doel kan men verschillende elektrofysiologische parameters van neuronen meten, zoals de veranderingen in membraanpotentiaal (MP) of actiepotentiaal (AP) voor, tijdens en na de toepassing van het geneesmiddel.
  7. Isolatie van enkele neuronen.
    1. Aan het einde van de elektrofysiologische experimenten, stop de perfusie van ASW en was het ganglion met 100% ethanol.  Blootstelling aan ethanol zal de neuronen versteaaien en, met behulp van fijne tangen, het gemakkelijk maken om individuele neuronen te verwijderen zonder andere neuronen uit het ganglion te beschadigen.
    2. Verwijder enkele neuronen onder een stereomicroscoop en breng over op een kleine Eppendorf-buis met ijskoud RNA-extractiereagens van 500 μl. Geïsoleerde enkelvoudige neuronen kunnen worden opgeslagen in RNA-extractiereagens bij -80 °C voor toekomstige analyse.

2. RNA-isolatie van enkele neuronen en genexpressieanalyse door kwantitatieve real-time PCR (qPCR)

  1. Voorzorgsmaatregelen om RNA-afbraak te minimaliseren:
    Ribonucleases (RNases) degraderen RNA en zijn zeer stabiele en actieve enzymen. Neem de volgende stappen tijdens het hanteren van RNA's.
    1. Reinig het werkgebied en de instrumenten met RNase deactiverende middelen.
    2. Draag te allen tijde handschoenen tijdens het hanteren van RNA en wissel handschoenen vaak.
    3. Gebruik alleen RNase-vrije kunststoffen om RNA's te verwerken.
  2. Isoleren van totaal RNA van enkele neuronen:
    1. Standaard Trizol protocol voor RNA isolatie kan worden gebruikt om RNA's te isoleren van enkele neuronen. Voeg kort 20% v/v chloroform toe aan Trizol, meng goed door korte vortexing.
    2. Plaats de buizen 10 min op rotator bij 4 °C. Draai de Trizol-Chloroform mix op 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
    3. Verzamel de waterfase en breng over naar een verse buis.
    4. Voeg natriumacetaatoplossing (pH 5,5) toe aan een eindconcentratie van 0,3 M, 100 ng/ml coprecipitant GlycoBlue en 2,5 volumes 100% ethanol om RNA te precipitaten.
    5. Meng de monsters goed en incubeer 's nachts bij -80 °C.
    6. Draai de monsters op 12.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en een kleine blauwe pellet is zichtbaar aan de onderkant van de buis.
    7. Verwijder het supernatant en was de pellet met 850 μl 75% ijskoude ethanol op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    8. Verwijder het supernatant voorzichtig en droog de RNA-pellet maximaal 7-10 minuten aan de lucht.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat RNA niet lang wordt laten drogen als over-het drogen van de RNA-pellet maakt solubilisatie erg moeilijk.
    9. Eenmaal gedroogd, resuspend de RNA pellet in 10 μl RNAse vrij water en bepaal de RNA concentratie.
      OPMERKING: Bepaal de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer. Wanneer u RNA niet meteen gebruikt, bewaar RNA dan bij -80 °C.
  3. aRNA-synthese uit enkele neuronen:
    1. Versterk het RNA (één of twee rondes afhankelijk van de experimentele doelstelling) met behulp van een in de handel verkrijgbaar lineair RNA-versterkingssysteem.
      OPMERKING: Het totale RNA van enkele neuronen varieerde van ~10-60 ng. De verwachte opbrengst van de eerste versterkingsronde is ~100-300 ng en de tweede versterkingsronde is ~0,8-1,5 μg RNA.
  4. Omgekeerde transcriptie van RNA:
    1. Gebruik 1,0 μg aRNA in 20 μl van een omgekeerde transcriptiereactie om cDNA uit aRNA te genereren. Hiervoor zijn verschillende kits in de handel verkrijgbaar.

      OPMERKING: cDNA is gesynthetiseerd volgens het protocol van de fabrikant met behulp van de volgende instellingen op thermische cycler.
      5 min bij 25 °C
      30 min bij 42 °C
      5 min bij 85 °C
      Vasthouden bij 4 °C
    2. Sla na de omgekeerde transcriptiestap de cDNA op bij -20 °C voor langdurige opslag.
  5. Primer ontwerp en standaardisatie:
    Verschillende uitstekende softwareprogramma's zijn gratis beschikbaar voor het ontwerpen van primers voor realtime versterkingen.
    1. Selecteer 18-24 mer oligonucleotiden die 70-110 bp amplicons produceren en synthetiseren de primers met behulp van commerciële bronnen.
      OPMERKING: Voor elk interessant gen moeten twee tot drie primerparen worden ontworpen. Elke primerset moet gestandaardiseerd worden door qPCR. De voorwaartse en omgekeerde primerparen die werden gebruikt voor gen CREB1 (figuur 4) staan hieronder:

      Primer set 1
      Voorwaarts: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
      Achteruit: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Primer set 2
      Voorwaarts: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Achteruit: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Om de beste primer te selecteren die voor de downstreamanalyses moet worden gebruikt, controleert u de Ct-waarde en de vorm van de versterkingscurve in qPCR.
      OPMERKING: Primers die Ct (Cycle threshold) waarden geven tussen 10-35 in de 40 ronde versterking en vloeiende curven tijdens de exponentiële fase van de PCR gevolgd door een glad plateau zijn optimaal voor genexpressieanalyses.
  6. Kwantitatieve Real Time PCR (qPCR):
    Opmerking: Gebruik geschikte buizen of platen die compatibel zijn met de qPCR-machine.
    1. Verdun cDNA tot 5x met nucleasevrij water.
    2. Voeg aan 2 μl verdund cDNA 8 μl van een qPCR-mastermix toe met 2 μl H2O, 5 μl 2x SYBR Green mastermix en 1,0 μl 10 μM (elk) voorwaartse en omgekeerde primer.
    3. Sluit de buizen en sluit de plaat af na het pipetten van cDNA en mastermix. Meng de inhoud door zachtjes te tikken en 30 sec. bij 1.500 tpm naar beneden te draaien.
    4. Ga verder met het instellen van de qPCR-machine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De gewichten van dieren die in deze studie werden gebruikt, varieerden van 100-200 g. Volgens de beschreven protocollen voerden we elektrofysiologische metingen en moleculaire analyse uit van neuronen van abdominale ganglia geïsoleerd van dieren variërend van 2-5 g tot 200-300 g.

Standaardisatie van proteasebehandeling is belangrijk voor succesvolle elektrofysiologische metingen van neuronen in de ganglia. Aanvankelijk werden meerdere proteaseconcentraties (Dispase) en duur gebruikt en burstin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het neuron R15 is betrokken bij het reguleren van cardiovasculaire, spijsverterings-, ademhalings- en voortplantingssystemen30. Een regelmatig ritmische barstende activiteit van de AP is een kenmerk van R15. Zoals getoond in de resultatensectie, laten gekoppelde opnames van R15 en L7 zien dat het gangliapreparaat de activiteit van R15-neuronen heeft behouden. R15- en L7-neuronen reageerden adequaat op Ach. Dit gangliapreparaat kon tot 8-10 uur worden gehandhaafd en elektrofysiologische activiteit kon continu w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken de Whitehall Foundation hartelijk voor hun financiële steun en startfondsen van The Scripps Research Institute voor het uitvoeren van dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2•2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteaseGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% EthanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5.5AmbionAM9740
Nuclease free waterAmbionAM9737
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
ForcepsFine Science Tools11252-20
ScissorsFine Science Tools15000-08
Stainless Steel Minutien Pins Fine Science Tools26002-10 of
26002-20
Veriti Thermal CyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
5430R CentrifugeEppendorf5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCRApplied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR
AmplifierBRAMP-01RNPI Electronics
Digidata ConverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
Micro ManipulatorPatch StarScientifica

Referenties

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Analyse van enkelvoudige neuronenelektrofysiologische registratiegenexpressieanalyseproteasebehandelingverwijderen van ganglionomhulselRNA-isolatiekwantitatieve PCRintracellulaire elektrofysiologieneuronisolatie
Aplysia Ganglia voorbereiding voor elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.