Methodenartikel

Isolatie van mRNA's geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

11.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51265

⸱

14 maart 2014

 , 
1Department of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.

Samenvatting

De meeste van mitochondriale eiwitten worden gecodeerd in de kern en moet in het organel te worden geïmporteerd. Import kunnen optreden tijdens het eiwit wordt gesynthetiseerd in de buurt van de mitochondriën. Steun voor deze mogelijkheid wordt afgeleid uit recente studies, waarin veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten bleken gelokaliseerd naar de mitochondriën omgeving. Samen met eerdere demonstraties van ribosomen worden betrokken bij de buitenste membraan, suggereren deze resultaten een gelokaliseerde vertaalproces. Dergelijke gelokaliseerde vertaling kan efficiëntie invoer te verbeteren, bieden unieke regelgeving sites en gevallen van ectopische expressie te minimaliseren. Diverse methoden zijn gebruikt om de factoren en elementen die gelokaliseerd vertaling bemiddelen karakteriseren. Standaard daarvan is subcellulaire fractionering door differentiële centrifugatie. Dit protocol heeft het voordeel van isolatie van mRNA, ribosomen en eiwitten in een enkele procedure. Deze kunnen dan worden gekarakteriseerd door verschillende moleculaire en biochemical methoden. Bovendien kunnen transcriptomics en proteomics methoden toegepast op de resulterende materiaal, waardoor genoom-brede inzichten mogelijk. Het gebruik van gist als modelorganisme voor dergelijke studies heeft de voordelen van snelheid, kosten en eenvoud. Bovendien is de geavanceerde genetische hulpmiddelen en beschikbare deletiestammen vergemakkelijken verificatie van kandidaat factoren.

Inleiding

Eukaryote cellen zijn georganiseerd in verschillende compartimenten met specifieke functies. Om zijn functie te vervullen, elk compartiment bevat een unieke set van eiwitten die essentieel zijn voor de activiteit. Een mogelijk mechanisme waardoor deze eiwitten benaderen hun compartiment is door gelokaliseerde vertaling 1,2. In deze werkwijze wordt het eiwit gesynthetiseerd op zijn bestemming door ribosomen en mRNA dat er zich. Onder de waarschijnlijke voordelen van gelokaliseerde vertaling zijn toegenomen efficiëntie van eiwit targeting, verminderde behoefte aan eiwit begeleiders, en het mogelijk maken de site-specifieke regulatie mechanismen. Ook kunnen gelokaliseerde mRNA en ribosomen een afgelegen reservoir van de vertaling machines zijn in gevallen van cellulaire stress, wanneer de algemene vertaling wordt geremd.

Mitochondriën werd in de afgelopen jaren een centraal model om gelokaliseerde vertaling studeren. De meeste mitochondriën eiwitten worden gecodeerd in de kern vertaald in het cytosol,en geïmporteerd in het organel. Verschillende lijnen van bewijs geven aan dat veel van deze eiwitten worden via een lokale vertaalproces. Aanvankelijk elektronenmicroscopie en biochemische fractionering studies gedetecteerd ribosomen verbonden mitochondriën 3-5. Deze studies werden vervolgens bevestigd in vivo door het werk op specifieke mRNA's, die werden gevonden te worden ingevoerd in een cotranslational manier 6,7. Genoom-brede studies van mRNA associatie met mitochondria is gebleken dat een aanzienlijk deel van mRNA's zijn gelokaliseerd in de mitochondriën omgeving 8-10. Sommige van deze mRNA's werden verder gekarakteriseerd in vivo fluorescentie werkwijzen, zoals vissen of MTAG 9,11. Een straight-forward interpretatie van deze vereniging is dat deze mRNA's dienen als templates voor gelokaliseerde vertaling.

De mechanismen waarmee deze mRNAs benaderen mitochondria onbekend. Noncoding domeinen (meest significantly 3 'UTR's) bleken betrokken te zijn bij mRNA vereniging naar de mitochondriën 12. Deze domeinen zijn waarschijnlijk dienen als een bindingsplaats voor RNA-bindende eiwitten die het vervoer mediëren. Studies in gist bleek dat een lid van de PUM-familie van eiwitten (Puf3) ondersteunt mRNA associatie met mitochondriën 8,13. Een aannemelijke rol Puf3, die gebaseerd is op functies van andere familieleden, te remmen translatie terwijl de mRNA onderweg 14. Zo kan mRNA in een getranslateerde toestand worden vervoerd, door RNA bindende eiwitten die interageren met coderende regio. Als alternatief, een grote hoeveelheid werk suggereert dat het vervoer plaatsvindt, terwijl het eiwit wordt gesynthetiseerd. In het bijzonder werden remmers aangetoond dat ze mRNA vereniging 8,13. Bovendien vertaalde functies zoals het AUG mitochondriale targeting sequentie (MTS) of ORF's werden vermeld om lokalisatie 8,11,15. Hsp70-familie eiwit chaperone en proteïne receptor op de mitochondriën buitenmembraan bleken ook ondersteuning mRNA vereniging verder impliceert dat gecodeerde eiwitten zijn belangrijk voor mRNA lokalisatie 16. Dit is consistent met een model waarbij de ribosoom nieuwe eiwit dient als erkenning element voor het richten van mRNA-ribosoom-eiwitcomplex de mitochondriën 17.

Gelokaliseerde vertaling buurt van de mitochondria werd bestudeerd door verschillende methoden, met inbegrip van elektronenmicroscopie (naar ribosomen visualiseren) 3, FISH 9, groen RNA (specifieke mRNA's detecteren) 11, en ​​biochemische fractionering (zowel RNA en ribosomen detecteren) 10,18. Terwijl de eerste werkwijzen detecteren lokalisatie in vivo en kunnen visualisatie van het dynamische mogelijk, deze maakt de ontdekking van verschillende mRNA in een enkel experiment. Verder is het voor biochemische fractionering codering of niet-coderende domeinen hoeven niet al zijntreerd, dus hun specifieke rollen kunnen worden geëvalueerd. Biochemische fractionering is met succes gebruikt voor vele jaren, voor het isoleren van verschillende cellulaire compartimenten. Haar opdrachtgevers en beperkingen zijn goed ingeburgerd, en men kan gemakkelijk bestaande protocollen voor verschillende doeleinden te wijzigen. De nodige instrumentatie is standaard in vele laboratoria, daarom is meestal de eerste methode van keuze voor het bestuderen intracellulaire lokalisatie. We beschrijven een protocol dat was geoptimaliseerd voor isolatie van mRNA terwijl ribosomen verbonden met mitochondria. Dit protocol is dus optimaal voor het bestuderen van factoren die betrokken zijn bij gelokaliseerde vertaling buurt mitochondriën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Mitochondriën Zuivering

Weeg de pellet van de cellen. Ongeveer 0,6 g worden verkregen van 100 ml cellen.

  1. Groei 100-150 ml gistcellen OD 600 = 1-1,5 bij 30 ° C op een fermenteerbare groeimedium, zoals galactose gebaseerde groeimedium, teneinde verrijken mitochondriën.
  2. Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof.
  3. Was de pellet met dubbel gedestilleerd water en centrifuge opnieuw. Verwijder het supernatant.
  4. Resuspendeer de pellet in 1 ml DTT buffer per 0,5 g cellen. Het is belangrijk om de cellen te behandelen met een reductiemiddel om de disulfidebindingen in de celwand te breken, waardoor hydrolyse verbeteren.
  5. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 30 ° C onder zacht schudden. Ondertussen weeg 6 mg zymolyase per 1 g van cellen en hang deze in zymolyase Buffer.
  6. Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 min eent kamertemperatuur en gooi het supernatant.
  7. Resuspendeer de pellet in 1 ml buffer per zymolyase 0,15 g cellen. Niet vortex.
  8. Meet OD 600 van 10 pi aliquot van de cellen in 990 pl water.
  9. Voeg zymolyase (stap 1.5) om de cellen te glucosepolymeren hydrolyseren bij de β-1 ,3-glucan koppelingen en genereren sferoplasten. Uit deze stap moet sferoplasten in een isotone oplossing gehouden om lysis voorkomen.
  10. Incubeer cellen gedurende 15 minuten bij 30 ° C (voor optimale activiteit van zymolyase) onder zacht schudden. Hydrolyse van de celwand en sferoplasten generatie verifiëren, meng 10 pl van de cellen met 990 pl water. Sferoplasten verwachting lyseren door osmotische verschillen, en de OD 600 worden ten minste 10-voudig lager dan de waarde bepaald in stap 1.9. Zo niet, verder incubatie met zymolyase nog 15 minuten.
  11. Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zorgvuldig diskaart de supernatant als de pellet kan onstabiel.
  12. Was sferoplasten met zymolyase Buffer en gooi het supernatant.
  13. Resuspendeer sferoplasten met 100 ml Recovery medium. Transfer sferoplasten een erlenmeyer en incubeer 1 uur bij 30 ° C met schudden. Dit herstel stap is noodzakelijk omdat tijdens de zymolyase behandeling vertaling is gearresteerd en mRNA lokalisatie is verstoord (Figuur 1B).
  14. Voeg 0,1 mg / ml CHX en overdracht sferoplasten een voorgekoeld 50 ml conische buis. CHX toevoeging is belangrijk om ribosomen worden betrokken bij mRNA bevriezen. Aldus wordt ribosomen mRNA associatie met mitochondriën gehandhaafd.
  15. Centrifugeer sferoplasten bij 3000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
  16. Twee keer wassen met koud Mannitol Buffer.
  17. Resuspendeer sferoplasten met 4 ml koud Mannitol Buffer en overbrengen naar een Dounce homogenisator van 15 ml voorzien van strakke montagestamper. Zachtjes breken sferoplasten met 15 slagen en breng het lysaat om een ​​13 ml buis.
  18. Centrifugeer het lysaat bij 1500 xg gedurende 6 min bij 4 ° C om kernen en ongebroken cellen neer.
  19. Breng de bovenste zorgvuldig naar een nieuwe buis. Zet opzij 1 ml (25%) van het monster als een niet-gefractioneerde monster ("Totaal" sample). Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4X LSB voor western blot analyse. Neerslag RNA van de rest van de "Total" sample (zie Protocol nr. 3, RNA neerslag).
  20. Centrifugeer het supernatant bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C naar de mitochondriën pellet.
  21. Breng de bovenstaande (~ 3 ml) naar een nieuwe buis en houd het op ijs. Dit is de fractie "cytosolische". Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4x LSB voor western blot analyse. Precipitaat RNA van de rest van de "Cytosolic" sample (zie ProtOCOL 3, RNA neerslag).
  22. Was de pellet met 3 ml Mannitol buffer en centrifugeer opnieuw bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  23. Resuspendeer de pellet met 3 ml Mannitol Buffer. Dit monster bevat de mitochondriën, en aangeduid als fractie "Mitochondriën". Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4x LSB voor western blot analyse.

2. RNA-extractie

  1. In elk monster een volume 8 M guanidinium-HCI en twee volumes 100% ethanol. Vortex en incubeer gedurende tenminste 2 uur bij -20 ° C.
  2. Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi supernatant. Wees voorzichtig als de pellet instabiel zou kunnen zijn.
  3. Was de pellet met 70% EtOH.
  4. Resuspendeer de pellet met 400 ml RNase-vrij water en breng het monster naar een nieuwe Eppendorf buis.
  5. Neerslag het RNA opnieuw door 0,1 volume 3 M natrium acetaate pH 5,2 en twee volumes 100% EtOH. Vortex en incubeer gedurende tenminste 2 uur bij -20 ° C.
  6. Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was met 70% EtOH.
  7. Air droog de pellet en resuspendeer met RNase-vrij water. Store RNA monsters bij -80 ° C. Monsters kunnen worden gebruikt voor Northern analyse 19 of microarray-analyse 18 (zie Protocol 3).

3. Voorbereiden van de RNA voor microarray analyse

  1. Resuspendeer het mRNA uit stap 2.2 met 650 ml RNase-vrij water.
  2. Om eventuele resten van DNA of eiwitten te verwijderen, toe te voegen gelijk volume (650 ml) van zure fenol: chloroform (05:01, pH 4,7) en vortex krachtig. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 2 minuten.
  3. Breng 500 ml van de bovenste fase (de waterfase) naar een nieuwe buis. Vermijd de interfase, zoals DNA bevat. Wees ook voorzichtig met het nemen van fenol, die de reverse transcriptie reactie kan remmen.
  4. Het RNA monster bevat een aanzienlijke hoeveelheid heparine, dat een krachtige remmer van reverse transcriptase. Zo RT-PCR of microarray etiket moet worden verwijderd. Verwijder heparine door LiCl neerslag: voeg LiCl tot een eindconcentratie van 2 M en incubeer de monsters gedurende de nacht bij -20 ° C.
  5. Ontdooi de monsters bij 4 ° C en centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  6. Gooi voorzichtig het supernatant en was het pellet met 80% ethanol. Centrifugeer opnieuw zoals beschreven in stap 3.5.
  7. Verwijder het supernatant, de lucht drogen en resuspendeer de pellet in 150 ml RNase-vrij water.
  8. Om eventuele LiCI te verwijderen, precipitaat opnieuw met 0,1 volume 3 M natriumacetaat pH 5,3 en 3 volumes 100% ethanol. Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 2 uur.
  9. Centrifugeer op topsnelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Was zorgvuldig de transparante pellet met 80% ethanol en drogen aan de lucht.
  10. Resuspendeer depellet met 25 ml RNase-vrij water en houd de monsters bij -80 ° C.
  11. Volg de stappen voor RNA etikettering en hybridisatie in 18,20 beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol maakt scheiding van een-mitochondriën bevattende fractie van cytosolische componenten. De beste manier om het succes ervan te testen is naar Noord-analyse-en West-analyse (figuur 1) uit te voeren om monsters uit de verschillende isolement stappen. Drie parameters voor de isolatie kwaliteit zijn uit deze analyses. Ten eerste, of het RNA of eiwitten in de monsters intact - deze kunnen gedetecteerd als afzonderlijke banden in de analyses. Degradatie gebeurtenissen zal de verschijning van extra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Technologische ontwikkelingen in de beeldvorming had hoge resolutie instrumenten opgeleverd om mRNA lokalisatie studeren. Vandaag de dag kan men de beweging van zelfs een enkele mRNA-molecuul te meten op de msec tijdschaal 23-26. Toch traditionele biochemische benaderingen, als hierboven beschreven, zijn ook informatief en de voorkeur in sommige gevallen. Biochemische isolatie kan zuivering van een groot repertoire van mRNA en eiwitten, en verdient daarom de voorkeur voor genoom-breed onderzoek. In een isolat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines en Doron Rapaport voor hulp en commentaar tijdens de oprichting van dit protocol. Dit werk wordt gefinancierd door de ISF (licentienummer 1193-1109).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gist Extract
BactoPeptone
GalactoseDoe Galactose niet te autoclaveren
GroeimediumVoor mitochondriale verrijking moet je een niet-fermenteerbare koolstofbron gebruiken, zoals een op galactose gebaseerd groeimedium gesteriliseerd 1% Gist Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Elke keer vers maken
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4, 16 mM K2HPO4. Filter deze buffer (0.2 μm) en bewaar op kamertemperatuur voor toekomstig gebruik
Zymolyase 20T20.000 U/g
HersteelmediumOp galactose gebaseerd groeimedium aangevuld met 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparine
1 mM Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Voeg vers toe: 0.5 mg/ml Heparine, 0.1 mg/ml CHX en 1mM (PMSF). Filter deze buffer en gebruik hem ijskoud
8 M Guanidinium-HCl
100% en 70% Ethanol (EtOH)
3 M Natriumacetaat, pH 5.2
10 M LiCl stockoplossing
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Broomfenolblauw
4x LSB250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol en 0.02% Broomfenolblauw
Dounce homogenisator van 15 ml capaciteit uitgerust met een goed passende stamper

Referenties

  1. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  2. Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
  3. Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
  4. Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
  5. Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
  6. Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
  7. Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
  8. Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
  9. Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
  10. Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
  11. Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
  12. Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
  13. Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
  14. Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
  15. Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
  16. Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
  17. Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
  18. Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
  19. Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
  20. Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
  21. Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
  22. Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
  23. Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
  24. Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
  25. Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
  26. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
  27. Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
  28. Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
  29. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
  30. Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
  31. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
  32. Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
  33. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van mitochondri ngistcellendifferenti le centrifugatieRNA extractieNorthern analyseWestern blotmitochondriale fractiecytosolische fractiemRNA associatieribosoombinding

Gerelateerde artikelen