Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Samenvatting

Dit protocol Gegevens een test ontwikkeld om menselijk neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed met robuuste reproduceerbaarheid. Deze benadering omzeilt de noodzaak van neutrofielen scheiding en vereist slechts een paar minuten assay voorbereidingstijd. De microfluïdische chip maakt het mogelijk de herhaalde meting van neutrofielchemotaxis loop van de tijd bij zuigelingen of kleine zoogdieren, waar monster volume beperkt is.

Samenvatting

Neutrofielen spelen een essentiële rol in de bescherming tegen infecties en hun aantallen in het bloed wordt vaak gemeten in de kliniek. Hoger aantal neutrofielen in het bloed zijn meestal een indicator van de lopende infecties, terwijl een lage neutrofielen zijn een waarschuwing voor hogere risico's op infecties. Om hun taken te volbrengen, neutrofielen moeten ook effectief te kunnen verplaatsen van het bloed, waar ze het grootste deel van hun leven door te brengen, in de weefsels, waar infecties optreden. Bijgevolg kunnen defecten in het vermogen van neutrofielen migreren risico verhogen op infecties, zelfs als neutrofielen aanwezig in geschikte aantallen in het bloed. Echter, het meten van de migratie van neutrofielen mogelijkheid in de kliniek is een uitdagende taak, die is tijdrovend, vereist een grote hoeveelheid bloed, en expertkennis. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een robuust microfluïdische assays voor de migratie van neutrofielen, die een enkele druppel bloed onverwerkte vereist, omstandigopeningen de noodzaak van neutrofielen scheiding en is gemakkelijk te kwantificeren op een eenvoudige microscoop. In deze assay, neutrofielen migreren direct uit het bloed druppeltje, door kleine kanalen, naar de bron van chemoattractant. Om de granulaire stromen van rode bloedcellen voorkomen dat via dezelfde kanalen, implementeerden we mechanische filters met rechte hoek blijkt dat het voorschot van rode bloedcellen selectief blokkeren. We gevalideerde de test door de migratie van neutrofielen vergelijken van bloed druppels verzameld uit vingerprik en veneuze bloed. We vergeleken ook deze volbloed (WB) bronnen met de migratie van neutrofielen uit monsters van gezuiverd neutrofielen en vonden constante snelheid en richting tussen de drie bronnen. Dit microfluïdische platform zal de studie van neutrofielen migratie menselijke staat in de kliniek en de instelling onderzoek helpen ons begrip van neutrofielen functies in gezondheid en ziekte.

Inleiding

Neutrofielen handel speelt een cruciale rol bij het ​​bepalen van de voortgang en oplossen van vele inflammatoire aandoeningen, zoals atherosclerose ^1, bacteriële infectie of sepsis ² en brandwonden ^3. Voor hun belangrijke bijdrage aan de gezondheid en ziekte voorwaarden, aantal neutrofielen is onderdeel van de standaard bloedanalyse vaak beschouwd in klinische en onderzoekslaboratoria. Ondanks dat een van de meest alomtegenwoordige proeven en de waarde van neutrofielen in de diagnose van infectie en sepsis is herhaaldelijk ondervraagd ^4. Bijvoorbeeld, een studie van neutrofielen bij patiënten met brandwonden is gebleken dat het aantal neutrofielen en de migratie van neutrofielen functie komen niet overeen; betekent dat neutrofielen alleen is niet een nauwkeurige indicator van immune status ^3. Hoewel moeilijker te meten, heeft neutrofielen functionele bevoegdheid voorgesteld als meer waardevol in een breed scala van omstandigheden.

t "> Belangrijk veel neutrofielen gebreken voorbijgaande en worden niet veroorzaakt door permanente genetische defecten, een onderscheid dat grotendeels over het hoofd gezien in de kliniek tot voor kort. In het kader van brandwonden kunnen neutrofiel migratie tijdens gecontroleerd behandeling van een patiënt als een indicator van ontstekingsstatus of infectie ^3. Traditionele migratie assays momenteel in het laboratorium (Boyden-kamer, Dunn kamer, micropipet assay) kan worden vertaald naar een klinische omgeving omdat ze grote hoeveelheden bloed nodig en omslachtig tijdrovend neutrofielen isolatietechnieken (tabel 1). Deze testen kunnen ook niet worden gebruikt om tijdelijke neutrofiel chemotaxis in kleine proefdieren, zoals muizen volgen, aangezien het volume van bloed nodig voor neutrofielen isolatie maakt slechts een monster en vereist vaak zelfs bundelen bloed van meerdere dieren een enkele assay. Bijvoorbeeld, een studie waarbij multiple voorwaarden en behandelingen over meerdere tijdstippen kan mogelijk duizenden muizen vereisen het gebruik van de huidige chemotaxis assays. Dit beperkt het fundamenteel biologisch onderzoek dat kan worden gedaan om de complexe dynamiek van de immuunfunctie te begrijpen in de context van verwonding, infectie of verbranden vaak bestudeerd in muizenmodellen ^5.

Om de noodzaak van een neutrofiel functionele test die is snel, robuust, terwijl die minimaal volume bloed pakken hebben we een microfluïdische apparaat dat neutrofielchemotaxis meet direct van een kleine druppel bloed ontwikkeld. Het is bekend dat veel factoren in volbloed, zoals serum ⁶ en ⁷ bloedplaatjes invloed neutrofielfunctie. Het is derhalve gunstig dat het volbloed microfluïdische assay minimaliseert monster verwerking de in vivo micro-omgeving van de neutrofielen handhaven wanneer het meten van variaties in chemotaxis met een in vitro assay ^8. Deze aanpakvermindert de tijd van bloedafname tot neutrofielen migratie assays van uren met behulp van traditionele technieken, om slechts enkele minuten (Tabel 1). De volbloed microfluïdische platform produceert een lineaire gradiënt chemoattractant voor de duur van het experiment, heeft geen bewegende delen en geen externe drukbron (dwz spuitpomp) vereisen. Het belangrijkste kenmerk van het ontwerp van het volbloed microfluïdische apparaat is de opname van een rode bloedcel (RBC) filtratie kam die mechanisch filtert RBC betreden de migratie kanaal van de inrichting. De rechter bochten van deze filtratie kam voorkomen dat de noodzaak voor de grootte uitsluiting filtratie, die waarschijnlijk zouden worden verstopt door rode bloedcellen en dus blokkeren de chemoattractant gradiënt van het bereiken van het actief migreren neutrofielen in de WB. De opname van het volbloed microfluïdische inrichting een 12 of 24-well plaat vergemakkelijkt het screenen van meerdere mediatoren van menselijke of murine neutrofielchemotaxis sigelijkertijd.

Protocol

1. Microfluidic Device Fabrication

1. Met behulp van standaard fotolithografische technieken, fabriceren de meester mal wafer in een klas 1000 schone kamer. Patroon de eerste 3-urn dunne epoxy gebaseerde negatieve fotolaklaag de migratie kanalen definiëren volgens de instructies van de fabrikant. Patroon van de tweede 50-urn dikke laag om de cel-laad-en chemokine kamers definiëren.
2. Gebruik de patroon wafer te polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaten uitgebracht. Krachtig mengen PDMS (20 g) met initiator (2 g) gedurende 5 min met behulp van plastic vork in grote plastic weegvlak.
3. Giet PDMS op schimmel.
4. Ontgas de PDMS door het plaatsen mal met PDMS gegoten in een vacuüm exsiccator gedurende 1 uur.
5. Bak en genezen PDMS microfluïdische inrichtingen ten minste 3 uur in een oven ingesteld op 65 ° C.
6. Pons de centrale WBLCs behulp van een perforator met een tip diameter van 1,5 mm.
7. Pons hele donut-vormige apparaten met een punctuelehaar met een tip diameter van 5,0 mm.
8. Stofdeeltjes verwijderen uit donut apparaten met behulp van plakband.
9. Spoel een 12-wells plaat met gedemineraliseerd water en daarna droog met stikstof. Plaats plaat in 60 ° C oven gedurende 5 minuten.
10. Zuurstof plasma behandeling van de 12-well plaat twee keer; een keer alleen voor 35 sec en dan weer met de donut apparaten voor nog eens 35 sec.
11. Plaats apparaten zorgvuldig in de putjes van de plaat met een pincet.
12. Bak plaat met gekoppelde apparaten op een hete plaat is ingesteld op 80 ° C gedurende 10 minuten.

2. Microfluidic Assay Voorbereiding

1. Prime microfluïdische apparaten direct na zuurstofplasma behandeling, wanneer het apparaat is hydrofiel en capillaire effecten priming van de kleine kanalen in de inrichting bevorderen.
2. Maak chemoaantrekkende oplossing door het mengen van 5 pl fMLP [stockoplossing 10 uM] met 5 pi fibronectine [voorraad oplossing 1 mg / ml] en 490 pi HBSS.
3. Langzaam pipet & #160; chemoaantrekkende oplossing in WBLC, met behulp van een gel laad-tip (Figuur 1A). Pipet extra 20 ul van de chemoattractant rond de buitenkant van het apparaat.
4. Plaats plaat in een exsiccator gedurende 15 minuten. Door een vacuüm op de inrichting wordt de oplossing ingedruppeld in de zij-kanalen van de inrichting en de verplaatste lucht verspreid via de PDMS.
5. Verwijder de plaat uit exsiccator en bevestigen bevochtiging van het apparaat kanaal onder de microscoop. Kijk als bubble wordt kleiner naarmate chemoattractant oplossing komt in de kamer. Geen bel moet aanwezig zijn in de inrichting na vacuüm behandeling.
6. Was de WBLC en buitenkant van het apparaat grondig te chemoaantrekkende overtollige oplossing te verwijderen. Deze stap genereert een gradiënt van chemoattractant van elk van de focale chemotactische kamers (FCC) naar binnen apparaat.
   1. Vul een spuit van 1 ml met PBS, voeg een 30 G stompe naald aan de spuit. Voorzichtig, steek de naald van de spuit innaar het midden van de donut hole. Duw 100 ul PBS in het gat, zodat een druppel PBS vormen bovenop het apparaat.
   2. Tilt plaat en pipet 1 ml PBS ongeveer inrichting zodat de vloeistof verzameld op de bodem van de put. Zuig de vloeistof en herhaal proces voor in totaal 3x met verse bufferoplossing (gebruik de media in plaats van buffer indien de gescheiden neutrofielen in de media wordt geladen) ^9.
7. Vul elk putje met media tot de bovenkanten van de apparaten zijn ondergedompeld onder vloeistof. Laat de apparaten zitten gedurende 15 minuten te laten gradiënt te stabiliseren. Experimentele resultaten en theoretische gegevens van eindige elementen simulaties blijkt dat de gradiënten in deze apparaten zijn stabiel tot 24 uur voor kleine moleculen (bijvoorbeeld fMLP) en tot enkele dagen voor groter molecuulgewicht (bijvoorbeeld IL8).
8. Met behulp van gel plaatsen Tips, langzaam pipet 2 pi van bloed (of geïsoleerde neutrofielen) in elke volbloed loading kamer (WBLC) (Figuur 1A).

3. Monstervoorbereiding

Menselijke neutrofielen uit capillair bloed

1. Verzamelen capillair bloed uit de vinger prikken van gezonde vrijwilligers, die op geen immunosuppressiva. Alle patiënten monsters werden verkregen met informed consent, en procedures die door de MGH en Shriners Institutional Review Boards goedgekeurd.
   1. Voor vingerprik bloedafname, de handen wassen met water en zeep en droog de huid. Bereid anti-coagulant/stain voorraad oplossing door het toevoegen van 1 ml HBSS + 0,2% HSA en 10 pl Hoechst vlek (32,4 uM) om bloedafname (1.65 USP/50 ul bloed) heparine. Prik de vinger met behulp van een SurgiLance prikapparaatje (2.2-mm diepte, 22 G), veeg eerste druppel bloed en het verzamelen van 50 ul van bloed in Eppendorf buisje met de voorraad anti-stollingsmiddel en Hoechst fluorescerende vlek oplossing (10 pl) en voorzichtig mengen.
2. Incubeer het bloed en Hoechst kleuring gedurende 10 min om voor kern fluorescente kleuring. Run monster binnen 1 uur van bloedafname.

Menselijke neutrofielen uit veneuze bloed

3. Trek 10 ml perifeer veneuze bloed in buisjes die 33 USP heparine.
4. Voeg 50 ul van veneus bloed media en Hoechst vlek zoals eerder beschreven. Incubeer het bloed en Hoechst kleuring gedurende 10 min om voor kern fluorescente kleuring. Run monster binnen 1 uur van bloedafname.

Neutrofielen Afscheiding uit volbloed - Positive Control

5. Neutrofielen gescheiden, steriel technieken om neutrofielen te isoleren van de 10 ml veneus bloedmonster gebruikt Hetastarch (6% w / v) dichtheidsgradiënt gevolgd door een negatieve selectie magnetisch bolletje isolatiekit volgende protocol van de fabrikant.
6. Geresuspendeerd de uiteindelijke hoeveelheid van neutrofielen op een concentrtie van 4.000 cellen / ul in 1X HBSS + 0,2% humaan serumalbumine. Laat cellen bij 37 ° C tot klaar om het experiment uit te voeren.

4. Microscopie en beeldanalyse voor neutrofielchemotaxis Metingen

1. Stel biochamber temperatuur tot 37 ° C, 80% vochtigheid en CO ₂ bij 5%.
2. Start beeldvorming onmiddellijk met behulp van time-lapse imaging op een microscoop (10X of hogere vergroting).

5. Statistische analyse

1. Handmatig bijhouden minstens 50 neutrofielen in elk monster.
2. Tel de cellen die in de FCC in de tijd (Figuur 2).
3. Bereken neutrofielen snelheden in het kanaal tussen WBLC en FCC met ImageJ (NIH) (Figuur 2).
4. Kwantificeren gerichtheid van neutrofielen door telling van het aantal cellen dat de bifurcatie passeren en het berekenen van de verhouding tussen het aantal cellen dat keren naar de FCC en cellen die uitgang ee apparaat. Cellen die niet directionele zijn niet aan de chemotactische gradiënt en daarom migreren in gelijke aantallen in de richting van de FCC en de afrit kanaal (figuur 2).

Resultaten

De volbloed (WB) neutrofielchemotaxis test werd gevalideerd door de accumulatie van neutrofielen naar een fMLP gradiënt (Movie S1). Resultaten bevestigen dat RBC zijn gevangen door de filtratie kam terwijl neutrofielen (blauw) actief kunnen migreren van volbloed (figuur 3A en Movie S1). De stabiele lineaire chemoattractant gradiënt (groen) wordt gevormd door de volbloed microfluïdische apparaat werd bevestigd met behulp van FITC-gelabelde dextran (figuur 3A

Discussie

In dit werk hebben we een microfluïdische platform om neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed (2 pi). De on-chip mechanische filtratie van RBC van actief neutrofielen migreren omzeilt de noodzaak voor omslachtige cellen scheidingsmethoden zoals dichtheidsgradiënten ^{10, 11} positieve selectie, negatieve selectie of ^12, die gevoelig zijn voor artefacten introduceren door het activeren neutrofielen. De mechanische filtratie van RBC onderscheidt onze technologie van andere microfluïdische chips ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparaatfabricage
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxaan (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standaard glazen slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glazen bodemplaat	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidische Assay Voorbereiding en Analyse
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Spuit	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip naald, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparine	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Humaan serum albumine	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% eindconcentratie in HBSS
Fibronectine	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance veiligheidslancet, 2.2-mm diepte, 22 G		SLN240
Hoechst kleurstof	Life Technologies	H3570
Positieve Controle
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Verrijkingskit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
RVS Precisie Pincet	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemisch Resistente Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE omgekeerd microscoop	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objectief	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 met 2 Meter Licht Gids voor Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Nauw Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 gekoelde CCD Camera 1.600 x 1.200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C