DNBS / TNBS Colitis modellen: Inzicht geven Into Inflammatory Bowel Disease en effecten van vet in de voeding

Samenvatting

DNBS / TNBS colitis biedt een alternatieve en goedkope methode om de pathobiology van ontstekingsdarmziekte bestuderen. Het protocol besproken in dit document schetst de succesvolle toepassing van DNBS om colitis te induceren bij muizen en ratten en maakt het mogelijk om grondig te bestuderen host-mediated intestinale reacties.

Samenvatting

Inflammatoire darmziekten (IBD), zoals ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, zijn lang geassocieerd met een genetische basis, en meer recent systeem immuunresponsen op microbiële en milieufactoren. Dinitrobenzeen sulfonzuur (DNBS)-geïnduceerde colitis maakt het mogelijk om de pathogenese van IBD bijbehorende milieu-triggers, zoals stress en voeding, de effecten van mogelijke therapieën, en de onderliggende mechanismen van darmontsteking en mucosale letsel bestuderen. In dit artikel, onderzochten we het effect van dieet n-3 en n-6-vetzuren aan de dikke mucosale ontstekingsreactie op DNBS-geïnduceerde colitis bij ratten. Alle ratten werden gevoed identieke dieet met uitzondering van verschillende vetzuren [saffloerolie (SO), canolaolie (CO) of visolie (FO)] gedurende drie weken voorafgaand aan blootstelling aan intrarectale DNBS. Controle ratten gegeven intrarectale ethanol bleef het verkrijgen van gewicht op de 5 daagse studie, terwijl, DNBS-behandelde ratten gevoed lipide diëten al lost gewicht met FO-en CO-gevoede ratten aantonen significant gewichtsverlies met 48 uur en ratten SO gevoed door 72 uur. Gewichtstoename hervat na 72 uur na DNBS en met 5 dagen na DNBS, de FO groep had een hoger lichaamsgewicht dan SO of CO-groepen. Colon secties verzameld 5 dagen na DNBS-behandeling bleek focale zweren, crypte vernietiging, drinkbeker cel depletie, en mucosale infiltratie van zowel acute als chronische inflammatoire cellen die verschilden in ernst tussen groepen dieet. De SO gevoed groep toonde de meest ernstige schade, gevolgd door de CO, en FO gevoed groepen die de mildste mate van weefselbeschadiging toonde. Evenzo colon myeloperoxidase (MPO)-activiteit, een marker van neutrofiel activiteit was significant hoger in SO gevolgd door CO gevoede ratten met FO gevoede ratten met significant lagere MPO activiteit. Deze resultaten tonen het gebruik van DNBS-geïnduceerde colitis, zoals beschreven in dit protocol, om de impact van voeding bij het ontstaan ​​van IBD te bepalen.

Inleiding

Inflammatoire darmziekte (IBD) wordt gekenmerkt door chronische recidiverende ontsteking in de gastro-intestinale (GI) stelsel, waardoor de symptomen van diarree, gewichtsverlies en buikpijn. Colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD) zijn de twee belangrijkste vormen van IBD, en kan worden onderscheiden door de plaats van de ontsteking in het maagdarmkanaal. Bij UC patiënten, de ontsteking meestal gaat het rectum en strekt aansluitend de colon een variabele mate die slechts oppervlakkig slijmvlies. Daarentegen kan CD elk deel van het spijsverteringskanaal beïnvloeden, hoewel treft vooral het ileum en caecum. CD manifesteert vaak als transmurale ontsteking vaak geassocieerd met granulomen en leidt tot stricturing (fibrostenotic) en / of doordringen (fistels) ziekte. Hoewel de etiologie van IBD blijft ongrijpbaar, is het algemeen geaccepteerd dat IBD is multifactorieel, waarbij interacties tussen de gastheren immuunsysteem, genetische gevoeligheid en verantses om milieu-en microbiële factoren.

Tot op heden zijn verschillende modellen van IBD voorgesteld dat verscheidene klinische, histologische en immuunresponsen kenmerkend UC en CD is. De meest gebruikte modellen zijn voorzien van genetisch gemodificeerde muizen (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infectie geïnduceerde modellen (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptieve overdracht modellen (CD45 + RB Hoog, CD62L + cel overdracht in SCID muizen) en chemisch geïnduceerde colitis modellen (dextran natrium sulfaat (DSS), trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS) en Dinitrobenzeen sulfonzuur (DNBS)). Vanwege hun lage kosten en snelle aanvang van de ziekte, zijn chemische modellen van onschatbare waarde voor de studie van diverse aspecten van IBD overwogen. Elk van de chemische colitis modellen vermeld heeft voordelen en beperkingen in een aantal aspecten van hun klinische, immunologische en histopathologische relevantie voor IBD. DSS is een van de meest voorkomende chemische middelen om coli inducerentis bij knaagdieren ^1. Toediening van 3-10% DSS (MW: 42 kDa) voor 7-10 dagen in het drinkwater van muizen kan symptomen van colitis, waaronder gewichtsverlies, diarree met bloed, colon verkorten, mucosale ulceratie en infiltratie van neutrofielen induceren. Dit model is vooral handig voor drug discovery studies, evenals het verkennen van de mechanismen van epitheliale regeneratie, de impact van aangeboren immuniteit op mucosale homeostase, en de rol van ontsteking in het bevorderen van intestinale dysplasie en adenocarcinoom ontwikkeling. Er zijn echter enkele nadelen aan de DSS-model, zoals variatie van de concentratie van DSS nodig colitis te induceren in verschillende dierlijke faciliteiten, en inconsistente wateropname bij muizen en dus niet verenigbaar blootstelling aan DSS, waardoor variatie in de mate, omvang en verdeling van mucosale schade en ulceratie van de colon. Al deze kenmerken leiden tot heterogeniteit van de resultaten en beperken het vermogen om resultaten te vergelijken tussen studies frOM verschillende onderzoeksgroepen.

Een alternatief voor de DSS-model is het hapteen-geïnduceerde DNBS of TNBS model van colitis. Dit model maakt gebruik van rectale toediening van de mucosale sensibiliserende stoffen DNBS of TNBS, verdund in wisselende concentraties van ethanol. De toediening van ethanol is een voorwaarde voor het colon mucosale barrière te breken om de penetratie van DNBS of TNBS toe in de lamina propria. DNBS / TNBS dan haptenize de gelokaliseerde dikke darm en microbiële eiwitten immunogeen worden, zodat daardoor de gastheer aangeboren en adaptieve immuunreacties. In het algemeen wordt dit model geassocieerd met ernstige en soms bloederige diarree, gewichtsverlies en darmwand verdikking echter symptomen variëren afhankelijk van het type van knaagdieren gebruikt, evenals de timing, dosering en de mate van blootstelling aan de DNBS of TNBS in de studie. Belangrijke verschillen tussen ratten en muizen dient te worden opgemerkt, met de voordelen van lagere kosten voor de aankoop en karton, alsmede Lower lichaamsmassa voor het verminderen van per-dier kosten van een behandeling in vivo. Dit moet worden afgezet tegen de meer snel en ernstig verloop van colitis in muizen, waar de meer kwetsbare en responsieve dieren snel een humaan eindpunt kan bereiken.

De intestinale ontsteking oorspronkelijk resultaten uit ethanol geïnduceerde beschadiging darmepitheelcellen, wat leidt tot verhoogde epitheliale permeabiliteit microbiële penetratie in de mucosa, haptenization van gastheereiwitten, dit alles leidt tot infiltratie van neutrofielen, macrofagen en T-lymfocyten Th1 naar de beschadigde mucosa. In vergelijking met DNBS, wordt TNBS beschouwd als een gevaarlijk chemisch vanwege de sterk oxidatieve eigenschappen die een gevaar voor ontploffing bij contact met basen zoals natrium en kalium hydroxide kan opleveren. Daarom DNBS wordt momenteel beschouwd als een voorkeur van chemische dan TNBS colitis veroorzaken. Bij knaagdieren DNBS colitis wordt beschouwd als een van de meest geschikte methoden om de vol bestuderenvleugel IBD geassocieerd modifiers van de ziekte:

1. Depressie en reactivering van colitis: Aangetoond is dat stress, angst en depressie bij IBD patiënten vaak geassocieerd met de ziekte terugval. DNBS colitis is een geschikt model om de rol van depressie en de gevolgen zijn op reactivering van colitis in muizen. Bij deze methode wordt meestal initiële inductie van colitis door DNBS, gevolgd door de resolutie van de colitis door het verlaten van de muizen gedurende 6-8 weken. De muizen worden vervolgens toegediend met een depressie veroorzaken van middelen zoals reserpine of door olfactorische bulbectomy tot depressie, gevolgd door het testen van hen voor reactivering van colitis door uitdaging met een subcolitic dosis DNBS ² induceren.
2. Stress en reactivering van colitis: Stress is andere omgevingsfactor die is verbonden met IBD pathogenese. Er is een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal dat een sterke associatie tussen chronische stress en het begin van de symptomen van UC en CD in knaagdieren suggereerts en bij mensen en niet-humane primaten ^3. DNBS ulcerosa is een goed model om stress geassocieerd reactivering van colitis studeren in zowel muizen en ratten. De werkwijze wordt gewoonlijk in een soortgelijke wijze als hierboven voor depressie behalve in plaats van depressie, worden de dieren blootgesteld aan stressoren zoals sonische en onderdrukte stress ^4.
3. Neurogene ontsteking: Een aantal studies hebben ofwel tijdelijke of permanente wijzigingen beschreven in het enterische zenuwstelsel (ENS) structuur en functie, zoals te zien in weefselmonsters van diermodellen en patiënten met IBD. DNBS is een goed model om de gevolgen van ontsteking op de ENS ⁵ staand en zowel noradrenerge en cholinerge zenuwbanen ⁶ bestuderen.
4. Letsel-herstelmechanismen: Tijdens IBD pathogenese, gastheer afkomstig schade mediatoren zoals reactieve zuurstofsoorten (ROS), stikstofoxide (NO), intercellulaire adhesie molecuul 3 (ICAM-3), en P-selectine zijn allemaal aangetoond dat plag een rol in het intestinale epitheliale verstoring. DNBS is een uitstekend model voor verwondingen veroorzaakt door de up-regulatie van deze mediatoren en mechanismen repareren die worden gereguleerd door het gebruik van selectieve geneesmiddelen of remmers ^7,8 bestuderen.
5. Transmurale ontsteking: Naast de bovengenoemde toepassingen van DNBS het model kan ook worden toegepast op transmurale darm, een klassieke functie in patiënten met CD bestuderen. Zowel DNBS en TNBS-geïnduceerde colitis geassocieerd met significante infiltratie van lymfocyten in het colon mucosa waardoor deze modellen bijzonder bruikbaar voor T-cel afhankelijke immuun mechanismen te bestuderen.

In vergelijking met de DSS-model, de voordelen van DNBS en TNBS-geïnduceerde colitis zijn lage kosten, snelle ontwikkeling van colitis (vereist gewoonlijk 1-3 dagen reproduceerbare zweren en ontstekingen tonen) en consistent gelokaliseerde schade aan de distale colon. Maar de nadelen zijn een vereiste voor eenhoger niveau van technische expertise, optimalisering van DNBS / TNBS dosis, en de noodzaak voor anesthesie voor rectale toediening.

In deze methodologische paper bestudeerden we de effecten van verschillende concentraties van n-6 en n-3 meervoudig onverzadigde vetzuren op wijziging van de colon mucosale respons op DNBS-geïnduceerde colitis bij ratten met plantaardige oliën saffloerolie (SO) en canola-olie (CO) en visolie (FO). Het is aangetoond dat n-6 en n-3 vetzuren zijn belangrijke mediatoren van intestinale ontstekingsziekte door hun rol als acylgroepen van celmembraan phosopholipids ^9. In tegenstelling tot de pro-inflammatoire potentieel van n-6-vetzuren, n-3-vetzuren bij voldoende hoge inname van zijn potentieel krachtige anti-inflammatoire middelen. De anti-inflammatoire werking van n-3 vetzuren rechtstreeks gemedieerd door vervanging van arachidonzuur als eicosanoïden substraat remmen arachidonzuurmetabolisme en indirect door wijziging van proinflammatory genexpressie en cell signaling. De n-3-vetzuren aanleiding geven ook resolvins, een familie van anti-inflammatoire mediatoren. Hoge inname van n-3-vetzuren is geassocieerd met een daling van de productie van pro-inflammatoire eicosanoïden, cytokinen, chemokinen, reactieve zuurstofspecies en expressie van adhesiemoleculen. In dit onderzoek werden ratten ad libitum diëten identiek in alle nutriënten behalve vetzuren, met als percentage energie uit vet, 20% SO, 20% CO, 18% visolie plus 2% saffloerolie (FO) ^10-11 . Als percentage van de dagelijkse energiebehoefte, de SO dieet verstrekt 15% linolzuur (LA), met <0,06% α-linoleenzuur (ALA) en geen eicosapentaeenzuur (EPA) en docosahexaeenzuur (DHA), de CO dieet had 4,2 LA% en 1,9% ALA zonder EPA of DHA, en de FO dieet verstrekt 1.4% EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, en 0,12% ALA. Drie weken na aanvang van de lipide diëten werden de muizen waaraan intrarectale DNBS of 50% ethanol en 5 dagen later opgeofferd. De inflammatory respons werd geëvalueerd door beoordeling van gewichtsverlies, histologische beschadiging scores en weefsel myeloperoxidase activiteit.

Protocol

Procedures waarbij proefdieren volgen dierverzorging richtlijnen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van British Columbia geschetst.

In dit protocol genoemde procedures worden beschreven voor zowel ratten als muizen, terwijl de representatieve resultaten van Sprague-Dawley ratten worden gepresenteerd.

1. Voorbereiding van DNBS en intrarectale Administration

1. Voor rectale indruppelen van DNBS bij ratten, vers bereiden 15-30 mg DNBS/250 ul van 50% ethanol. Voor muizen, bereiden 2-6 mg DNBS/100 pl 50% ethanol. Opmerking: Optimaliseer de exacte DNBS concentratie bij elke faciliteit te worden toegediend. Mannelijke Sprague-Dawley ratten, en C57BL / 6 muizen hebben de voorkeur voor inductie van DNBS colitis, maar andere muis en rat stammen kunnen worden gebruikt. Muizen en ratten behandeld met alleen 50% ethanol kan als controlegroepen gegeven maar de effecten van ethanol zijn mild of afwezig zijn, kan omit de opneming van deze groep voor een studie ^12.
2. Bevestig een 1 ml spuit met een 19 G naald die een polyethyleen katheter (PE-90 - ratten of PE-50 - muizen) bevestigd aan het einde.
3. Licht verdoven de rat of muis rusten op een verwarmingselement (bijvoorbeeld door het toedienen van 1,5% isofluraan via neuskegel, moeten de dieren nog steeds knipperen en slikken reflexen en weer regelmatig ademhaling). Solliciteer traan gel om de ogen voor de ogen te vermijden uitdrogen.
4. Voorzichtig passen druk met de vingertoppen op het achterste uiteinde van het dier aan een kruk die in de distale dikke darm te verwijderen.
5. Duw de katheter intrarectaal, met de catheter bereiken ongeveer 8 cm proximaal van de anus voor ratten, of 3-4 cm voor muizen. Injecteer een kleine hoeveelheid van de oplossing bij het inbrengen van de katheter te smeren, waardoor gemakkelijker inbrengen. Opmerking: Als een weerstand voelt bij het inbrengen van de katheter, ga dan niet verder in te voegen, omdat dit kan leiden tot perforatie vande darmwand. Verwijder de katheter en probeer er zachtjes teruggeplaatst, opnieuw smeren van de dikke darm als procedure.
6. Injecteer langzaam 250 (ratten) of 100 (muizen) gl DNBS, of een gelijk volume of 50% ethanol controles. Na het injecteren van de DNBS, plaatst het dier hoofd naar beneden gedurende 90 seconden om het verlies van de DNBS voorkomen.
7. Na DNBS administratie, voeren van de dieren 8% sucrose water in 0,2% zoutoplossing om uitdroging tijdens de eerste week te voorkomen.
8. Let zorgvuldig op de dieren, met dagelijkse controle voor gewichtsverlies en uitdrogingsverschijnselen of nood voor de duur van het experiment. Opmerking: Gewichtsverlies kan snel naderen de CCAC aanbevelingen van het maximaal toegestane gewicht te verliezen. Aangezien dit meestal afkomstig van uitdroging, gewichtsverlies moet worden gebruikt als een indicator voor het toedienen van Ringer lactaat om uitdroging te beperken. Zorg ervoor dat u overleggen met de faciliteit dierenarts over gezondheidskwesties als passend.

2. Collecting Weefsels en beoordelen van histologische schade in DNBS Uitgedaagd Muizen

1. Op het gewenste tijdstip na challenge met DNBS, euthanaseren dieren door overdosering met isofluraan in een verdovingsmiddel kamer aangevuld met voldoende zuurstof. Observeer het dier tot er geen stijgende of dalende van de borst wordt gezien en er is geen tastbaar hartslag. Bevestig het dier correct is gedood door de afwezigheid van een respons op teen knijpen of aanraken van het hoornvlies, gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Open de buikholte en verwijder de gehele dikke darm. Open de darm longitudinaal; macroscopische mucosale ulcus ongeveer 5-6 cm proximaal van het distale einde van de dikke darm bij ratten (2-3 cm in muizen) worden waargenomen. Opmerking: Na het verwijderen van de dikke darm, macroscopische schade scores beoordelen indien gewenst. Verzamel segmenten van de dikke darm van overeenkomstige anatomische locatie van controle dieren. Opmerking: De personen scoren het weefsel voor macroscopische schade scores moetenverblind de identiteit van de behandelingsgroepen. Score weefselsecties met de volgende of soortgelijke criteria: ernst en omvang van ulceratie (0-10), gesommeerd met scores of afwezigheid van diarree (0 of 1), adhesies (0, 1, of 2) en maximaal dikke wanddikte in millimeters ^11.
3. Verzamel 0,5 cm gedeelten proximaal van de plaats van maximale macroscopische schade. Snap een 0,5 cm doorsnede in vloeibare stikstof te bevriezen om later te beoordelen myeloperoxidaseactiviteit (MPO) (een maat voor de infiltratie van neutrofielen), en plaats de andere afdeling in 10% neutraal gebufferde formaline voor histologische analyse. Opmerking: snel bevroren weefsel voor myeloperoxidase test kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende 1 maand.
4. Laat de verzamelde voor histologische analyse in stap 2.3 weefsels te repareren in formaline s nachts, en daarna wassen met 70% ethanol. Embed weefsels in paraffine en gesneden tot de gewenste dikte (3-5 micrometer), vlek met hemotoxyline en eosine (HE) voor histologische scoren.
5. Hebben twee waarnemers scoren ten minste drie coupes uit elk dier onder een lichtmicroscoop het histologische schade scores voor elke groep te bepalen. Opmerking: De personen maken het weefsel op histologische schade scores worden verblind de identiteit van de behandelingsgroepen. Score weefselsecties met de volgende of soortgelijke criteria: omvang van ontstekingscelinfiltraat (0 = afwezig, 3 = transmurale), verlies van mucosale architectuur (0 = afwezig, 3 = ernstig), aanwezigheid of afwezigheid van crypte abcessen (0-1) , en beker cel depletie (0-3). Bepaal histologische schade score als de som van deze scores ^11.

3. Het uitvoeren Myeloperoxidase (MPO) Assay op DNBS Uitgedaagd darmweefsel

1. Assay MPO activiteit in de 0,5 cm dikke segmenten verkregen in stap 2.3. Homogeniseer weefsel in MPO homogenisatiebuffer (0,5% hexadecyltrimethyl ammonium bromide in 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 6,0)) naar 50 mg colon segme gevennt / ml homogenisatiebuffer suspensie.
2. Aliquot de gehomogeniseerde oplossing in 1 ml porties en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 2 min bij 10.000 x g.
3. Meng 100 pl elk aliquot 2,9 ml 50 mM fosfaatbuffer (pH 6,0) die 0.167 mg / ml o-dianisidinedihydrochloride en 0,0005% waterstofperoxide in een cuvet.
4. Meet de snelheid van absorptie met behulp van een spectrofotometer bij 460 nm. Opmerking: MPO activiteit gedefinieerd als de hoeveelheid enzym afbrekende 1 umol / min H ₂ O ₂ H ₂ O bij kamertemperatuur en wordt uitgedrukt in eenheden per mg weefsel.

Resultaten

Uitdaging van ratten (Sprague-Dawley) of muizen (C57BL / 6) met DNBS resulteert typisch in voorbijgaande gewichtsverlies en diarree, soms met bloed in de ontlasting. Echter, factoren zoals genetica, dieet en de darmflora gevoeligheid wijzigen om DNBS geïnduceerde colitis. Daarom dieren opgenomen in de experimenten moet worden van dezelfde instelling, ofwel afgeleid lokaal of besteld bij een dier leverancier. Alle dieren moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op de mate van gewichtsverlies en verschijnselen van ongerief ...

Discussie

De DNBS model beschreven in dit protocol is een waardevol, goedkoop en reproduceerbaar colitis model dat kan worden gebruikt om verschillende aspecten van IBD bestuderen. Wanneer intrarectaal toegediend aan ratten of muizen, DNBS induceert een aanzienlijke mate van ontsteking en weefselbeschadiging in de dikke darm, de ziekte lijkt op humane Crohn in termen van verschillende histologische kenmerken zoals transmurale infiltratie van polymorfonucleaire cellen en overheersende NF-kB-afhankelijke activatie Th1.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 ml Syringe	BD Biosciences	309659
19 G Needle	BD Biosciences	305187
Polyethylene tubing PE-50	BD Biosciences	427517	voor intrarectale toediening bij muizen
Polyethylene tubing PE-90	BD Biosciences	427519	voor intrarectale toediening bij ratten
DNBS	MP Bio	150959
Tear gel	Novartis	63601662596
10% Formalin	Fisher	5F93-4
Verwarmingskussen	Kent Scientific	TPZ-0510
Ethanol	Fisher	A-962.4
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide	Sigma-Aldrich	H5882
Kaliumfosfaatbufferoplossing	Sigma-Aldrich	79628-
o-Dianisidine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	waterstofperoxide
Spectrofotometer	BioRad	Benchmarker Plus
Lichtmicroscoop	Zeiss	Axio Image.Z1
Data-analysesoftwareprogramma	GraphPad Software	GraphPad Prism Software versie 4.00	www.graphpad.com