Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51195

⸱

21 augustus 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Department of Bioengineering and Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Nazarbayev University Research and Innovation System, Nazarbayev University, 4Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 5Department of Cell Biology, Erasmus MC Stem Cell Institute, 6OHSU Center for Regenerative Medicine, Oregon Health & Science University, 7Centre for Cardiovascular Science and MRC Centre for Regenerative Medicine, Queen's Medical Research Institute and University of Edinburgh, 8David Geffen School of Medicine and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 9Stem Cell Research Center, Department of Orthopedic Surgery and McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In dit artikel

Samenvatting

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Samenvatting

Sinds de ontdekking van mesenchymale stam / stromale cellen (MSC's) zijn de inheemse identiteit en lokalisatie van MSCs overschaduwd door hun retrospectieve isolatie in kweek. Onlangs, met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), wij en andere onderzoekers prospectief geïdentificeerd en gezuiverd drie subpopulaties van multipotente precursorcellen geassocieerd met het vaatstelsel van de menselijke skeletspier. Deze drie celpopulaties: myogene endotheelcellen (MEC), pericyten (PC) en adventitia-cellen (ACS), respectievelijk gelokaliseerd op de drie structurele lagen van bloedvaten: intima, media en adventitia. Al deze menselijk bloed-schip-afgeleide stamcellen (hBVSC) populaties niet alleen uiten klassieke MSC markers, maar ook beschikken over mesodermaal ontwikkelings mogelijkheden vergelijkbaar met typische MSC's. Eerder hebben MEC's, pc's, en ACS zijn geïsoleerd door middel van verschillende protocollen en vervolgens gekarakteriseerd in afzonderlijke studies. De huidige isolatie protocol, door wijzigingen van het isolatieproces en aanpassingen in het selectieve celoppervlak markers, kunnen we gelijktijdig zuiveren drie hBVSC subpopulaties door FACS uit een enkel menselijk spierbiopsie. Deze nieuwe methode zal niet alleen de isolatie van meerdere BVSC subpopulaties te stroomlijnen, maar ook toekomstige klinische toepassingen van hBVSCs voor verschillende therapeutische doeleinden te vergemakkelijken.

Inleiding

Menselijke skeletspieren wordt beschouwd als een klinisch aantrekkelijke bron van stam / progenitorcellen. Skeletspieren bevat niet alleen gepleegd myogene voorouders, skeletmyoblasten, maar ook primitieve myogene stamcellen, met inbegrip van satelliet-cellen en-spier-afgeleide stamcellen (MDSCs) 1. Het gebruik van menselijke spier afgeleide stam / progenitorcellen, autologe of allogene, in regeneratieve geneesmiddel is uitgebreid onderzocht in preklinische diermodellen en klinische proeven. De regeneratieve toepassingen spier stam / progenitorcellen variëren van regenereren dystrofische spier in Duchenne spierdystrofie (DMD) patiënten herstel van de gewonde hart bij patiënten met een hartaanval.

Sinds de ontdekking van mesenchymale stam / stromale cellen (MSC's) en andere multipotente precursor celpopulaties, waaronder beenmerg afgeleide multipotente adulte progenitorcellen (MAPCs) en adipose afgeleide stamcellen (ADSCs), volwassen stamcellen /voorlopercellen cellen zijn uitgebreid onderzocht date 1-9. Niettemin hebben hun eigen identiteit en vestiging in situ overschaduwd door de retrospectieve isolatiewerkwijzen. Onlangs, met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), wij en andere groepen prospectief geïdentificeerd en gezuiverd drie multipotent precursor celpopulaties van bloedvaten in menselijke skeletspier en diverse andere organen: myogene endotheelcellen (MEC), pericyten (PC), en adventitia cellen (AC's) 10. Deze drie subpopulaties van humane bloedvatgeassocieerde afgeleide stamcellen (hBVSCs) respectievelijk worden in de drie structurele lagen van bloedvaten: tunica intima, tunica media en de tunica adventitia. Meer specifiek, MEC's ​​en pc's zijn gedetecteerd in bloedvaten en haarvaten en ACS zijn gelokaliseerd in de adventitia laag van grotere slagaders en aders. Elke precursor cel subsets drukt een unieke combinatie van celoppervlak antigenen: MEC (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), en de ACS (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).

Verdere karakterisatie van deze hBVSC subsets bleek dat alle drie precursor celpopulaties bezitten mesodermale ontwikkelingsstoornissen potentialen Soortgelijke typische MSCs, zoals skelet myogenesis, osteogenese, chondrogenese en adipogenese. Alle hBVSC subsets vertonen ook klassieke MSC markers, zoals CD44, CD73, CD90 en CD105, vers en in de cultuur. Gezamenlijk deze bewijsstukken ondersteunde de vasculaire oorsprong van MSC's. Bovendien is de therapeutische mogelijkheden van MEC's, PC's en ACs onlangs aangetoond in afzonderlijke studies. MEC's ​​gesorteerd van de volwassen menselijke spier biopsieën werden getoond van de benadeelden en dystrofische skeletspieren en reparatie gewond hartspier efficiënter dan skeletmyoblasten en vasculaire endo regenererenthelial cellen (EC's). Gezuiverde PCs van verschillende menselijke organen bleken ook te repareren / regenereren gewonde en dystrofische skeletspieren en tot de satelliet celpool 13-16. Zeer recent hebben we aangetoond dat de pc's zijn afgeleid van de menselijke skeletspier effectief repareren het infarct hartspier via indirecte paracrien effect en directe cellulaire interacties 17. ACs, anderzijds, zijn hetzij rechtstreeks geïsoleerd uit geëxplanteerde bloedvaten of gezuiverd door FACS uit menselijk vetweefsel en skeletspier. Een opvallende pro-angiogene werking van ACS werd aangetoond in een muis achterpoot ischemie model 19. Bovendien zijn ACs ook aangetoond infarct myocardium bij conventionele MSCs herstellen en geeft de robuuste therapeutisch potentieel van ACS in ischemisch weefselherstel 20.

De huidige zuivering protocol subsidies gelijktijdige, prospectieve zuivering van MEC's, pc's, enACs van de vasculatuur van een menselijke skeletspier biopsie. Dit stelt ons in staat om te studeren en / of kies de optimale hBVSC subpopulatie voor verschillende therapeutische doeleinden. Bovendien, deze nieuwe techniek breidt het repertoire van stam / progenitorcellen die kunnen worden afgeleid uit humane skeletspier, waardoor het een ideale bron van multipotente precursorcellen regeneratieve geneeskunde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1 spierbiopsie Processing

  1. Behoud menselijke skeletspier biopsie op ijs in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (P / S) tijdens het transport.
  2. Na ontvangst van de spierbiopsie, verwijdert het preparaat uit de transportcontainer en was tweemaal in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% antibiotica-antifungale oplossing (A / A) onder steriele omstandigheden.
  3. Verwijder de aangehechte vet en bindweefsel met steriele scharen en pincetten in DMEM aangevuld met 2% A / A.
  4. Grote bloedvaten te verwijderen onder de dissectie microscoop en vervolgens snijd de spier specimen in kleine stukjes (<1 cm 2 in grootte).
  5. Behoud gesneden spier pieces (<5 g) in 20 ml conservering medium (PM, DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% P / S) en 4 ℃ tot 5 dagen.

2 Muscle Dissociation and Cell Isolation

  1. Op de dag van celisolatie verwijderen spier stukken uit uur en tweemaal wassen in PBS gesupplementeerd met 2% P / S. De verteringsoplossing, voegt type I, type II en type IV collagenasen (100 mg / ml) vers in PM.
  2. Hak en mechanisch gehakt spier stukken met een steriele schaar en pincet in een petrischaal met een kleine hoeveelheid van PM tot de oplossing passeert 10 ml serologische pipet zonder klonteren. Verwijder het resterende vet en bindweefsel tijdens dit proces. Gebruik minimaal 8-10 gram volwassen spieren of 2 gram foetale spier voor elke cel isolatie.
  3. Overdracht 4-5 gram gehakt volwassen spier 20 ml (of 2 gram gehakt foetale spier in 10 ml) Ofthe digestie oplossing met een 10 ml serologische pipet. Digest voor 50 - 60 minuten bij 37 ℃ op een orbitale schudder bij 70 - 80 rpm. Optimaliseer cel opbrengst oppervlakteantigeen bewaring door aanpassing van de digestie tijd en / of bewegingssnelheid derhalve gebaseerd op de hoeveelheidweefsel. Let op de spijsvertering Status elke 15-20 minuten, totdat de troebelheid verdwijnt bijna.
  4. Krachtig pipet het gedigereerde weefsel 3-5 keer met 10 ml serologische pipet. Voeg evenveel PM om de reactie te stoppen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 4 minuten.
  5. Verwijder het supernatant voorzichtig; resuspendeer de pellet met 10 ml PM te wassen en vervolgens gefiltreerd door een 100 urn zeef cel.
  6. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 4 minuten en verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer pellets in erytrocyten lysis buffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mm EDTA), filtreer door een 70 um cel zeef om een enkele celsuspensie te verkrijgen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Filtreer door een 70-m cel zeef weer of geen neerslag waargenomen.
  7. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 4 min en resuspendeer de cel pellet in 0,5 ml PBS. Tel het aantal cellen. Zorg voor een totaal van minstens 5 miljoen cellen voor cel sorteren. Verdun de enke celsuspensie tot minder dan 5 miljoen cellen per ml met PBS voor kleuring. Neem 50-100 ul van de celsuspensie en verdeeld in 11 buizen voor controle kleuringen (onbesmet controle, negatieve controles, en single-color positieve controles).

3 Cell Labeling en sorteren

  1. Incubeer de enkele celsuspensie gedurende 10 minuten bij 4 ℃ in muizenserum (verdund 1:10 in PBS) voor het blokkeren daartoe indien nodig.
  2. Add CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, en CD146-FITC (alle 1: 100) in de enkele celsuspensie en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ℃. Voor negatieve controle, voeg equivalente concentraties van APC APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE-en FITC-geconjugeerde IgG isotype antilichamen en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ℃. Voor single-color positieve controles, voeg equivalente concentraties van CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, PE-CD144 en CD146-FITC afzonderlijk in elke buis en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ℃.
  3. Na incubatieCentrifugeer bij 400 xg gedurende 4 minuten te wassen. Resuspendeer de celpellet in 1 - 2 ml DMEM aangevuld met 5% FBS en 1% P / S. De eindconcentratie van de celsuspensie dient minder dan 5 miljoen cellen per ml. Voeg 7-AAD (1: 100) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur dode cel uitsluiting. Voor negatieve controle en single-color positieve controles, resuspendeer celpellets in 0,5 ml DMEM aangevuld met 5% FBS en 1% P / S.
  4. Breng alle celsuspensies tot ronde bodem polystyreen flowcytometrie buizen. Bereid cel verzamelbuizen (elke buis is vooraf gevuld met 500 ul van de juiste kweekmedium: MPM voor MEC; EGM-2 PCs, AC medium voor ACs). Transport celsuspensies op ijs de cel sorter.
  5. Run celsuspensies op de cel sorter in de volgorde van de ongekleurde controle, negatieve controles, eenkleurige positieve controles, en de belangrijkste celsuspensie tijdens het instellen van de laser intensiteit, kanaal compensatie, en celpopulatie gating streng naar cel p maximaliserenurity (zie artikelen gepubliceerd door Jupiter en andere tijdschriften voor de details van flowcytometrie).
  6. Verzamel gewenste celpopulaties in de juiste verzameling buizen. Bewaar het verzamelde cellen op 4 ℃ als ze niet onmiddellijk zaaien.

4 Post-sortering Cell Culture

  1. Zaad vers naargelang MEC (P0) op <10.000 cellen / cm 2 in MPM op platen pre-coated met type-I collageen. Voor de daaropvolgende passage van MEC's, zaad 3.500 - 4.000 cellen / cm 2 in MPM op platen / flessen pre-coated met type-I collageen.
  2. Zaad vers naargelang PCs (P0) op <20.000 cellen / cm 2 in EGM-2 op platen vers gecoat met 0,2% gelatine. Voor de daaropvolgende passage van pc's, splitsen cellen op 1: 3 verhouding in PC (DMEM aangevuld met 20% FBS en 1% P / S) op regelmatige polystyreen cultuur platen tot P2. Vanaf P3 verder, zaad cellen bij 6.500 - 7.000 cellen / cm 2 in de PC-medium op regelmatige polystyreen cultuur platen / kolven.
  3. Zaad vers naargelang ACS (P0) op <20.000 cellen / cm 2 in AC (DMEM aangevuld met 20% FBS en 1% P / S) op regelmatige polystyreen cultuur platen. Voor de daaropvolgende passage van ACS, zaad cellen bij 6.500 - 7.000 cellen / cm 2 in AC medium op regelmatige polystyreen cultuur platen / kolven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

FACS parameters worden eerst gecorrigeerd op basis van de resultaten van de ongekleurde controle, negatieve controles, en single-color positieve controles data. Na uitsluiting van dode cellen, wordt fluorescentie gelabelde celsuspensie onderworpen aan een reeks van negatieve en positieve marker celoppervlak selecties. Eerst worden CD45 + cellen gated vóór CD56 + en CD56 - cellen worden gescheiden van de CD45 - fractie. De CD56 + fractie wordt verder onderworpen aan ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Identificatie en zuivering van hBVSC subpopulaties vertegenwoordigen een belangrijke stap vooruit in het begrijpen van MSC ontogenie. Er is steeds meer bewijs met vermelding van het perivasculaire herkomst van MSC en de associatie tussen weefsel-specifieke voorloper cellen en bloedvaten 22-25. Bovendien, het vermogen om homogene subpopulaties hBVSCs verder helpt het begrip van MSC heterogeniteit en vasculaire celbiologie 26 isoleren.

In de afgelopen jaren hebben MEC'...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

J.H. ontving beloning van Cook MyoSite, Inc. voor adviesdiensten en voor royalty's ontvangen uit technologielicenties gedurende de periode dat het bovenstaande onderzoek werd uitgevoerd. Alle andere auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Alison Logar bedanken voor haar uitstekende technische bijstand met flowcytometrie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Defensie (JH), de Henry J. Mankin leerstoel (JH), en het ministerie van Onderwijs en Wetenschappen van de Republiek Kazachstan (AS). CWC werd mede ondersteund door de American Heart Association predoctorale fellowship (11PRE7490001). M.Corselli werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine training subsidie ​​(TG2-01169).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase type 1SigmaC5894Steriele flacon
Collagenase type 2SigmaC1764Steriele flacon
Collagenase type 4SigmaC1889Steriele flacon
Anti-human CD34 APCBD Pharmingen555824Steriel houden
Anti-human CD45 APC-Cy7BD Pharmingen557833Steriel houden
Anti-human CD56 PE-Cy7BD Pharmingen 557747Steriel houden
Anti-human CD144 PEBeckman CoulterA07481Steriel houden
Anti-human CD146 FITCAbD SerotecMCA2141FSteriel houden
FACS Aria II Flow CytometerBecton-Dickinson
EGM-2 complete mediumLonzaCC-3162Voor het kweken van PCs (alleen P0)
DMEM hoge glucose (1X), vloeibaar, met L-glutamine, zonder natriumpyruvaatInvitrogen11965Voor het kweken van PCs
DMEM hoge glucose (1X), vloeibaar, met L-glutamine, met natriumpyruvaatInvitrogen11995Voor het kweken van MECs en ACs
Foetaal runderserumInvitrogen10437-028
Hitte-geïnactiveerd paardenserumInvitrogen26050-088
Penicilline/streptomycineInvitrogen15140-122
Antibioticum-antimyoticum (100X)Invitrogen15240-062
Trypsine-EDTA 0,5% (10X)Invitrogen15400-054
Dulbecco’s PBS zonder calcium en magnesiumInvitrogen14190-250
Kijembryo extractAccurate ChemicalCE650T-10Filter voor gebruik

Referenties

  1. Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
  2. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  3. Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  4. Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
  5. Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
  6. Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
  7. Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
  8. Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
  9. Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
  10. Chen, C. -W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439(2012).
  11. Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
  12. Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
  13. Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
  14. Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
  15. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
  16. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499(2011).
  17. Chen, C. -W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
  18. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
  19. Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
  20. Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
  21. Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
  22. Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
  23. Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
  24. Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
  25. Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
  26. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
  27. Chen, C. -W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
  28. Lin, C. -S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
  29. Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875(2012).
  30. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

uit bloedvaten afgeleide stamcellenfluorescentie geactiveerde cel sorteringcollagenase digestieflowcytometrie analysemyogene endotheelcellenpericytenadventiti le cellenceloppervlaktemarkersskeletspierbiopsieisolatie van multipotente precursorenexpansie van celculturen
Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.