Isolatie van mRNA's geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Samenvatting

Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.

Samenvatting

De meeste van mitochondriale eiwitten worden gecodeerd in de kern en moet in het organel te worden geïmporteerd. Import kunnen optreden tijdens het eiwit wordt gesynthetiseerd in de buurt van de mitochondriën. Steun voor deze mogelijkheid wordt afgeleid uit recente studies, waarin veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten bleken gelokaliseerd naar de mitochondriën omgeving. Samen met eerdere demonstraties van ribosomen worden betrokken bij de buitenste membraan, suggereren deze resultaten een gelokaliseerde vertaalproces. Dergelijke gelokaliseerde vertaling kan efficiëntie invoer te verbeteren, bieden unieke regelgeving sites en gevallen van ectopische expressie te minimaliseren. Diverse methoden zijn gebruikt om de factoren en elementen die gelokaliseerd vertaling bemiddelen karakteriseren. Standaard daarvan is subcellulaire fractionering door differentiële centrifugatie. Dit protocol heeft het voordeel van isolatie van mRNA, ribosomen en eiwitten in een enkele procedure. Deze kunnen dan worden gekarakteriseerd door verschillende moleculaire en biochemical methoden. Bovendien kunnen transcriptomics en proteomics methoden toegepast op de resulterende materiaal, waardoor genoom-brede inzichten mogelijk. Het gebruik van gist als modelorganisme voor dergelijke studies heeft de voordelen van snelheid, kosten en eenvoud. Bovendien is de geavanceerde genetische hulpmiddelen en beschikbare deletiestammen vergemakkelijken verificatie van kandidaat factoren.

Inleiding

Eukaryote cellen zijn georganiseerd in verschillende compartimenten met specifieke functies. Om zijn functie te vervullen, elk compartiment bevat een unieke set van eiwitten die essentieel zijn voor de activiteit. Een mogelijk mechanisme waardoor deze eiwitten benaderen hun compartiment is door gelokaliseerde vertaling ^1,2. In deze werkwijze wordt het eiwit gesynthetiseerd op zijn bestemming door ribosomen en mRNA dat er zich. Onder de waarschijnlijke voordelen van gelokaliseerde vertaling zijn toegenomen efficiëntie van eiwit targeting, verminderde behoefte aan eiwit begeleiders, en het mogelijk maken de site-specifieke regulatie mechanismen. Ook kunnen g....

Protocol

1. Mitochondriën Zuivering

Weeg de pellet van de cellen. Ongeveer 0,6 g worden verkregen van 100 ml cellen.

1. Groei 100-150 ml gistcellen OD ₆₀₀ = 1-1,5 bij 30 ° C op een fermenteerbare groeimedium, zoals galactose gebaseerde groeimedium, teneinde verrijken mitochondriën.
2. Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof.
3. Was de pellet met dubbel gedestilleerd water en centrifuge opnieuw. Verwijder het supernatant.
4. Resuspendeer de pellet in 1 ml DTT buffer per 0,5 g cellen. Het is belangrijk om de cellen te behandelen met een ....

Resultaten

Dit protocol maakt scheiding van een-mitochondriën bevattende fractie van cytosolische componenten. De beste manier om het succes ervan te testen is naar Noord-analyse-en West-analyse (figuur 1) uit te voeren om monsters uit de verschillende isolement stappen. Drie parameters voor de isolatie kwaliteit zijn uit deze analyses. Ten eerste, of het RNA of eiwitten in de monsters intact - deze kunnen gedetecteerd als afzonderlijke banden in de analyses. Degradatie gebeurtenissen zal de verschijning van extra.......

Discussie

Technologische ontwikkelingen in de beeldvorming had hoge resolutie instrumenten opgeleverd om mRNA lokalisatie studeren. Vandaag de dag kan men de beweging van zelfs een enkele mRNA-molecuul te meten op de msec tijdschaal ^23-26. Toch traditionele biochemische benaderingen, als hierboven beschreven, zijn ook informatief en de voorkeur in sommige gevallen. Biochemische isolatie kan zuivering van een groot repertoire van mRNA en eiwitten, en verdient daarom de voorkeur voor genoom-breed onderzoek. In een isolat.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gist Extract
BactoPeptone
Galactose			Doe Galactose niet te autoclaveren
Groeimedium			Voor mitochondriale verrijking moet je een niet-fermenteerbare koolstofbron gebruiken, zoals een op galactose gebaseerd groeimedium gesteriliseerd 1% Gist Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Elke keer vers maken
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4, 16 mM K2HPO4. Filter deze buffer (0.2 μm) en bewaar op kamertemperatuur voor toekomstig gebruik
Zymolyase 20T			20.000 U/g
Hersteelmedium			Op galactose gebaseerd groeimedium aangevuld met 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparine
1 mM Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Voeg vers toe: 0.5 mg/ml Heparine, 0.1 mg/ml CHX en 1mM (PMSF). Filter deze buffer en gebruik hem ijskoud
8 M Guanidinium-HCl
100% en 70% Ethanol (EtOH)
3 M Natriumacetaat, pH 5.2
10 M LiCl stockoplossing
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Broomfenolblauw
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol en 0.02% Broomfenolblauw
Dounce homogenisator van 15 ml capaciteit uitgerust met een goed passende stamper