Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

Samenvatting

Dendritische cellen (DCs) scheiden IL-1β reactie op TLR8 erkenning van synthetische purine, R848, gevolgd door NLRP3 inflammasome activering met nigericine derhalve IL-1β kunnen worden gebruikt om NLRP3 inflammasome te meten. Intracellulaire cytokine kleuring, immunoblotting en ELISA worden gebruikt om NLRP3 inflammasome priming en activering van IL-1β expressie nauwkeurig te meten.

Samenvatting

Ontstekingsprocessen gevolg van de secretie van interleukine (IL) -1 familie cytokinen door immuuncellen tot lokale of systemische inflammatie, weefselremodellering en reparatie en virologische controle ^{1, 2.} Interleukine-1β is een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons en draagt ​​bij aan elimineren binnendringende ziekteverwekkers terwijl het voorkomen van de oprichting van persisterende infectie ^1-5.

Inflammasoom zijn de belangrijkste signalerende platform voor de activering van interleukine 1 omzettend enzym (ICE of Caspase-1). De NLRP3 inflammasoom vereist ten minste twee signalen in DCs tot IL-1β secretie ⁶ veroorzaken. Pro-IL-1β eiwitexpressie wordt beperkt in rustende cellen; dus een priming signaal vereist voor IL-1β transcriptie en eiwitexpressie. Een tweede signaal gedetecteerd door NLRP3 resulteert in de vorming van multi-eiwit NLRP3 inflammasome. Het vermogen van dendritische cellen om verantwoordelijkheidd de signalen vereist voor IL-1β secretie kan worden getest met behulp van een synthetisch purine, R848, die wordt waargenomen door TLR8 in menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen (moDCs) prime cellen, gevolgd door activering van de NLRP3 inflammasome de bacteriële toxine en kalium ionofoor, nigericine.

Monocyten afgeleide DCs zijn gemakkelijk geproduceerd in cultuur en geven significant meer cellen dan gezuiverde humane myeloïde DCs. De hier gepresenteerde methode verschilt van andere inflammasome assays die het gebruikt in vitro humane plaats van muizen afgeleide DCs waardoor voor de studie van de inflammasome in humane ziekten en infecties.

Inleiding

Activering van aangeboren immuunsysteem moet adaptieve immuunreacties sturen tijdens infectie, ziekte en vaccinatie ^7. Dendritische cellen zijn de meest krachtige antigeen-presenterende cellen van het aangeboren immuunsysteem; Zij zijn gespecialiseerd voor de opname van antigenen, migratie naar lymfeklieren en activatie van naïeve CD4 ⁺ en CD8 ⁺ cytolytische T-cellen ^8-10. Om een ​​snelle detectie van pathogenen in staat het aangeboren immuunsysteem maakt gebruik van tal van kiembaan gecodeerde patroonherkenning receptoren (PRR) dat geconserveerde pathogeen afgeleide motieven of gastheer afgeleide markers van cel stress en schade te herkennen. Toll like receptoren (TLR's) zijn membraangebonden patroonherkenning receptoren die bepaalde extracellulaire phagocytized pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en gevaar geassocieerde moleculaire patronen (dempt) herkennen. Daarentegen knipoog like receptoren (NLRs) zijn cytosolische en reageren op een breed scala van PAMPs en DAMPs. Knikken like receptoren opnieuwpresenteren een tweede verdedigingslinie tegen pathogenen die celoppervlak en endocytische PRRs ontwijken. De interactie van pathogeen afgeleide of "gevaar" verbonden factoren TLR-liganden en NLR leidt tot een toestand van DC rijping leidt tot een verhoogde DC interactie met andere cellen en stimulering van T-cellen en natuurlijke killer cel activatie ^11.

Interleukine-1β is een cruciaal onderdeel van de afweer tegen infecties. Bij herkenning van een micro-organisme, de zeer pro-inflammatoire cytokine IL-1β, wordt uitgescheiden en functioneert als een chemo attractant en activator van aangeboren en adaptieve immuunsysteem cellen. In vivo IL-1β is grotendeels verantwoordelijk voor de acute fase respons waaronder koorts en inflammatoire cytokine synthese ^12.

De meeste NLRs bevatten C-terminale leucine rich repeat domein waarvan wordt gedacht dat functioneert ligand detectie, een centrale nucleotide bindend domein (NACHT) die important voor NLRP3 oligomerization, en een N-klem effector domein (PYD in NLRP3) dat signaaltransductie bemiddelt naar stroomafwaartse doelwitten via eiwit-eiwit interacties. De NLRP3 eiwit bepaalt de meest intensief bestudeerde inflammasome complex. Dit eiwit is een lid van de familie NLR en heeft de mogelijkheid om een ​​multi moleculaire eiwitcomplex samengesteld NLRP3, de adaptor eiwit PYCARD (ook bekend als ASC) en ICE vormen. Bij inflammasoom activering PYCARD bindt aan NLRP3 N terminale domeinen en werft ICE via caspaseactivering en werving domein (CARD) domeinen. Interleukine-1 omzettend enzym wordt aanvankelijk geproduceerd als een zymogeen dat een CARD motief aan zijn N-terminus. Inflammasoom formatie resultaten in het brengen van twee ICE moleculen dicht genoeg bij hun autokatalytisch activering induceren. Inflammasome complex is noodzakelijk voor het activeren ICE waardoor deze cytoplasmatische pro-IL-1β omzetten cytokine rijpen.

Succesvolle secretie van IL-1β in DCs vereist sensing van twee verschillende en onafhankelijke gevaar signalen. Eerste, TLR sensing van PAMPs, DAMPs of cytokine signaling (TNF of IL-1β) veroorzaakt een verhoogde expressie van cytoplasma pro-IL-1β eiwit expressie. Een tweede, vaak verschillend, signaal nodig inflammasome complexvorming vóór ICE rijping. Enkele inflammasoom stimulerende signalen omvatten bacteriële porie vormende toxinen (zoals nigericine), lysosomale verstoren kristallen (zoals monosodium uraat kristallen, MSU) en extracellulair ATP. De upstream-mechanisme dat leidt tot inflammasome activering NLRP3 door deze diverse activatoren is onduidelijk. Onderzoeken naar signalering stroomopwaarts van inflammasome formatie stelt dat intracellulaire gebeurtenissen, zoals inductie van hypokaliëmie of reactive oxygen species (ROS) indirect activeren inflammasome ^13-28.

Onder de verschillende virale activatoren van de NLRP3 inflammasome is influenza, waarbij b voorzietOTH de primaire en secundaire signaal dat nodig is voor IL-1β secretie ^{3, 29-33.} Gebruik makend van muis NLRP3 knockout modellen werd gevonden dat IL-1β secretie DCs NLRP3 afhankelijk ^32. Bovendien NLRP3 knockout muizen minder aangetrokken leukocyten naar de plaats van infectie en ervaren hogere mortaliteit ^{2, 5.} Twee recente papers suggereren een mechanisme voor NLRP3 inflammasome activatie tijdens Influenza virus infectie; eerste, priming door herkenning van viraal RNA door TLR7 en TLR8 (afhankelijk TLR expressie van de reagerende cel) of door detectie van commensale bacteriën door andere TLRs cytoplasmatische pro-IL-1β expressie te induceren, gevolgd door een tweede signaal, activering van NLRP3 inflammasoom vorming door virale ionkanaal eiwit M2 op het trans Golgi netwerk ^{33, 34.} In de laatste stap, activering van de NLRP3 inflammasome wordt bewerkstelligd door verstoring van de intracellulaire ionische milieu leidt tot ROS productie, die eenvoudig, gedetecteerd door NLPR3 als signaal naar de inflammasome vormen. De precieze mechanisme van activatie inflammasome stroomopwaarts van ICE activiteit gedurende Influenza infectie nog steeds onduidelijk.

Dit werk beschrijft een techniek voor het bestuderen van de waardevolle NLRP3 inflammasome in menselijke moDCs die kan worden gebruikt als een basis voor verder onderzoek van de pathway DC gebaseerd IL-1β secretie in reactie op TLR8 ligatie met R848 gevolgd door activering van de inflammasome door een goed bekende activator van NLRP3, nigericine. Variaties van deze werkwijze kan worden gebruikt met andere celtypen waaronder, maar niet beperkt tot: monocyten, macrofagen, andere DC subsets en epitheelcellen.

Protocol

Ethiek Verklaring: Onderzoek monsters worden verkregen en opgeslagen voor onderzoek met toestemming van donoren. Alle monsters worden gecodeerd of geanonimiseerd vóór gebruik. Dit protocol volgt de richtlijnen van onze Institutional Review Board.

1. Differentiatie van de humane perifere bloed monocyten in monocyten afgeleide dendritische cellen.

Opmerking: menselijke buffy coats dienen als bron van menselijke perifere bloedcellen (PBMC) en werden verkregen van New York Blood Center (New York, NY). Bloeddonoren zijn gezonde vrijwilligers. De 5 dagen procedure begint met de beplating van humane perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) op weefselkweek kolven ^35,36. Opmerkelijke verschillen van de gepubliceerde protocollen zijn:

1. Gebruik 225 cm ² pyrogeenvrij polystyreen weefselkweekflessen met een filter dop tot een totaal van 2x10 ⁸ PBMC per fles houden in plaats van 10 cm polystyreen weefselkweekplaats (58 ^cm2) (stap 1).
2. Bereid medium met 5% gemengd menselijk serum (PHS, 30 ml) in 500 ml RPMI-1640 + L-glutamine, 5 ml 1 M HEPES buffer en 1,4 ml 50 mg / ml Gentamicine (5% PHS media) gevolgd door filtratie door een 20 um filter. Voeg een totaal van 50 ml 5% PHS media per 225 cm ² weefselkweek kolf.
3. Was gehandeld cellen drie keer met 25 ml vers RPMI-1640. Schud krachtig gedurende 5 seconden tijdens elke wasbeurt en zuig niet hechtende cellen (stap 4).
4. Voeg 190 ul van 400 IE / ul IL-4 en 380 pl van 100 IE / ul GM-CSF per fles (stap 3) op dag 0, 2 en 4. Dag 0 wordt gedefinieerd als de dag PBMC's eerst worden uitgeplaat in stap 1 (stap 8).
5. Harvest dag 5 moDCs bij een concentratie van 1x10 ⁶ cellen / ml (stap 15).
6. Gebruik moDCs onmiddellijk in hun rusttoestand. Stappen 17-22 zijn nooit uitgevoerd. Opmerking: De monsters moeten zo snel mogelijk na afname worden verwerkt voor de beste resultaten.
7. Aliquot moDCs bij een concentratietie van 2x10 ⁵ cellen / putje (200 ul / putje van de 1x10 ⁶ cellen / ml) in een 96 putjes met ronde bodem plaat (Western blot, ELISA, FACS) of op een poly-L-lysine behandelde chamberslide (microscopie) voor experimenten . Let op: Er zijn dan minstens 4 voorwaarden: Geheel gestimuleerde (negatieve controle), priming, alleen op de activering en priming gevolgd door activering. Voorwaarden kan worden uitgebreid tot verdunner controles voor R848 en nigericine omvatten indien gewenst. Als de stroomafwaartse assay ICS, duplicaten nodig voor isotype controles.

. 2 Het voorbereiden van de inflammasome - Signaal 1

1. Reconstitueer gevriesdroogd R848 in DMSO volgens de instructies van de fabrikant. Verdunnen werkvoorraad bij RT met RPMI-1640.
2. Voeg R848 bij een 10 uM uiteindelijke concentratie te putten voor 18 hr eigenen. Plaats cellen in een incubator bij 37 ° C en 5% _CO2.

3 activeren NLRP3 inflammasome -. Signal2

1. Reconstitueer gevriesdroogd nigericine in ethanol volgens de instructies van de fabrikant. Verdun werkvoorraad bij KT met RPMI-1640 voor het toevoegen aan de passende voorwaarden.
2. Voeg nigericine op 20 uM eindconcentratie en terug naar de incubator bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 6 uur. Geen wasstappen plaatsvinden tussen priming en tijdens de activering. Opmerking: Afscheiding van IL-1β wordt verhoogd door de aanwezigheid van calcium ionoforen, brefeldine A, monensine, dinitrofenol of carbonyl cyanide chlorophenylhydrazone ^{37, 38.} Derhalve wordt toevoeging van deze secretoire remmers niet aanbevolen bij het analyseren inflammasome priming of activiteit omdat afscheiding van IL-1β zal veranderen.

4. IL-1ß Sample Collection

1. Centrifugeer de plaat met cellen en bovenstaande vloeistoffen bij 974 xg gedurende 3 minuten.
2. Zonder de celpellet, zuig de supernatant en transfer alseparate ronde bodem plaat om cytokineafscheiding meten van de bovenstaande vloeistoffen. Opmerking: Supernatanten tijdelijk bij -20 ° C worden opgeslagen of -80 ° C voor lange termijn opslag.
3. Was de cellulaire pellets driemaal met 200 ul van 1 x PBS bij 974 xg gedurende 3 min elk extracellulair IL-1β van de cellulaire monsters te verwijderen. Opmerking: Bij het wassen cel pellets uit een 96 wells plaat, verwijder de was door een snelle plaat inversie in een opvangbak, zodat het monster niet storen.

5. Meten IL-1ß Van cellulaire en Supernatantmosters

1. Intracellulaire Cytokine kleuring (ICS): De ICS-protocol is onder ^{39, 40} beschreven. Let op: niet de cellen niet op te schorten indien de downstream-test is microscopie. Alle wassingen en wensen moet gebeuren zonder de cellaag / pellet (afhankelijk van de stroomafwaartse assay).
   1. Voeg 100 ul van 5% PHS media in geschikte putjes. Toevoegengeschikte (ongeveer 1 μl/2x10 ⁵ cellen of 1 gl / putje) van fluorescent gelabelde α-CD11c en α-CD14 (fenotype markers, kloon B-Ly6 en MφP9, respectievelijk) of isotype controle met betrekking tot de cellen gedurende 10 minuten bij RT in het donker.
   2. Was driemaal met 1 x PBS bij 974 xg gedurende 3 minuten.
   3. Fixeer de cellen door toevoeging van 100 pl 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   4. Pauze Point: Wassen met 100 ul 1x PBS bij 974 xg gedurende 3 min en bewaar bij 4 ° CO / N in 1x PBS.
   5. Voeg 100 ul permeabilisatie buffer cellen gedurende 30 minuten. Opmerking: permeabilisatie buffer bestaat uit 1x PBS met 0,3% Triton X-100 en 1% runderserumalbumine (BSA) voor permeabilisatie. Niet storen hechtende cellen als downstream test is microscopie.
   6. Voeg het juiste volume (ongeveer 62 ng antibody/2x10 ⁵ cellen, of ongeveer 2,5 gl / putje) van α-IL-1β-FITC (kloon 8516) of isotype controle voor2 uur in een incubator bij 37 ° C.
   7. Was de cellen drie maal met 200 ul permeabilisatie buffer bij 974 xg gedurende 3 minuten in het donker.
   8. Optioneel: Vlek met DAPI, voeg inbedmiddel en plaats dekglaasje voorzichtig op een glasplaatje. Laat inbedmiddel te genezen O / N voor het vastleggen van microscopie beelden.
   9. Het verwerven van de gegevens door FACS of microscopie. Opmerking: Vergelijk de isotype voor elke voorwaarde om de juiste vlekken bij het analyseren door FACS of microscopie.
      1. FACs: Bemachtig een monster per keer. Stel de FSC / SSC hek aan de levende cellen, gevolgd door gating op CD11c ⁺ CD14 ^- cellen voor het analyseren van de MoDC bevolking pro-IL-1β kleuring.
      2. Microscopie: Stel de belichtingstijd met behulp van de positieve kleuring monster - R848 behandeld. Gebruik DAPI ⁺ pro-IL-1β ⁺ en DAPI ⁺ pro-IL-1β ^- het percentage pro-IL-1β + expressie moDCs bepalen.
2. SDS-Pagina: immunoblotting uitgevoerd pro-IL-1β detecteren. Opmerking: De hieronder beschreven techniek is samengesteld uit standaard immunoblotting techniek, gradiënt 4-20% polyacrylamide gel, en fluorescente of chemiluminescente detectie ^{41, 42.}
   1. Lyse cellen direct in 10 pl denaturerende lysis buffer (5 ul β-mercaptoethanol/950 pl Laemmli monsterbuffer, gevolgd door verdunning 1:1 met cellysis buffer). Transfer lysaat 1,5 ml Eppendorf buisjes.
   2. Warmte lysaat op een droge plaat gedurende 10 minuten bij 100 ° C.
   3. Spin lysaat bij 20.800 xg een minicentrifuge gedurende 1 min naar het vloeistofvolume concentreren. Pauze punt: monsters bij -20 ° C worden ingevroren voor korte termijn opslag.
   4. Laad het totale volume op de polyacrylamidegel. Ren 140 V door de gel doos voor ongeveer 1 uur, of totdat de kleurstof voorkant loopt uit de bodem van de gel.
   5. Breng het eiwit uit de polyacrylamidegel op een PVDF Immobilon-FL membrane gedurende 90 minuten bij 100 V. Blok het membraan met 5% BSA in Tris gebufferde zoutoplossing / 0,1% Tween-20 (TBS-T) gedurende 1 uur. Opmerking: PVDF Immobilon-FL is het beste voor gebruik met fluorescerende detectie. Een membraan met een andere samenstelling wordt aanbevolen voor andere detectietechnieken om het signaal te verhogen tot achtergrond verhouding.
   6. Verdun primaire en secundaire antilichamen in 10 ml van 5% BSA / TBS-T. Voer primair antilichaam incubatie bij 4 ° CO / N onder schudden en secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder schudden.
   7. Was het membraan 3 maal met TBS-T gedurende 5 minuten onder schudden tussen primaire en secundaire antilichaam incubatie en weer tussen secundaire incubatie en beeldvorming. Opmerking: Banden kunnen worden gedetecteerd met fluorescente of chemiluminescente detectie. Volg de instructies van de fabrikant voor de detectie.
3. ELISA: Monsters die voor opslag worden ingevroren moeten in evenwicht te RT voor de analyse. Spin down monsters in een centrifuge om supernatant condens consoliderenatie. De instructies van de fabrikant voor het meten van IL-1β. Opmerking: In dit protocol IL-1β wordt specifiek gemeten; Gelijktijdige meting van TNFa, IL-6, en immuunmodulerende cytokine IL-10 waarborgen de juiste voorwaarden worden gevuld.

Resultaten

Deze technieken meten TLR8 priming met R848. Intracellulaire cytokine kleuring voor pro-IL-1β zorgt voor microscopie en FACS uitlezingen van CD14 ^- CD11c ⁺ moDCs. Beide technieken kunnen worden gekwantificeerd ten opzichte van een niet-geprimede of rusten, celcontrole en een isotype controle (figuren 1 en 2). Percentage van pro-IL-1β ⁺ kleuring cellen wordt vermenigvuldigd met het geometrische gemiddelde van de populatie het gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) te ...

Discussie

Inflammatoire cytokines zijn integraal in het sturen van het aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen virale infecties te bestrijden. Afgescheiden IL-1β is aangetoond verhogen tijdens Influenza infectie ^{3, 43, 44.} Het precieze mechanisme waardoor deze cytokinen worden verwerkt in reactie op virale erkenning humane dendritische cellen niet volledig begrepen. Myeloïde DC isolatie kits zijn duur en tijdrovend. Isolatie kits en FAC sortering kan onbedoeld stress of activeren van de cellen. Daarnaast is er vaak...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We verwerven dit artikel via onze plaatselijke apotheek met een recept
RPMI 1640 met L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Perifere bloedmononucleaire cellen	New York Blood Center		PBMC's werden geïsoleerd uit het bloed van gezonde donoren
12 putjes weefselkweekplaten	Sigma-Aldrich	3516
96 putjes ronde bodem weefselkweekplaten	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype controle	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membraan	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12% polyacrylamide gel	Bio Rad	161-1159
Laemmli monster buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% oplossing steriel/gefilterd
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% oplossing
Human inflammatoire cytokine bead array kit	BD	551811
Nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			Op locatie stockroom
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml werkvolume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Steriele wegwerpfiltereenheden	Thermo Scientific	569-0020
HEPES	Invitrogen	15630080
Geit α-muis IRDye 800CW	Licor	926-32210
Ezel α-konijn IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor brede bereik eiwitladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol - 4 L	Fisher Scientific	A433P-4
8 kamer polystyreen vat weefselkweek behandelde glazen plaat	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707