Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Summary

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Abstract

Eiwit-DNA-interacties in het hart van vele fundamentele cellulaire processen. Bijvoorbeeld, DNA-replicatie, transcriptie, reparatie en chromosoom organisatie onder DNA-bindende eiwitten die specifieke DNA-structuren of sequenties herkennen. In vitro experimenten hebben bijgedragen gedetailleerde modellen voor de functie van vele soorten DNA-bindende eiwitten te genereren, maar De exacte mechanismen van deze processen en hun organisatie in de complexe omgeving van de levende cel blijven veel minder begrepen. We hebben onlangs introduceerde een methode voor het kwantificeren van DNA-reparatie-activiteiten in levende Escherichia coli cellen met behulp Photoactivated Lokalisatie Microscopy (PALM) in combinatie met single-molecule tracking. De algemene benadering identificeert individuele DNA bindingsgebeurtenissen door de verandering in de mobiliteit van een eiwit bij associatie met het chromosoom. De fractie van gebonden moleculen biedt een directe kwantitatieve maat voor het eiwit activity en overvloed van substraten of bindingsplaatsen op het eencellige niveau. Hier beschrijven we het concept van de werkwijze en demonstreren monstervoorbereiding, data acquisitie en procedures gegevensanalyse.

Introduction

Dit protocol beschrijft de directe meting van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen. De techniek maakt gebruik van de wijziging van de diffusiecoëfficiënt van een fluorescent gelabeld eiwit als het bindt het chromosoom (figuur 1). De methode die wij gebruiken DNA polymerase I (Pol1), een prototypisch DNA-bindend eiwit dat DNA gaten in bekledings bundel replicatie en excisie pathways ¹ vult tonen.

De komst van de super-resolutie fluorescentie microscopie maakt visualisatie van moleculaire structuren in cellen met nanometer resolutie. Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) maakt gebruik van fluorescerende eiwitten die kunnen worden geactiveerd vanuit een eerste donkere toestand naar een fluorescerende toestand (figuur 2). Slechts een deel van alle gemerkte moleculen geactiveerd allen tijde de positie te bepalen op een sequentiële wijze, onafhankelijk van de thij totaal concentratie van gemerkte moleculen in het monster ^2. De lokalisatie precisie per molecuul hangt vooral af van de grootte van de fluorescerende puntspreidingsfunctie (PSF), het aantal verzamelde fotonen, en de achtergrond signaal ^3. Vele toepassingen van deze methode gericht op de verbeterde visualisatie van cellulaire structuren. Het besef dat PALM kan worden gecombineerd met single-molecule volgen ⁴ nieuwe wegen geopend voor direct volgen de beweging van willekeurige getallen van gelabelde eiwitten in levende cellen. Verhoogde gevoeligheid en temporele resolutie van fluorescentie microscopen nu is het volgen van enkele diffusie fluorescerende eiwitten toestaan ​​in het bacteriële cytoplasma ^5.

Hier maken we PAmCherry, een fluorescent proteïne dat onomkeerbaar converteert van een eerste niet-fluorescerende toestand naar een fluorescerende staat bij bestraling met 405 nm licht ^6. Geactiveerde PAmCherry fluoroforen kan imagod door excitatie bij 561 nm en bijgehouden voor verschillende frames tot fotobleken. We tonen het vermogen van de methode om voorbijgaande DNA-bindende gebeurtenissen van enkele eiwitten te identificeren met behulp van een fusie van Pol1 en PAmCherry. Behandeling van cellen met methylmethaansulfonaat (MMS) veroorzaakt DNA-methylatie schade die wordt omgezet in gapped DNA substraten door base-excisie reparatie-enzymen. Onze methode toont duidelijke binding van enkele Pol1 moleculen in reactie op MMS schade ^7.

Protocol

1. Celkweek

Gebruik steriele cultuur buizen en pipet tips. De E. coli stam AB1157 polA-PAmCherry draagt ​​een C-terminale PAmCherry fusie van Pol1. De fusie is bij natieve chromosomale locatie ingebracht door vervanging van het wild-type gen met lambda-Rode recombinatie zoals beschreven in Datsenko et al.. ⁸ Functionaliteit van het fusie-eiwit werd bevestigd zoals beoordeeld door cellulaire groei en gevoeligheid voor het DNA beschadigende middel methyl methaansulfonaat (MMS). Meer informatie over de bouw van de cel stam kan worden gevonden in Uphoff et al.. ^7, Datsenko et al.. ^8, en Reyes-Lamothe et al.. ⁹ celculturen worden gekweekt in M9 minimaal medium om autofluorescentie verminderen en te voorkomen achtergrond deeltjes op het objectglaasje. Als alternatief kan een voedselrijke beschreven medium gebruikt ^10.

1. Streak de E. coli stam Ab1157 polA-PAmCherry uit een bevroren glycerol voorraad op een Luria Broth (LB) agarose plaat met selectieve antibiotica (hier, 25 ug / ml kanamycine) en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.
2. Inoculeer een 5 ml LB-kweek van een enkele cel kolonie groeien bij 37 ° C onder schudden bij 220 tpm gedurende 3 uur.
3. Verdun de cultuur 1:10.000 in 5 ml minimaal medium (M9-medium, MEM aminozuren + proline, MEM vitamines, 0,2% glycerol) en incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 220 rpm overnacht.
4. De volgende ochtend, het meten van de optische dichtheid (OD) met een spectrofotometer en verdun de cultuur in 5 ml vers minimaal medium tot OD 0.025. Kweek gedurende 2 uur bij 37 ° C onder schudden bij 220 rpm vroege exponentiële fase (OD 0,1).
5. Concentraat 1 ml cellen in een 1,5 ml microcentrifugebuis door centrifugatie bij 2300 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 20 ul resten van het medium en vortex.

2. Microscoop Slide Preparation

1. Bereid een 1,5% laag-fluorescentie agarose oplossing in dH ₂ O. Gebruik een magnetron om de agarose te smelten totdat de oplossing helder is. Meng 500 ul van de gesmolten agarose-oplossing met 500 ui 2x minimaal medium door voorzichtig pipetteren en in een enkele keer.
2. Spreid de agarose oplossing gelijkmatig over het midden van een microscoop dekglaasje (No 1.5 dikte). Dit moet snel worden gedaan voordat de agarose afkoelt, het vermijden van luchtbellen.
3. Strijk het pad met een tweede dekglaasje (nr 1,5 dikte). Voor achtergrond fluorescerende deeltjes te verwijderen, werden dekglaasjes eerder gebrand in een oven bij 500 ° C gedurende 1 uur. Gebrande dekglaasjes worden bewaard weken bij kamertemperatuur bedekt met aluminiumfolie.
4. Voor DNA-schade experimenten, bereiden een agarose pad die 100 mM MMS. Volg de procedure in stappen 2.1-2.3, maar voeg 8,3 pl MMS 500 pl M9 medium voor mengen met 500 ui 1,5% gesmolten agarose, voor een eindconcentratie van 100 mM MMS. (Pas op MMS is giftig en mutageen en moeten met handschoenen, masker, bril en laboratoriumjas worden behandeld).
5. Verwijder de bovenste schuif van het pad en voeg 1 ui van geconcentreerde celsuspensie op het pad. Immobiliseren van de cellen door het bedekken van de pad met een ongebruikte verbrand dekglaasje (No 1.5 dikte, passend bij de microscoop objectief specificatie) en door heel zachtjes te drukken op de dia. De cellen moeten worden afgebeeld binnen 45 min van immobilisatie voordat de agarose pad droogt. Te drogen tijdens langere experimenten te voorkomen, kan agarose pads worden afgedicht met silicone pakkingen.
6. Voor DNA-schade experimenten, incubeer cellen geïmmobiliseerd op de agarose pad die 100 mM MMS voor 20 min in een vochtige container bij kamertemperatuur voor de beeldvorming.

3. Voorbereiden van Microscopie Data Acquisition

PALM is gebaseerd op de detectie en precieze lokalisatie van enkele fluorescerende eiwitten. De gevoeligheid en optimale afstemming vande microscoop is van cruciaal belang voor de kwaliteit van de gegevens. Single-molecule fluorescentie microscopen gebruiken typisch totale interne reflectie (TIR) ​​verlichting om de signaal-ruisverhouding te verbeteren prikkelen slechts fluoroforen in een dunne gedeelte boven het dekglaasje oppervlak. Hier, imaging binnen E. coli waarvoor zeer schuine verlichting ^11, die kan worden bereikt op een TIRF microscoop door een lichte afname van de hoek van het excitatielicht. PAmCherry beeldvorming verder vereist een 405 nm fotoactivatie laser en een 561 nm excitatie laser. De fluorescentie emissie wordt opgenomen op een elektron CCD (EMCCD) camera vermenigvuldigen met een vergroting resulteert in een pixel lengte van 114,5 nm / pixel. Voor optimale lokalisatie precisie moet de pixelgrootte ongeveer overeenkomt met de standaardafwijking breedte van de PSF voldoende bemonstering dragen zonder uitbreiding van het signaal over te veel pixels. Figuur 3 toont een schema van een minimale PALM opstart. Film 1geeft een indruk van de op maat gemaakte microscoop bouwproces; zie Uphoff et al. ⁷ voor een gedetailleerde beschrijving van het instrument..

1. Het uitvoeren van routinematige microscoop uitlijning. Meet de 405 nm en 561 nm continue golf laser intensiteiten in de voorkant van het objectief. Stel de 561 nm intensiteit 3,5 mW (~ 400 W / cm ²⁾ en 405 nm intensiteit 10 μW (~ 1 W / cm ^2). Gebruik een continu variabele grijsfilter wiel dat een geleidelijke aanpassing van 405 nm intensiteit 0-10 μW toelaat. Schakel de laser belichting tot de start van het experiment.
2. Plaats het monster op de microscoop podium en breng de cellen in beeld in doorvallend licht microscopie-modus (Figuur 4A). De EMCCD camera versterking moet worden uitgeschakeld om schade aan de camera te voorkomen door overbelichting.
3. Definieer een bijgesneden FOV om gegevens te verkleinen en vergroten de camera uitlezen snelheid.
4. Bedek het monster uit omgevingslicht en switch op de EMCCD camera gewin.
5. Stel de framesnelheid tot 15.26 msec / frame (inclusief 0,26 msec camera leestijd). Zie "Sluitertijd en excitatie intensiteiten" in het hoofdstuk discussie.
6. Toon de camera gegevens op de donkere achtergrond signaal (Figuur 4B) te controleren.
7. Schakel de 561 nm laser en controleer de excitatie achtergrond signaal (Figuur 4C).
8. Schakel de 405 nm laser voor fotoactivatie van de Pol1-PAmCherry fusie-eiwitten en de intensiteit tot fluorescentie PSF's verschijnen.
9. Pas de hoek van de activeringsbundel slechts een dunne deel van het monster nabij het dekglaasje oppervlak verlichten.
   1. Hiertoe wordt de laserbundel gefocusseerd in de achterkant brandvlak van een 100X NA 1,4 objectief (figuur 3). Vertalen van de focusseerlens loodrecht op de balk wordt de focus van het centrum van de doelstelling waardoor de straal het doel onder een hoek verlaten.
   2. Aim om de fluorescentie-intensiteit te maximaliseren en minimaliseren van de achtergrond signaal. Merk op dat strikte TIR excitatie optimaal beeld fluoroforen binnen 100 nm van het dekglaasje oppervlak echter imaging-DNA-bindende proteïnen verbonden met de E. coli nucleoid vereist dieper verlichting tot 0,8 micrometer.

4. Data Acquisition

Hier beschrijven we de algemene protocol voor de aankoop van een PALM film. Dezelfde procedure geldt voor de beeldvorming Pol1-PAmCherry fusie-eiwitten in onbeschadigde E. coli cellen en voortdurend DNA schade behandeling met MMS. Toepassing van de methode om fusie-eiwitten van verschillende moleculaire gewicht of aantal kopieën per cel zal verschillende acquisitie instellingen vereisen (zie Overleg sectie).

1. Zoek een nieuw gezichtsveld (FOV) van cellen in doorgelaten licht microscopie-modus en het beeld scherp. Neem een camera foto naar de cel contouren (Figuur 4A) op te nemen.
2. Bedek het monster uit omgevingslicht en schakel de EMCCD camera gewin.
3. Schakel de 561 nm laser en bleek de cellulaire autofluorescentie en achtergrond vlekken op het dekglaasje gedurende enkele seconden voordat gegevens oplevert. Voor cellen gekweekt en afgebeeld in M9-medium en gebruikmaking verbrand dekglaasjes er meestal zeer weinig fluorescentie-achtergrond, maar prebleaching kan nuttig zijn voor beeldvorming cellen in een rijk kweekmedium zoals LB zijn. Merk op dat intense belichting is giftig voor cellen, zodat prebleaching tot een minimum moet worden beperkt.
4. Start de verwerving van een PALM film onder continue 561 nm excitatie bij 15.26 msec / frame.
5. Schakel de 405 nm laser en geleidelijk de intensiteit in de loop van de film, die kunnen oplopen tot 1 W / cm ^2. Vermijd hogere 405 nm intensiteiten die cellulaire autofluorescentie veroorzaken. Besteed aandacht aan de dichtheid van fluorescerende moleculen - is het belangrijk om de activering tarieven laag te houden zodanig dat PSF's zijn duidelijkgeïsoleerd in elk frame (figuren 4D-F).
6. Noteer 10.000 frames / Film (afhankelijk van het aantal moleculen te beelden per cel), een film duurt gewoonlijk 2-3 minuten en vereist 0,5-1 GB schijfruimte afhankelijk van de grootte van het ZV.
7. Herhaal procedure voor meerdere FOV. Merk op dat elke FOV slechts een keer kan worden afgebeeld omdat PAmCherry fluorophores krijgen fotogeactiveerde en onomkeerbaar gebleekt.

5. Data Analysis

Een geautomatiseerde en robuuste gegevensanalyse raamwerk is essentieel voor de prestaties en efficiëntie van de werkwijze. We maken gebruik van aangepaste software geschreven in MATLAB.

1. Voer de lokalisatie analyse met behulp van algoritmen in Crocker et al.. ¹² beschreven, Holden et al.. ^13, HoldenI et al.. ¹⁴ en Wieser et al.. ¹⁵ PSF's worden eerst geïdentificeerd in band-pass gefilterde afbeelding van een met behulp van een Gaussische kernel met 7 pixels diameter (figuur 5A). Kandidaat posities komen overeen met PSF met een piek pixelintensiteiten boven 4,5 maal de standaardafwijking van het achtergrondsignaal (Figuur 5B). De lokaal helderste pixel per kandidaat PSV dient als eerste schatting voor het aanbrengen van een elliptische Gaussische functie (figuur 5C). De gratis fit parameters zijn: x-positie, y-positie, x-breedte, y-breedte, draaihoek, amplitude, en de achtergrond te compenseren. De elliptische Gauss masker is goed voor molecuul tijdens de belichtingstijd, die de PSF vervaagt en vervormt.
2. Teken de resulterende (x, y) lokalisatie van alle frames van de PALM film het doorgelaten licht imago microscopie van dezelfde FOV op. Lokalisaties van Pol1-PAmCherry moet binnen het centrale gebied van E. verschijnen coli-cellen (Figuur 6A). Als veel lokalisaties verschijnen buiten cellen, werd de lokalisatie drempel te laag ingesteld of het monster bevatte achtergrond fluorescerende deeltjes.
3. Voor geautomatiseerde volgen analyse, de MATLAB uitvoering van de in Crocker et al. beschreven algoritme. ¹² kan worden gebruikt (zie "Diffusion analyse" in de sectie Discussie). Posities die worden weergegeven in de volgende beelden binnen een door de gebruiker gedefinieerde tracking-venster zijn aangesloten om een ​​traject te vormen. In het geval dat meerdere gelokaliseerde binnen hetzelfde venster zijn backing uniek toegewezen door het minimaliseren van de som van stap lengtes. Voor een gedetailleerde bespreking van de verschillende overwegingen bij de berekening diffusiecoëfficiënten van single-deeltje bijhouden van gegevens, zie Wieser et al.. ¹⁵
   1. Het algoritme gebruikt een geheugen parameter om rekening te houden voorbijgaande knipperen of gemiste lokalisaties midden in een track. Hier stellen we de parameter geheugen 1 beeld, hogere waarden kunnen worden gebruikt voor het bijhouden fluoroforen met een lange levensduur donkere toestanden.
   2. Kies een geschikte tracking-venster op basis van de volgende kalibratie stappen. Voor Pol1, maken we gebruik van 0,57 micrometer (5 pixels).
   3. Ren de tracking algoritme voor een reeks volgvenster parameters. Bereken het aantal sporen per cel gemeten als functie van de volgvenster de kleinst mogelijke meeloopvenster die niet gesplitst titels (figuur 6B) identificeren.
   4. Teken de uiteindelijke nummers op het doorgelaten licht imago microscopie van dezelfde FOV naar de ruimtelijke verdeling van de molecule beweging te visualiseren binnen cellen. Pol1 tracks moeten diffusie beperkt binnen enkele cellen (figuren 6C-D) weer te geven.
   5. Indien een gedeelte van sporen blijkt steken tussen cellen suggereert dit dat afzonderlijke moleculen onrechte werden gekoppeld omdat de tracking-venster te groot en / of de fotoactivatie te hoog (figuur 6E) werd gekozen.
   6. Teken de cumulatieve verdeling van de stap lengte tussen opeenvolgende lokalisaties (figuur 6F). De curve stijgt en verzadigt soepel voor voldoende grote bijhouden ramenmaar toont een cutoff rand als het venster werd gekozen te klein.
4. De diffusie-eigenschappen van Pol1 analyseren bereken de gemiddelde-kwadraat verplaatsing (MSD) tussen opeenvolgende lokalisaties per spoor met een totaal van N stappen):
   MSD = 1 / (N-1) Σ _{i = 1} ^N-1 _{(Xi 1} - x _i) ² + (y _{i 1} - _yi) ^2.
   Neem alleen nummers met minstens 4 stappen (N ≥ 5 lokalisaties) de statistische onzekerheid in de MSD waarden verlagen.
5. Maak een bocht van MSD waarden over een reeks van Lag keer door het berekenen van de verplaatsingen over meerdere frames (figuur 6G). De vorm van de MSD curve kan helpen om de waargenomen moleculaire beweging (figuur 6H) classificeren.
6. Bereken de schijnbare diffusiecoëfficiënt D * per track van de MSD:
   D * = MSD / (4 At) - σ _loc ² / At.
   De tweede term corrigeert voor de geschatte lokalisatiefout (hier, σ _loc = 40 nm en At = 15,26 msec, zie Wieser et al.. ^15).
7. Maak een histogram van de gemeten D *-waarden van alle tracks in de FOV (figuur 7A).
8. Identificeer de individuele Pol1 moleculen die gebonden is aan het chromosoom op basis van de gemeten D * waarde per track verschijnen. Scheid de populaties van gebonden (scherpe distributie gecentreerd op D * ~ 0 micrometer ² / sec) en vrij diffunderen moleculen (brede distributie gecentreerd op D * ~ 0,9 micrometer ² / sec), door een drempel D * <0,15 micrometer ² / sec ( rode balken in de figuren 7A en 7D).
9. Voer de lokalisatie, tracking, en diffusie-analyse voor Pol1 in onbeschadigde cellen (Afbeelding 7A-C) en in cellen onder DNA-schade behandeling met MMS (figuren 7D-E). De fractie van gebonden titels een directe kwantitatieve maat van de DNEen reparatie activiteit van Pol1 in vivo.

Results

Het begrip fotogeactiveerde single-molecule volgen eiwit-DNA interacties in vivo te bestuderen wordt geïllustreerd in figuur 1. PAmCherry fusie-eiwitten worden gedetecteerd in levende E. coli cellen in een sequentiële wijze door fotoactiverend enkele moleculen stochastisch met 405 nm licht met een frequentie van minder dan een molecule per cel tegelijk. Geactiveerde moleculen worden afgebeeld onder continue 561 nm excitatie. Moleculaire beweging in de cel kan worden gevolgd door verbinding buurt lokalisatie in een serie frames tot onomkeerbare fotobleken. Omdat de verspreiding van DNA-bindende eiwitten wordt vertraagd na binding het chromosoom, de schijnbare diffusiecoëfficiënt D * verkregen per track rechtstreeks rapporteert aan de individuele eiwit-DNA-interacties.

Figuur 2 toont fotoactivering van Pol1-PAmCherry fusie-eiwitten in levende E. coli-cellen. De invloed van de 405 nm intensiteit on de dichtheid van fluorescerende moleculen kan worden gezien in figuur 4. Merk op dat de dichtheid wordt niet alleen bepaald door de intensiteit 405 nm, maar bovendien door het aantal moleculen die voor activering, de pool van de resterende moleculen leeg in de loop van een PALM film.

Lokalisatie analyse wordt uitgevoerd voor elk frame van een PALM film zoals geïllustreerd in figuur 5. We meten de lokalisatie precisie gebruik onbeweeglijk moleculen in vaste cellen of gebonden moleculen in levende cellen. Onze acquisitie instellingen gaf een lokalisatie precisie van σ _loc = 40 nm, in overeenstemming met de theoretische voorspelling ^3.

De resulterende Pol1 lokalisaties bezetten het centrale gebied van de cel (figuur 6A), grotendeels recapituleren de ruimtelijke ordening van de E. coli nucleoid ^7. De meerderheid van de Pol1 tracks in onbeschadigde cellen weer te verfusie als getoond in figuur 6C. Een typische cel bevat enkele honderden Pol1 tracks (figuur 6D), in overeenstemming met het aantal kopieën van ongeveer 400 Pol1 moleculen per E. . coli cel ¹ figuren 6B en 6E-F verschaffen leidraden voor het kiezen van een geschikte bijhouden venster parameter - als het volgvenster te groot is, verschillende moleculen vaker ten onrechte gekoppeld aan een nummer te worden, als het volgvenster is te klein, titels met langere stappen zullen worden gesplitst. De MSD curve voor Pol1 stijgt lineair voor korte aanlooptijd en verzadigt bij langere vertraging soms te wijten aan cel opsluiting (figuur 6G). Verschillende types moleculaire beweging kan worden geïdentificeerd door MSD analyse. Gerichte beweging geeft een parabolische curve; Brownse beweging wordt gekenmerkt door een rechte lijn, de beperkte diffusie curve een plateau bereikt, een offset van de MSD curve voor immobiele deeltjes vertegenwoordigt de localization onzekerheid (figuur 6H). Aanvullende informatie over de single-deeltje tracking en het oplossen van problemen tips zijn te vinden in Arnauld et al.. ¹⁶

We eerder toegepaste methode om het DNA-herstel activiteiten van Pol1 in reactie op exogene DNA alkylering schade ⁷ meten. De D * histogram van Pol1 tracks in onbeschadigde cellen geeft een dominante bevolking diffunderen moleculen (Afbeelding 7A-C). Een klein deel van 2,7% gebonden Pol1 moleculen is waarschijnlijk betrokken bij achterblijvende streng replicatie en reparatie van endogene DNA-schade. Onder continue 100 mM MMS schade, de bevolking van tracks met D * ~ 0 micrometer ² / sec toe tot 13,8% (figuur 7D). Deze tracks vormen de afzonderlijke Pol1 moleculen uitvoeren reparatie van DNA-synthese tot single-nucleotide leemtes op te vullen als onderdeel van de base-excisie reparatie pathway. De posities van gebonden nummers geven de posities van individueleDNA-schade en herstel sites (Figuur 7E-F).

Figuur 1. Grafische weergave van de werkwijze. (A) De fluorescerende eiwit PAmCherry worden gefotoactiveerd van aanvankelijk niet-fluorescerende toestand bij bestraling met 405 nm licht. De heldere toestand is enthousiast op 561 nm en emitteert fluorescentie ongeveer 600 nm tot de fluorofoor bleekmiddelen onomkeerbaar. (B) Het regelen van de fotoactivatie percentage maakt beeldvorming slechts een stochastisch geactiveerd PAmCherry fusie-eiwit per cel op elk moment tijdens het willekeurig grote pool van moleculen die nog niet zijn geactiveerd of reeds zijn gebleekt overblijfselen in een donkere toestand. (C) De positie van de fluorescent molecuul wordt bepaald uit het midden van de geïsoleerde PSF en tracked voor meerdere frames tot fotobleken. (D) Sporen van vele moleculen worden in een sequentiële wijze. (EF) De interactie van een DNA-bindend eiwit met een chromosomale doelwit sequentie of structuur stopt de willekeurige diffusie beweging. Gebonden en ongebonden moleculen onderscheiden zich door de schijnbare diffusiecoëfficiënt D * gewonnen uit single tracks. De resulterende fractie van gebonden moleculen geeft een kwantitatieve maat voor de activiteit van een DNA-bindende eiwitten in vivo. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2. Fotoactivatie van Pol1-PAmCherry in levende E. coli-cellen. Schaal bars: 1 micrometer. Schema's worden getoond onder elk paneel. ( A) lichtbeeld microscopie van cellen geïmmobiliseerd op een agarose pad verzonden. (B) Phototactivating een PAmCherry fluorofoor in een cel. (C) Een hogere fotoactivatie tarief verhoogt het aantal fluorescerende moleculen. (D) Geïntegreerde PAmCherry fluorescentie van een PALM film. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3. Schematische voorstelling van een minimale PALM setup voor fotoactiverende en imaging PAmCherry fusie-eiwitten D1:. Dichroic spiegel (bijv. 550 nm long pass). D2: Dichroic spiegel (bijv. 570 nm long pass). L1: Collimatorlens. L2: TIR lens. L3: Tube lens.1177/51177fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4. Representatieve beelden van een PALM film met 15.26 msec / kader Schaal bars:. 1 micrometer. (A) doorgelaten licht beeld van cellen geïmmobiliseerd op een agarose pad. (B) Donker beeld achtergrond gemeten op de EMCCD camera met de lasers uitgeschakeld. (C) excitatie achtergrondafbeelding onder continue 561 nm excitatie voordat fotoactivatie. (DF) Verhoogde 405 nm intensiteit leidt tot een hogere fotoactivering tarieven van PAmCherry, afgebeeld onder continue 561 nm excitatie. De boxed gebieden worden getoond hieronder uitvergroot. (D) Low 405 nm intensiteit (<1 μW) actieven zeer weinig fluorescerende moleculen per FOV. (E) Medium 405nm intensiteit (~ 2 μW) fotoactivatie resulteert in een goede PSF dichtheid voor het lokaliseren en volgen van analyse. (F) Hogere 405 nm intensiteit (~ 10 μW) activeert meer dan een fluorescerend molecuul in sommige cellen, die lokalisatie en tracking analyse verduistert. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 5. Illustratie van de lokalisatie analyse. Schaal bars: 1 micrometer (A) Band-pass-filter verwijdert valse pixelruis en vlakker intensiteit gradiënten over de FOV.. (B) Kandidaat PSF's worden geïdentificeerd in de gefilterde afbeelding op basis van een door de gebruiker gedefinieerde drempel die wordt gekozen om vals-positieve en vals-negatieve detecties minimaliseren. De threshold overeen met het minimum van een kandidaat pixel gedeeld door de achtergrond standaarddeviatie (signaal-ruisverhouding, SNR). (C) De lokaal helderste pixel die je langs de drempel dient als eerste lokalisatie guess (oranje kruis) voor een twee-dimensionale elliptische Gauss fit. Schaal bars: 0,5 urn. De resulterende super-resolutie lokalisatie (blauw kruis) heeft een gemiddelde nauwkeurigheid van σ _loc = 40 nm. Klik hier voor grotere afbeelding.

.. Figuur 6 Illustratie van de tracking analyse Schaal bars: 1 micrometer. (A) Alle gedetecteerde lokalisaties van Pol1-PAmCherry in een voorbeeld cel. (B) Aantal sporen te detecterened in het voorbeeld cel als functie van de tracking venster. Kleine volgen windows so molecuul trajecten, wat leidt tot hoge aantal tracks artefact. De stippellijn geeft onze keuze voor de parameter meeloopvenster (0,57 urn, 5 pixels) - dit geeft een goed compromis tussen het detecteren van de volledige verdeling van stappen en houden de banen van verschillende moleculen intact. (C) Voorbeeld spoor van een enkele Pol1-PAmCherry molecuul. (D) Alle gemeten tracks weergegeven in willekeurige kleuren. (E) Tracking artefacten als het volgvenster gekozen te groot is (hier 0,8 urn, 7 pixels) of de dichtheid van PSF per frame te hoog. (F) Cumulatieve verdelingen van de stap lengtes voor het bijhouden van ramen: 0,34 micrometer (3 pixels, rode lijn), 0,57 micrometer (5 pixels, blauwe lijn), en 0.80 pm (7 pixels, groene lijn). Merk op dat de 0,34 micrometer volgvenster afsnijdt stappen langer dan 0,34 micrometer die duidelijkkapt de volledige distributie van de stappen. De 0,57 micrometer volgen raam detecteert bijna dezelfde verdeling van de stappen zoals de 0,80 micrometer volgvenster. (G) MSD curve toont beperkte verspreiding van Pol1. (H) Schematische MSD curves voor gerichte beweging, Brownse beweging, beperkte verspreiding, en onbeweeglijk deeltjes. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 7. Directe meting van de DNA-reparatie-activiteit van Pol1 in levende E. . coli-cellen Schaal bars: 1 micrometer. (A) Histogram van de schijnbare diffusiecoëfficiënt D * voor alle tracks van 4 of meer stappen in een FOV van onbeschadigde cellen (N = 4162 tracks). De populatie van moleculen die als b ond is rood gemarkeerd. (BC) Tracks van Pol1-PAmCherry worden getoond een uitgezonden beeld lichtmicroscopie op. Tracks geclassificeerd als gebonden volgens hun diffusiecoëfficiënt worden in rood weergegeven. (D) D * histogram Pol1 tracks gemeten in cellen geïmmobiliseerd op een agarose pad met 100 mM MMS en gedurende 20 minuten voor afbeelden (N = 2.128 sporen). De bevolking van gebonden moleculen die zich bezighouden met de reparatie van DNA wordt in rood weergegeven. (EF) Pol1-PAmCherry tracks op doorgezonden beeld lichtmicroscopie toont de sporen van enkele Pol1 DNA-herstel gebeurtenissen in het rood. Klik hier voor grotere afbeelding.

Film 1. Het bouwen van een op maat gemaakte PALM setup.JoVE_Uphoff_Movie1.avi "target =" _blank "> Klik hier om de video te bekijken.

Discussion

We bespreken een aantal belangrijke overwegingen voor het succes van het experiment.

Keuze en expressie van de fluorescente fusie-eiwit: Er is een groot palet van fotoactiveerbare en photoswitchable fluorescerende eiwitten ^17. De specifieke keuze hangt af van de microscoop eigenschappen, met name de lasers en filters beschikbaar. De combinatie van 405 nm en 561 nm is ideaal voor zachte licht activeerbare fluorescente proteïnen. We kozen PAmCherry ⁶ omdat het monomere en toonde geen aggregatie in cellen. Bovendien onomkeerbare fotoactivatie kan tellen van het aantal geactiveerde fluoroforen eiwit aantal kopieën per cel te meten. In plaats van het fusie-eiwit expressie van een plasmide, wij prefereren chromosomale insertie van het gen dat codeert voor het fusie-eiwit op het wildtype locus. Dit zorgt voor een volledige vervanging van het eiwit van belang met de fluorescerende version en onderhouden van de wild-type expressie niveau.

Fotoactivatie rate: Het is belangrijk de fotoactivatie zodanig dat gemiddeld minder dan een molecule per cel in de fluorescerende toestand in elk frame van de film aan te passen. Dit hangt af van 405 nm intensiteit en het aantal moleculen nog moet worden geactiveerd. Bij zeer lage dichtheden beeldvorming echter niet alle moleculen worden afgebeeld voor het einde van de film of zeer lange films moeten worden verkregen. Het aantal opgenomen frames per film afhankelijk van het aantal kopieën van fusie-eiwitten per cel en de gemiddelde levensduur van fotobleken PAmCherry bij excitatie omstandigheden. Het aantal kopieën van Pol1 is ~ 400 moleculen / cel ¹ en de gemiddelde waarde van de exponentiële photobleaching levensduurverdeling was ~ 4 frames. Door het verhogen van de 405 nm intensiteit geleidelijk wordt de activering gelijkmatig over het 10.000 frames van de film. Daarom heeft elke cel Occupied van fluorescerende moleculen in totaal ~ 1600 frames, zodat weinig overlap van PSF en tracking complicaties in een film van 10.000 frames.

Belichtingstijd en excitatie intensiteiten: Foremost, belichtingstijden moet kort genoeg zijn om scherpe PSF's waarnemen met weinig beweging vervagen. Echter, de framesnelheid worden verkozen om waarneembare moleculaire beweging tussen opeenvolgende frames buiten de lokalisatie onzekerheid opleveren, anders cruciale fotonen worden verspild door oversampling het spoor. De beweging van ongebonden moleculen moeten bemonsterd voldoende lange tijdsintervallen duidelijk van de schijnbare beweging van gebonden moleculen door de lokalisatie onzekerheid zijn. Als de belichting is ingesteld, moet de PSF intensiteit worden aangepast. De lokalisatie precisie van een PSF neemt toe met het aantal gedetecteerde fotonen over de duur van een frame. Hogere excitatie intensiteit verhogen het foton emissie but ook de photobleaching tarief en de achtergrond signaal. Gebruik de laagste excitatie intensiteit die de gewenste lokalisatie precisie geeft. Voor Pol1-PAmCherry kozen we 15.26 msec / frame en 3,5 mW 561 nm excitatie (400 W / cm ^2). Het is belangrijk om cellevensvatbaarheid voor de specifieke beeldomstandigheden bevestigen controle celgroei en morfologie voor en na de data-acquisitie (zie aanvullende informatie in Uphoff et al.. ^7).

Pol1 vertoont een bindende tijd van ~ 2 sec tot een gapped DNA substraat in vivo ^7, daarom verwachten we dat de meerderheid van de moleculen te worden, hetzij in de gebonden of ongebonden toestand voor de gehele duur van een track. Gebonden moleculen lijken hoofdzaak onbeweeglijk vanwege chromosoom sites hebben een diffusiecoëfficiënt verschillende orden van grootte lager (-10 ^-5 micrometer ² / sec, Elmore et al.. ¹⁸⁾ dan Pol1 diffusie in het cytoplasma (~ 1 micrometer ² / sec).

Diffusion analyse: De schijnbare diffusiecoëfficiënt D * wordt berekend uit de MSD van individuele tracks, gemiddeld over een minimum van 4 stappen (5 frames) om de statistische fouten te verminderen. Merk op dat ~ 75% van moleculen bleken in minder dan 5 frames voor de beeldvorming voorwaarden beschreven. Dergelijke korte tracks niet voldoende statistische zekerheid aan gebonden en ongebonden moleculen onderscheiden. De relatieve fractie van gebonden en ongebonden moleculen die rapporteren over de eiwitactiviteit zijn onafhankelijk van het totaal aantal tracks geanalyseerd.

Het is nuttig om rekening te houden PSF lokalisatiefout (σ _loc) bij de berekening van D * omdat de onzekerheid voegt een schijnbare willekeurige stap elk lokalisatie van een molecuul ^15.

De indeling van de gebonden en de verspreiding van moleculen te verbeteren, raden wij berekenen D * both van de single-step verplaatsingen en de verplaatsingen in de tijd van twee frames. Het is dan mogelijk om twee D * drempels: D * (15 msec) <0,15 micrometer ² / sec en D * (30 msec) <0.075 um ² / sec.

Merk op dat D * is een schijnbare diffusiecoëfficiënt die wordt beïnvloed door de cel opsluiting van de tracks en beweging vervagen door diffusie tijdens de belichtingstijd. Om nauwkeurige onpartijdige diffusiecoëfficiënten halen, is het nuttig om de waargenomen beweging vergelijken met gesimuleerde data op basis van een stochastisch Brownse beweging model ^5,7 bewezen. Gesimuleerde gegevens kunnen ook worden gebruikt voor procedures gegevensanalyse testen.

Potentiële toepassingen van deze methode: We beschreven een algemene aanpak voor het visualiseren en kwantificeren van eiwit-DNA-interacties in vivo door de verandering in de mobiliteit van een eiwit bij binding aan het chromosoom. De activiteiten van DNA-ofRNA-bindende eiwitten betrokken bij herstel, replicatie, transcriptie en chromosoom onderhoud kan dus worden gevolgd in real time in het eencellige niveau met een ruimtelijke resolutie onder het optische diffractie limiet. Fotogeactiveerde single-molecule bijhouden breidt conventionele opsporingsmethoden die zijn beperkt tot een paar gelabelde moleculen per cel. Een alternatieve methode die moleculaire diffusie in vivo meet is Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Terwijl FRAP is zeer nuttig voor het meten van globale diffusie eigenschappen in grote cellen wordt beperkt in zijn vermogen om verschillende moleculaire soorten met verschillende mobiliteiten lossen in een ruimtelijk heterogene omgeving, vooral voor kleine bacteriecellen.

We hebben fotogeactiveerde individuele molecuul toegepast volgen op DNA-bindende activiteiten en subcellulaire lokalisatie van een aantal verschillende eiwitten in E. meten coli waaronder Pol1, DNA-ligase, Fis eiwitten, DNApolymerase III ^7, evenals structurele onderhoud van Chromosomen eiwitten MukB, E en F ^19. Wij voorzien de werkwijze kan ook worden aangepast aan andere celtypen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein			created by Lambda-Red recombination
MEM amino acids	Invitrogen	11130-051	minimal medium supplement
MEM vitamins	Invitrogen	11120-052	minimal medium supplement
Agarose	BioRad	161-3100	certified molecular biology grade
Microscope coverslips No 1.5 thickness	Menzel	BB024060SC	remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1 hr
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma-Aldrich	129925	CAUTION: toxic
PALM setup	home-built		described in Uphoff et al.7
MATLAB	MathWorks		for data analysis and visualization
Localization software	custom-written, available online	http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html	MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al.13 if used in publication.
Tracking software	available online	http://physics.georgetown.edu/matlab/	MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier12 if used in publication.