Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

Samenvatting

Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.

Samenvatting

Het baculovirus expressiesysteem is een krachtig hulpmiddel voor expressie van recombinante eiwitten. Hier gebruiken we het om correct gevouwen en geglycosyleerd versies van het influenza A-virus oppervlakte glycoproteïnen produceren - het hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA). Als voorbeeld, we kozen voor de HA en NA eiwitten door het nieuwe H7N9 virus dat onlangs naar voren gekomen in China uitgedrukt. Maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor HA en NA eiwitten op andere influenza A en B virusstammen uitgedrukt. Recombinant HA (rHA) en NA (RNA) eiwitten zijn belangrijke reagentia voor immunologische testen zoals ELISPOT en ELISA, en zijn ook veel gebruikt voor vaccin standaardisatie, antilichaam ontdekking, isolatie en karakterisering. Bovendien kunnen recombinante NA moleculen worden gebruikt om te screenen op kleine moleculen remmers en zijn nuttig voor het karakteriseren van de enzymatische functie van de NA, en de gevoeligheid voor antivirale middelen. Recombinante HA-eiwitten zijn ook being getest experimentele vaccins in diermodellen, en een vaccin op basis van recombinant HA werd onlangs erkend door de FDA voor gebruik bij mensen. Werkwijze beschrijven we hier om de moleculen is eenvoudig en kan onderzoek naar influenza-laboratoria, aangezien het voor de productie van grote hoeveelheden eiwitten snel en tegen lage kosten. Hoewel hier richten we ons op influenzavirus oppervlakte glycoproteïnen kan deze werkwijze ook worden gebruikt om andere virale en cellulaire oppervlakte-eiwitten.

Inleiding

Als eerste reactie op de recente opkomst van nieuwe H7N9 influenza-virusstam in China, verwierven wij plasmiden die de genomische sequenties voor de hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) genen van de eerste twee isolaten. Met deze plasmiden konden we snel bouwen baculovirus expressievectoren voor de productie van recombinant HA en NA in insectencellen. Deze uitdrukking systeem goed is ingeburgerd in ons laboratorium en is van cruciaal belang voor veel van onze lopende onderzoeksprojecten ^1-8 bewezen. Insect cellen in staat zijn te kunnen vouwen en post-translationeel complexe eiwitten te wijzigen. Deze modificaties omvatten N-gebonden glycosylering, wat belangrijk is voor veel virale glycoproteïnen. Als zodanig is het niet verwonderlijk dat de baculovirussysteem vrij is opgericht voor het uiten van influenzavirus oppervlakte-antigenen. In feite zijn veel van de HA en NA kristalstructuren zijn opgelost middels insectencel tot expressie gebrachte eiwitten ^9-11. Een ander voordeel van desysteem is de betrouwbare eiwitrijk opbrengsten van maximaal 30 mg HA / L cellen (gebaseerd op onze ervaring met meer dan 50 verschillende eiwitten HA) - gevolg van virus-infectie aangedreven expressie van de sterke polyhedrine promoter.

Verwijdering van het transmembraan en endodomein van het HA en NA eiwitten maakt expressie van uit te scheiden, oplosbare versies van de eiwitten en daarmee aanzienlijk vergemakkelijkt het zuiveringsproces. Bovendien zijn deze ectodomeinen hexahistidine gelabeld en derhalve worden gezuiverd middels affiniteitschromatografie met ^{Ni2 +-hars.} De transmembraandomeinen van HA en NA eiwitten dragen respectievelijk homotrimeer en homotetrameer formatie. Om deze oligomerisaties behouden, voegen we een C-terminaal domein trimerisatie de HA-en een N-terminale tetramerisatie domein aan de NA constructen (figuur 1). We hebben onomstotelijk aangetoond dat een dergelijke trimerisatie domein stabiliseert functionele, gevolgenGraco behoudt conformationele epitopen op de stengel-domein van de HA ^1. De juiste tetramerisatie van de NA kan ook bijdragen aan vouwen en NA functie ¹⁰ corrigeren. Sequenties en baculo-overdracht vectoren herbergen trimerisatie of tetramerisatie domeinen kunnen worden opgevraagd bij de auteurs of van andere laboratoria in het ^{veld, 9,10,12.}

Een ander belangrijk punt voor expressie van uitgescheiden eiwitten in insectencellen is de keuze van de juiste cellijn. Terwijl Spodopterafrugiperda afgeleid Sf9 cellen ondersteunen baculovirus replicatie heel goed en worden meestal gebruikt voor virus rescue en vermeerdering, hebben zij beperkte capaciteit om grote hoeveelheden eiwit uitscheiden. Trichoplusia ni afgeleid BTI-TN-5B1-4 cellen (algemeen bekend als High Five) hebben een hogere uitscheiding capaciteit en zijn de cellijn van de keuze voor expressie in dit protocol ^13,14. Voorts is het nuttig te verminderen of zelfs te verwijderen foetaal runderserum (FBS) van expressie culturen. We gebruiken ook media met verminderde (3%) FBS inhoud voor het kweken van het virus werkvoorraden en voeren we de eiwitexpressie in serumvrij medium.

Recombinant HA en NA eiwitten worden gebruikt voor vele immunologische technieken. Misschien is de meest voorkomende is in ELISA-testen voor het meten van serum conversie na vaccinatie bij mensen of dieren ^4,6,7,15. Heeft en NA worden ook gebruikt in ELISPOT testen zowel stimulerende moleculen en detectie reagentia voor antilichamen uitscheidende cellen ^16. Het gebruik als moleculaire lokaas kan specifiek sorteren voor plasmablasten of andere soorten B-cellen die vervolgens kunnen worden gebruikt om (therapeutische) monoklonale antilichamen (mAbs) te isoleren. Recombinant HA en NA moleculen worden verder gebruikt voor de karakterisatie van deze mAbs ^8. Andere voorbeelden zijn de studie van de pH-stabiliteit of receptor specificiteit van HAS door verschillende virus isolaten vertoonden, of kwantitatief beoordelen van specifieke NA enzymatischeactiviteit of resistentie tegen remmers. Verder recombinant gezuiverd HA kan worden om HA-gehalte van geïnactiveerd influenzavirus vaccin standaardiseren.

Belangrijk, rHA (en tot op zekere hoogte NA) kandidaat-vaccins worden momenteel getest in diermodellen en klinische proeven op mensen met een kandidaat-vaccin wordt in licentie gegeven door de FDA in 2013 ^2,17-19. Het voordeel van deze nieuwe vaccins is dat door de recombinante aard van deze eiwitten, het arbeidsintensieve proces van produceren van hoge groei reassortante virussen kunnen worden vermeden. Misschien nog belangrijker is het feit dat de HA rendement is hoog en reproduceerbaar van stam tot stam. Ook, omdat deze vaccins worden geproduceerd in een ei-vrij systeem, ze niet eiwitverontreinigingen die problematisch zijn voor mensen met een ei-allergie bevatten.

Hier kozen we voor de HA en NA eiwitten tot expressie van twee isolaten van de nieuwe Chinese H7N9 griepvirus, A / Anhui/1/13 en A/Shanghai/1/13 ^20,21. Dit zijn geschikte voorbeelden, maar de beschreven protocol kan worden toegepast voor expressie van een influenza A en B HA en NA eiwitten en kunnen worden aangepast aan andere uitgescheiden virale of cellulaire eiwitten tot expressie. Trimere of tetramere transmembraan eiwitten kunnen worden gekloneerd in de expressiecassettes voor HA en NA, respectievelijk. Echter, de meeste oplosbare uitgescheiden cellulaire eiwitten, zoals interferonen bijvoorbeeld geen extra domein voor stabilisatie nodig en kan alleen worden uitgedrukt met een C-terminale hexahistidine tag.

Protocol

1. Generatie van recombinant Baculovirus

1. Klonering in baculovirus transfer-plasmiden
   1. Clone H7 HA en N9 NA ectodomain (of een andere HA of NA-gen) in aangepaste pFastBac overdracht plasmiden (zie inleiding). Vectoren voor HA bevattende een C-terminale domein trimerisatie en een hexahistidine tag, en voor NA die een N-terminale tetramerisatie domein en hexahistidine tag, beschreven ^1,10,11,22 (figuur 1) en kan worden opgevraagd de auteurs.
      Toelichting: HA ectodomeinen uitgedrukt zonder trimerisatie domein onjuist gevouwen, wat leidt tot verlies van conformationele neutraliserende epitopen, met name in de stengel domein. Ook de NA enzymatische werking te goede tetramerisatie.
   2. Generatie bacmiden
      Transformeren baculovirus transfer-plasmiden die HA en NA genen in DH10Bac bacteriën volgens met behulp van een baculovirusexpressiesysteemsysteem volgens de instructies van de fabrikant. Isoleren en zuiveren bacmiden met een Midiprep kit volgens instructies van de fabrikant (figuur 2).
2. Redding van recombinant baculovirus en verificatie van eiwitexpressie
   Toelichting: De volgende stappen moeten aseptisch worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. Voer deze procedure zelfstandig voor HA en NA (of een ander gen van belang). Insectencellen zijn meestal gekweekt bij 28 ° C zonder _CO2. Sf9 cellen voor dit protocol worden gekweekt in volledig TNM-FH insectencellen medium aangevuld met 10% FBS, 1% Pen-Strep ^* en 0,1% Pluronic F68 oplossing, tenzij anders vermeld, en gepasseerd 1:04 twee keer per week. High Five cellen worden gekweekt in serumvrij medium SFX en gepasseerd 1:15 twee keer per week.
   ^* Toevoeging van antibiotica moet facultatief worden beschouwd als de gehele protocol en aangepast aan de gebruikte materialen in elk laboratorium praktijken.
   1. Plate Sf9 insectencellen in 6-well platen bij een dichtheid van 2 x 10 ⁵ cellen / cm ² en laat zitten voor 20 min in een 28 ° C incubator (zonder _CO2).
   2. Meng 2 pg (geconcentreerd 0,5-2 ug / ul) van recombinant bacmide met 100 ul van TNM-FH-medium (serum vrij, 1% Pen-Strep). Meng 6 pl transfectiemiddel met 100 ul van TNM-FH-medium (serum vrij, Pen-Strep). Combineer de twee volumes, meng voorzichtig en laat zitten voor 20 minuten bij kamertemperatuur (transfectie mengsel). Omvatten een mock-transfectie als controle (figuur 3).
   3. Verwijder supernatant van uitgeplaat Sf9-cellen (cellen nu handhaven op de plaat) en vervangen door 2 ml serumvrij TNM-FH-medium bevattende Pen-Strep (1%). Voeg de volledige omvang van de transfectie-mengsel (van stap 1.2.2) en rock de 6-wells plaat zorgvuldig 5 sec. Incubeer in een 28 ° C incubator zonder _CO2 gedurende 6 uur (Figuur 3).
   4. Vervang media with vers volledig TNM-FH media (met 10% FBS, 1% Pen-Strep en 0,1% Pluronic F68). Incubeer in een 28 ° C incubator zonder CO ₂ voor 6 dagen. Controleer cellen af ​​en toe onder een microscoop. Geïnfecteerde cellen verschijnen meestal groter, ronder zijn kernen vergroot en gaan (figuur 4) los.
   5. Oogst van cellen en bevestiging van eiwit expressie
      1. Oogst cellen 6 dagen na transfectie door centrifugatie bij 2000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Het supernatant bevat het recombinant baculovirus - dit zal worden gebruikt om werkvoorraden genereren direct, of kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende jaren.
      2. Om eiwit expressie controleren verzamelen pellets en resuspendeer in 500 ui PBS. Meng 50 ul van de ophanging met 50 ul van SDS-PAGE laadbuffer (met een reductiemiddel). Run SDS-PAGE en uitvoeren van een Western blot analyse met een anti-hexahistidine antilichaam om genexpressie te bevestigen. Omvatten cellen van de mocktransfectie als negatieve controles (figuur 3).
   6. Bereiding van werkvoorraden
      1. Plaat 5 x 10 ⁵ Sf9 cellen / cm ² in een T175 cm ² kolf en laat zitten voor 20 minuten laat ze hechten aan het gerecht. Vervang volledige TNM-FH media met TNM-FH-medium dat 3% FBS (en 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
      2. Infecteren cellen met 100 pi van de redding supernatant. Incubeer in een 28 ° C incubator zonder CO ₂ voor 6 dagen en check af en toe als de cellen geïnfecteerd raken (zoals beschreven in stap 1.2.5.).
      3. Spin bij 2000 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en verzamel supernatant. Dit is nu uw P2 voorraad. Deze voorraad kan onbeperkt worden bewaard bij 4 ° C. Herhaal de procedure infectie met 100 ui P2 voorraad cellen kan infecteren. De resulterende voorraad heet P3 of werkvoorraad, die bij 4 ° C worden opgeslagen of direct gebruikt voor eiwitexpressie. De P3 voorraad bevat meestal 10 ^{7 -10 9 plaque vormende eenheden / ml.}

2. Protein Expression and Purification

Toelichting: Sf9 cellen de groei van baculovirus zeer goed. Hun capaciteit om grote hoeveelheden recombinant eiwit uitscheiden beperkt. Daarom gebruiken we een ander insect cellijn, High Five cellen, voor de expressie van recombinante eiwitten uitgescheiden. Deze cellen ondersteunen geen baculovirus replicatie tot zeer hoge titers ^13, maar hebben een hoge secretoire capaciteit.

1. Opgroeien High Five cellen
   Grow High Five cellen in SFX insect celcultuurmedium in T175 cm ² flessen. Passage om de andere dag 01:03. Voor een 200 ml uitdrukking cultuur moet je 5 confluerende kolven groeien.
2. Het oogsten en de besmetting van High Five cellen
   1. Los High Five cellen van 5 T175 cm ² kolven door de kolven te tikken met je hand. Verzamel de cel Suspension en overbrengen naar 50 ml centrifuge buizen.
   2. Spin bij 1200 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de bovenstaande vloeistof door decanteren en verenigen de pellets door resuspenderen in 15 ml P3 voorraad.
   3. Laat zitten voor 15 min in de stroomkap (Figuur 5).
   4. Transfer 200 ml Hyclone SFX kweekmedium in een schone, steriele 1000 ml schudkolf (zonder Buffles, afgesloten met aluminiumfolie voor het autoclaveren, had niet mogen worden gebruikt voor de bacterieculturen voor).
   5. Breng de P3/cell schorsing in de shaker kolf. Seal met steriele aluminiumfolie en overdracht kolf in een shaker. Schud bij 70 tpm bij 28 ° C 72-96 uur.
3. Het oogsten van recombinant eiwit uit High Five cel expressie bovenstaande vloeistoffen
   1. 72-96 uur na infectie overdracht kweeksupernatantia in 500 ml centrifugeren emmers. Spin bij 5500 g gedurende 20 min bij 4 ° C. In de tussentijd spoel de schudflessen 3x met dubbel gedestilleerd water(DDH ₂ O).
   2. Overdracht 3 ml Ni-hars suspensie in een 50 ml buis met 45 ml PBS (een vereist per 200 ml kweek). Goed schudden en draaien op 3000 xg bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Giet het PBS en bewaar de pellet. Meng het insect celsupernatant met de Ni-harspellet en overbrengen naar het al gespoeld schudflessen. Incubeer bij 4 ° C gedurende 2-4 uur onder schudden (figuur 6).
   3. Mount 10 ml kolom polypropyleen op een klem op een statief. Verwijder beide doppen en plaats een beker onder de kolom om de stroming te verzamelen door middel van (afval). Neem de shaker fles uit de shaker en beginnen aan het supernatant / slurrymengsel overbrengen op de kolom, het zal de Ni-hars te behouden en alleen de bovenstaande zal doorstromen. Passeer het gehele volume in de kolom (Figuur 7).
   4. Was de hars 4x met 15 ml wasbuffer (50 mM Na ₂ HCO _3, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8). Laat al het wassen buffer drainuit de kolom en sluit deze met de dop (onderkant).
   5. Voeg 2 ml elutiebuffer (50 mM Na ₂ HCO _3, 300 mM NaCl, 300 mM imidazool, pH 8) en laat zitten voor 5 minuten. Open kolom en vang het eluaat. Herhaal dit 3 keer (in totaal 8 ml elutiebuffer). Eluaat dat hoge concentraties van eiwitten bevat toont typisch schuim bij het ​​schudden (figuur 7). Houd eluaat op nat ijs waar mogelijk.
4. Bufferuitwisseling en concentratie
   1. Prespin 15 ml ultrafiltratie centrifugeren eenheden bij 3000 xg bij 4 ° C gedurende 20 minuten (30 kDa cut-off voor HA / NA, maar kunnen variëren afhankelijk van het gezuiverde eiwit grootte) met PBS (pH 7,4-7,6). Gooi de stroom door en de belasting eluaat op de spin kolom. Vul met 5 ml steriele, ijskoude PBS en centrifugeren gedurende 60 minuten bij 3000 xg bij 4 ° C.
   2. Discharge stroom door opnieuw vullen met 15 ml ijskoud PBS en centrifugeren gedurende 60 minuten bij 3000 xg bij 4 ° C. Herhaal deze procedureDure nog een keer.
   3. Neem de spin kolom uit de centrifuge en het verzamelen van de buffer uitgewisseld concentraat (meestal 200 pl). Dit is sterk geconcentreerd recombinant eiwit. Spoel de kolom spin met 400 ul van steriele ijskoude PBS en voeg deze toe aan het concentraat. Houd het concentraat op ijs te allen tijde.

3. Karakterisering en Quality Control

1. Meten eiwitconcentratie
   Neem een ​​monster van het concentraat en meet dat met behulp van uw eiwit kwantificatie methode van keuze. Stel proteïne concentratie 1 mg / ml door toevoeging van PBS en vries kleine porties tot -80 ° C. Vries dooi cycli schaden de eiwitstructuur en kan leiden tot aggregatie.
2. SDS-PAGE en Coomassie kleuring
   Run 500 ng van het eiwit op een SDS-PAGE en voer een Coomassie kleuring. Voor een snelle en gemakkelijke kleuring gebruiken Coomassie reagens in combinatie met een magnetron protocol. HA-eiwitten meestal verschijnen op 64kDa terwijl NA eiwitten moet draaien op een formaat van ongeveer 56 kDa (figuren 8A en B). Met behulp van de beschreven protocol moet je geen afbraakproducten zien. Als de afbraak plaatsvindt is het meestal een teken van gist / schimmel besmetting tijdens expressie. In dit geval de procedure herhalen en zorg ervoor dat alles steriel te houden.
3. Western Blot / ELISA
   Om eiwit identiteit te verifiëren raden we doen om een ​​Western blot of ELISA-test met een specifiek antilichaam. Idealiter worden ELISA-testen uitgevoerd met een antilichaam dat bindt aan conformationele epitopen (bijv. anti-HA antilichamen steel ^1). Met een dergelijk antilichaam de correcte vouwing van het eiwit worden bevestigd (Figuur 8C).
4. Meten NA activiteit
   Correcte vouwing van de virale NA kan worden bepaald door NA activiteit. We raden aan om deze test uit te voeren met behulp van de in de handel verkrijgbare NA * STAR assay (volg gewoon de richtsnoeren voor de gebruikers).

Resultaten

HA moleculen uit A/Shanghai/1/13 en A/Anhui/1/13 goed uitgedrukt met opbrengsten van ongeveer 20 mg / L cultuur. NA moleculen van beide stammen vertoonden matige expressieniveaus van 0,2 mg / l cultuur A/Shanghai/1/13 tot 0,7 mg / L voor A/Anhui/1/13. Alle vier eiwitpreparaten had zeer weinig tot geen onzuiverheden (figuren 8A en B) met HEEFT zijnde van een hogere zuiverheid dan NA dat verklaard kan worden door de expressie niveau. A/Shanghai/1/13 HA werd verder geanalyseerd met behulp ...

Discussie

Hoewel expressie van influenzavirus HA en NA eiwitten in insectencellen met het baculovirus expressiesysteem het algemeen ongecompliceerd, er een aantal belangrijke punten om te overwegen. Het is belangrijk, zoals in de inleiding, dat de ectodomeinen van HA en NA worden uitgedrukt in fusie met trimerisatie of tetramerisatie domeinen, respectievelijk. Deze domeinen correcte vouwing van de moleculen begeleid vanuit het transmembraandomein, die niet voorkomen als alleen het ectodomein uitgedrukt. Bijvoorbeeld, de expressie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van materiaal/apparatuur	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen/Beschrijving
Bac-to-Bac Baculovirus expressie systeem	Invitrogen	10359-016	Volg de instructies van de fabrikant
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagens	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrifugafilters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Polypropyleen kolommen (5 ml)	Qiagen	34964
Max efficiency DH10Bac bacteriën	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazool	Sigma-Aldrich	I2399-100G	voor elutie en wasbuffers
Sf9 cellen	ATCC	CRL-1711
High Five cellen	Invitrogen	B85502