Methodenartikel

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

DOI:

10.3791/51308

⸱

25 maart 2014

 ,  ,  , 
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp 1,2. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald tot 384 putjes. De verkleinde protocol vermindert reagens met 75% en is hoger doorvoer dan eerder beschreven 96-well protocollen 1,3-5. Specifiek proefopzet maakt robuuste en reproduceerbare analyse tot 15 peptiden tegen een MHC allel per 384-well ELISA-plaat. Met een vloeistofverwerking robot, deze methode maakt het mogelijk onderzoeker ongeveer negentig testpeptiden in drievoud over een bereik van concentraties acht en vier MHC allel soorten van minder dan 48 uur geanalyseerd. Anderen werken op het gebied van eiwit deimmunization of vaccin ontwerp en ontwikkeling vinden het protocol om nuttig zijn in hun eigen werk vergemakkelijken zijn. Met name de stap-voor-stap instructies en visueel formaatvan Jupiter moet het mogelijk maken dat andere gebruikers deze methode snel en eenvoudig vast te stellen in hun eigen laboratoria.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitten zijn de snelst groeiende klasse van therapeutische middelen 6, en de snelle expansie van biotherapeutic pijpleidingen heeft steeds meer aandacht gericht op de uitdagingen in verband met de ontwikkeling en het gebruik van eiwit drugs. Een unieke behandeling voort uit het feit dat in een gezond en functionerend immuunsysteem, alle extracellulaire eiwitten worden bemonsterd door antigeen presenterende cellen (APC's). Eenmaal geïnternaliseerd door APCs, is een eiwit gesplitst in kleine peptidefragmenten en vermeende immunogene segmenten in de groef van klasse II major histocompatibility complex eiwit (MHC II) geladen. De peptide-MHC complexen worden dan weergegeven op de APC oppervlak en waar immunogene peptiden, aangeduid als T-celepitopen vormen ternaire II MHC-peptide-T-cel receptor complexen cognate CD4 T-cel oppervlakte receptoren 7. Deze kritische moleculaire gebeurtenis herkenning een complexe signaalcascade, waardoor T-cel activatie, het vrijkomen van cytokines, CD4 T-cel gemedieerde B-cel rijping, en uiteindelijk de productie van circulerende IgG-antilichamen die binden aan en duidelijk het overtredende exogene eiwit. Zo zouden immunogene eiwitten worden deimmunized door identificatie van delen T cel epitopen en mutatie sleutelresten verantwoordelijk voor MHC II complexvorming. Het draagt ​​niettemin opmerkend dat T-celepitopen talrijk en breed verspreid immunogene eiwitten kunnen zijn, en de meerderheid van epitoop verwijderen mutaties waarschijnlijk een onopzettelijk verlies van eiwitfunctie of stabiliteit veroorzaken. Daarom techniek deimmunized biotherapies kan een complexe en technisch uitdagende doelstelling, maar er bestaan ​​verschillende voorbeelden van succesvolle T-cel epitoop verwijdering projecten 3,5,8-12. Unlike-enten based "vermenselijking", die grotendeels beperkt tot antistoffen kunnen epitoop deletie worden toegepast in wezen elk eiwit doelwit ongeacht sequentie, structuur, functie of de beschikbaarheid van homologoons menselijk steigers. De eerste stap naar de uitvoering van een dergelijke aanpak is de identificatie van de belangrijkste peptide epitopen ingebed in de doelwiteiwitsequentie.

Hoge doorvoer biochemische analyses met behulp van synthetische peptiden en recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle voorlopige inzichten in identificatie en mitigatie 1,3-5 epitoop. Deze ELISA soort testen kan een krachtige aanvulling op andere eiwit / vaccins voor ontwerp en ontwikkeling zijn. Bijvoorbeeld, een gevestigde experimentele benadering van epitoop kartering voert tijd, arbeid en geld kosten ex vivo celproliferatie assays 15. In het kort wordt de primaire sequentie van een doeleiwit eerst verdeeld in een panel van overlappende peptiden, vaak 15-meren met 12 residuen overlap tussen aangrenzende peptiden. Het peptide paneel chemisch gesynthetiseerd en immunogeniciteit van elk peptide getest in een van de verschillende immunoassays die perifere bloe dienstd mononucleaire cellen (PBMC) geïsoleerd uit menselijke donoren 13,14. Een groter vertrouwen in de resultaten te bieden, worden peptiden meestal getest in duplo met PBMC van 50 of meer verschillende donoren. In gevallen waarin deimmunization is het uiteindelijke doel, is het werk nog verergerd door de noodzaak om extra panelen van gemuteerde peptiden produceren en testen van de nieuwe peptide panelen in PBMC testen vóór de invoering van elke deimmunizing mutaties in het eiwit van volledige lengte voor verdere functionele analyse 10. Hoewel deze cellulaire bepalingen blijven de gouden standaard voor de beoordeling immunogeen potentieel in menselijke patiënten, kan de efficiëntie van een exhaustieve benadering worden verbeterd door voorfilteren vermoedelijke immunogène epitopen met een snelle hoge doorvoer MHC-peptide bindingstest.

Evenzo kan biochemische peptide-MHC II bindingsproeven worden gecombineerd met voorspellende in silico methoden om radicaal te versnellen het epitoop identificatieproces.Er bestaan ​​verschillende computationele gereedschappen voor T-cel epitoop voorspelling; voorbeelden zijn ProPred 16, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, SMM-lijn 20, NetMHCIIpan 21 evenals eigen tools zoals EpiMatrix door EpiVax 22. Ook hebben epitoop voorspellers onlangs gecombineerd met andere bio-informatica en moleculaire modeling tools om geïntegreerde eiwit deimmunization algoritmen ontwikkeld om het risico dat deimmunizing mutaties eiwit structuur en functie 23-26 kan verstoren verzachten opleveren. Terwijl verscheidene epitoop voorspellers hebben bewezen redelijk accuraat 27,28, computationele resultaten steevast vereisen experimentele validatie. Snelle, high throughput, en kosteneffectieve experimentele methoden het meest geschikt zijn als een voorfilter voor het in silico epitoop voorspellingen.

In dezelfde geest, kan epitoop voorspellers antigeen selectie rijden voor omgekeerde vaccinology 29,30. Zo hebben ontwikkelingen in de bioinformatica gehele genoom schermen die snel vaccinkandidaten in de vorm van gehele eiwitten of peptide-epitopen afkomstig van pathogeen proteomen identificeren opgeleverd. Hoewel deze enabling technology is de omvorming van ontdekking en ontwikkeling van beschermende vaccins, het introduceert een nieuwe uitdaging in de vorm van intractably grote lijsten van immunogeen vaccin kandidaten. Hoge doorvoer peptide-MHC II bindingsbepalingen kan epitoop selectie begeleiden door het kwantificeren van peptide bindingsaffiniteit en bindend promiscuïteit tussen meerdere allelen MHC II. Zoals bij proteïne deimmunization, worden dergelijke experimentele methoden uiteindelijk nodig om computationele voorspelling van veelbelovende vaccin leads te valideren.

Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald tot 384 putjes beschreven. Het protocol is zeer parallel verlopende en vermindert reagens met 75% in vergelijking met eerder beschreven 96-well plaat formaat 1,3-5. Met behulp van een enkele Liquid handlingrobot Deze methode maakt het mogelijk onderzoeker ongeveer negentig testpeptiden in drievoud gemakkelijk geanalyseerd over een bereik van concentraties acht en vier MHC allel soorten van minder dan 48 uur. Dit artikel beschrijft de installatie van een 384-wells ELISA-plaat voor de analyse van zeven experimentele peptiden tegen een MHC II allel, maar spread sheet rekenmachines worden als aanvullend materiaal om zo gemakkelijk uitbreiden het experiment om een ​​aantal gewenste peptiden en / of MHC II moleculen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vier belangrijkste activiteiten bestaan ​​uit het peptide-MHC II bindingtest: 1-Binding: Test peptiden concurreren met gelabelde controle peptiden voor oplossing fase binding van oplosbare MHC II-eiwitten. Binding wordt gemeten over een breed scala van testpeptide concentraties. 2-Capture: Na de binding reactie benaderingen evenwicht, zijn peptide-MHC II-complexen opgevangen en gescheiden van niet-gebonden peptide en proteïne door conformatieafhankelijke erkenning met een geïmmobiliseerd antilichaam. 3-Detectie: Gevangen controle peptide wordt kwantitatief gedetecteerd met behulp van time-resolved fluorescentie. 4-Analyse: spectroscopische gegevens worden verwerkt, uitgezet en geanalyseerd dosisafhankelijk bindingseigenschappen van testpeptide en MHC II-eiwitten bepalen.

Op verschillende stappen in de onderstaande procedure wordt de toepassing van een vloeibare handlingrobot aanbevolen indien beschikbaar. Vooral in een 384-well formaat, geautomatiseerde doseer-en verdunning van vloeistoffen minimaliseert gebruikersfouten, leidt tot meerconsistente well-to-well volumes en levert smaller 95% betrouwbaarheidsintervallen voor IC50 waarden vergeleken met handmatige 96-well assays (gegevens niet getoond). Als een vloeistof handlingrobot niet beschikbaar is, de stappen geannoteerde met "(liquid handling robot)" kan worden met de hand gedaan. Evenzo, indien mogelijk, een geautomatiseerde plaatwasser die met de 384-well formaat is aanbevolen. Dit effectief standaardiseert de plaat wasproces. Als een plaatwasser niet beschikbaar is, de stappen geannoteerde met "(plaatwasser)" kan worden met de hand gedaan.

1. Coat de ELISA-plaat (dag 1)

  1. Verdun L243 antilichaam voorraad (0,5 mg / ml) in boraatbuffer een werkende concentratie van 10 ug / ml.
    1. Het coaten van een 384-wells plaat, voeg 200 ul van voorraad antilichaam tot 9,8 ml boraatbuffer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine voor alternatieve scaling).
  2. Voeg 25 ul van het L243 antilichaam oplossing in elk putje van een 384-well high-bindend witte ELISA-plaat. (Liquid handling robot)
  3. Sluit de plaat met een polyester film en incubeer overnacht bij 4 ° C.
    Opmerking: Elke 384-wells ELISA-plaat is geschikt voor maximaal 15 testpeptiden op acht verdunningen voor een MHC II allel, evenals de positieve en negatieve controles. Dit zal uiteindelijk opleveren drievoud metingen.

2. Maak de Test Peptide Verdunningen (dag 1)

  1. Beginnend met een 10 mM voorraadoplossing van elke test peptide in DMSO, de volgende verdunningsreeks in citraat fosfaatbuffer met 384-well polypropyleen platen (Tabel 1). (Liquid handling robot)
    Opmerking: Een volledige 384-well polypropyleen plaat vereist drie afzonderlijke ELISA platen. Een derde van een polypropyleen plaat slechts een ELISA plaat (Figuur 1) vereist.
Verwatering Nummer Volume to te nemen van voorafgaande verdunning / voorraad Volume citraat buffer toe te voegen Conc. van Verwatering Conc. in bindingsreactie Conc. in geneutraliseerd ELISA
(Pl) (Pl) (UM) (UM) (UM)
1 0.7 35.1 195,531 97,765 48,883
2 14.3 14.3 97,765 48,883 24,441
3 7.1 28.7 19,389 9,695 4,847
4 14.3 14.3 9,695 4,847 2.424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0.481
6 14.3 14.3 0.961 0.481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
Verwijder en gooi 7,1 ul van peptide-oplossing van verdunning nummer 8.

Tabel 1. Bereiding van testpeptide verdunningsreeks.

figure-protocol-1
Figuur 1. Plaat Kaart van peptide bindingsassay. (A) Kaart van de peptide verdunningen polypropyleen platen met 384 putjes. Elke polypropyleen plaat is geschikt voor drie groepen van 15 peptiden in concurrentie bindingsreacties tegen een zingen le MHC allel. (B) Na de bindingsreactie zal evenwicht wordt elke peptide fractie overgebracht in drievoud een afzonderlijke 384-wells ELISA plaat die is tevoren met anti-MHC II-antilichaam.

3. Bereid de MHC II Master Mix (dag 1)

  1. Maak de Reaction Buffer
    1. Voeg 80 ul van 1 mM Pefa Blok en 60 mg octyl-β-D-glucopyranaside tot 3.920 gl citraat fosfaatbuffer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine voor alternatieve scaling).
  2. Verdun geselecteerd MHC II voorraadoplossingen tot 101 nM in Reaction Buffer met een 15 ml conische buis (Tabel 2).
    Opmerking: zal MHC II concentratie uiteindelijk 50 nM in de bindingsreactie en 25 nM in de geneutraliseerde ELISA assay. De MHC II voorraad concentraties zullen variëren afhankelijk van de fabrikant lotnummer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine).
"> MHC II Allele DRB1 *: 1501 MHC II Stock Concentratie (mg / ml) 1.3 MHC II Stock Concentratie (mm) 20 Vol. MHC II Stock toevoegen aan (ml) 14.65 Vol. Reaction Buffer aan toevoegen (ml): 2.885,35 MHC II Master Mix Concentratie (nM) 101

Tabel 2. Voorbereiding van MHC II master mix.

4. Bereid de negatieve en positieve controles (dag 1)

  1. Voeg 21,5 ul van citraatfosfaatbuffer om de "negatieve controle" putje van de 384-well polypropyleen plaat uit stap 2.1 (Figuur 1A).
  2. Voeg 21,5 ul van citraatfosfaatbuffer aan de "controle" en van het 384-well polypropyleen plaat.
    Opmerking: de "positietieve controle "zal in hoofdstuk 5 worden afgerond, hieronder.
  3. Verwijder 49,5 ul van de MHC II Master Mix uit stap 3.2 en pipet in een 1,5 ml Eppendorf buis.
  4. Voeg 0,5 ul van citraat buffer om de 49,5 ul van de MHC II Master Mix vanaf stap 4.3.
  5. Voeg 21,5 ul van de concentratie aangepast MHC II Master Mix van stap 4.4 naar de "negatieve controle" putje van de 384-well polypropyleen plaat (Figuur 1A).
    Opmerking: deze steekproef de nul-signaal negatieve controle met MHC II eiwit, GEEN controle peptide, en NO testpeptide vertegenwoordigt.

5. Voeg de juiste controle peptide aan de MHC II Master Mix (dag 1)

MHC II Allele DRB1 * Gebiotinyleerd Controle Peptide (Residuen) Sequentie
0101 Griep-HA-B (306-318) Biotine-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amide
0301 Myoglobine (137-148) Biotine-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotine-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotine-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Griep-HA-B (306-318) Biotine-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amide
1501 MBP-B (84-102) Biotine-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Wij raden het bestellen van 10 mg schaal voor de economie.
Tabel 3. Controle Peptiden voor verschillende MHC II allelen. *

  1. Verdun de controle peptide (opgeslagen bij 400 uM in DMSO) 1:20 in vers DMSO een verdunde voorraad leveren bij 20 uM.
    1. Voeg 25 ul 400 uM controle peptide475 ul DMSO. Let op: dit is een groot risico, maar maakt nauwkeurige afhandeling van viskeuze DMSO oplossingen.
  2. Verder te verdunnen de controle peptide van stap 5.1 (20 mm) 1:100 in de MHC II Master Mix vanaf stap 3.2.
    1. Voeg 28,8 ul van controle peptide verdund in stap 5.2 om de resterende 2,850.5 ul van de MHC II Master Mix.
  3. Voeg 21,5 ul van de MHC II Master Mix met controle peptide (stap 5.2) naar de positieve controle en van het 384-well polypropyleen plaat (stap 4.2) (Figuur 1A). Opmerking: deze steekproef de high-signaal positieve controle met MHC II eiwit, controle peptide, en NO testpeptide vertegenwoordigt.

6. Maak de Binding Reactie (dag 1)

  1. Voeg de MHC II Master Mix met controle peptide (stap 5.2) aan elk van de test Peptide verdunningen (stap 2.1) in een 1:1 verhouding aan de bindingsreactie te maken.
    1. Voeg 21,5 ul van MHC II Master Mix met Control Peptide van stap 5,2-21,5 pi van elke Test Peptide verdunning vanaf stap 2.1. (Liquid handling robot)
  2. Dicht de bindingsreactie met een polyester film en incubeer 12-24 uur in een niet-gecontroleerde CO 2 incubator bij 37 ° C zonder schudden.

7. Neutraliseren en Breng de Binding Reactie (Dag 2)

  1. Verwijder de 384-well polypropyleen plaat met de bindingsreactie (stap 6.2) van de 37 ° C incubator.
  2. Verdun de bindingsreactie 1:1 met Neutralization Buffer. (Liquid handling robot)
    1. Voeg 43 ul van de neutralisatiebuffer aan elk Binding Reaction goed.
  3. Verwijder de ELISA-plaat (stap 1.3) bij 4 ° C en wassen 3x met 60 ml / putje van PBS-0,05% Tween 20. (Plaatwasser)
  4. Overdracht 25 ul van elke geneutraliseerd Binding Reactie van stap 7.2 in drievoud putjes van de antilichaam-gecoate 384-wells ELISA-plaat uit stap 7.3. (Figuur 1 ) (liquid handling robot)
  5. Bedek de ELISA-plaat met een polyester film en plaats in een 37 ° C incubator gedurende 2,5 uur of in een 4 ° C koelkast 's nachts.

8. ELISA Ontwikkeling (dag 2 of 3)

  1. Verwijder de ELISA-plaat uit stap 7.5, was 3 keer met 60 ul / putje van PBS-0,05% Tween. (Plaatwasser)
  2. Verdun Streptavidine-Europium voorraadoplossing (0,1 mg / ml streptavidine, 7 Eu 3 + / streptavidine) 1000-voudig in de DELFIA assaybuffer.
    1. Voor een 384-wells plaat, verdunnen 10 ul Streptavidine-Europium in 10 ml Assay Buffer.
  3. Voeg 25 ul van de verdunde streptavidine-Europium aan elk putje van de 384-well ELISA plaat uit stap 8.1. (Liquid handling robot)
  4. Bedek de plaat met een polyesterfilm en donkere plaats bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Opmerking: Tijdens de 1 uur incubatie, verwijder de Enhancement Solution uit de koelkast en zet opzij 10 ml / plaat in het donker bij roOM temperatuur.
  5. Na de 1-uur incubatie, was de 384-well ELISA-plaat uit stap 8.3 3x met 60 ul / putje van PBS-0,05% Tween. (Plaatwasser)
  6. Voeg 25 ul van Enhancement oplossing aan elk putje van de 384-well ELISA plaat uit stap 8.5. (Liquid handling robot)
  7. Bedek de 384-well ELISA-plaat met een polyesterfilm en laat de plaat te zitten in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
  8. Na de 10-15 min incubatie, lees de fluorescentie van de 384-wells ELISA-plaat uit stap 8.7 het gebruik van een time-resolved fluorescerende plaat reader met Europium instellingen (bijvoorbeeld Start Int: 200, Stop Int:. 1000, Ex 340, Em . 615, Cutoff: Geen, PMT: Auto, Leest / Well: 50).

9. Data Analysis

  1. Gegevens invoeren in XY-formaat grafiek met 3 repliceren waarden in de side-by-side kolommen (X = testpeptide concentratie; Y = fluorescentie meting).
  2. Log transformeren de X-waarden voor alle gegevens: X = log (X)
  3. Plaats de log transformed gegevens met een competitieve binding-plaats model om de IC50 waarde te halen.
  4. Beperk de onderste waarde naar de gemiddelde negatieve controlewaarde.
  5. Wereldwijd passen bij de top waarde en verzekeren dat de wereldwijde fit parameter is dan of gelijk aan de positieve controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgroeide peptidesequentie van Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) werd geanalyseerd met ProPred 16 naar mogelijke peptide bindmiddelen MHC allel DRB1 * 1501 (Tabel 4). ProPred geïdentificeerd 117 nonameer peptiden met aangegeven P1 anker residu (dwz een M, L, I, V, F, Y of W op positie 1, vereist voor MHC binding 31). Bij een drempel 5%, alleen peptiden met scores groter dan of gelijk aan 2,6 waarschijnlijk bindmiddelen. Aldu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biotherapeutics hebben zich gevestigd als een hoeksteen van de moderne geneeskunde, die vier van de top vijf van de verkoop van drugs in 2012 32. De sector biofarmaceutische heeft aangetoond aanhoudende groei voor meerdere jaren 6, en de voortdurende ontwikkeling van nieuwe agenten, evenals de opkomst van biosimilars heeft biofarmaceutische pijpleidingen uitgebreid. Kijkend naar de toekomst, het beoordelen en het inperken van de immunogeniciteit van therapeutische eiwitten zal een integraal onderde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leonard Moise is in dienst van en houdt aandelenopties in EpiVax, Inc, een particulier biotechnologiebedrijf gevestigd in Providence, RI. De werkzaamheden in dit onderzoeksrapport is vrij van vooroordeel dat kan worden geassocieerd met de commerciële doelstellingen van het bedrijf.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01-GM-098977 en R21-AI-098122 naar CBK en KEG. RSS werd mede ondersteund door een Luce Foundation Fellowship en voor een deel door een Thayer Innovation Program Fellowship van de Thayer School of Engineering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sodium Tetraborate DecahydrateSigma221732
Citric AcidSigmaC1901
Dibasic Sodium PhosphateSigmaS7907
Trizma HClOmniPur9310
Tween-20SigmaP7949
100% DMSOSigmaD8418
Octyl-β-D-GlucopyranasideFischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered SalineInvitrogen14200-166
DELFIA Assay BufferPerkin Elmer4002-0010
DELFIA Enhancement BufferPerkin Elmer4001-0010
Europium Labelled StreptavidinPerkin Elmer1244-360
L243 anti-HLA-DR antibodyBiolegend307602
Biotinylated tracer peptides21st Century BiochemicalsCustom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity)GenscriptCustom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)Benaroya Research Institute*Custom Order
384-well white EIA/RIA plateThermo460372
Polypropylene 384-well plateCostar3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ WaterN/AN/A
Epimotion Liquid Handler (or similar)Eppendorf5075
Select TS Plate Washer (or similar)BioTek405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)Molecular DevicesN/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720(2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463(2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238(2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9(2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180(2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048(2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636(2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

Trefwoorden

Peptide epitoopanalysehigh throughput ELISAcompetitie in vloeistoffasetijdopgeloste fluorometriepeptide MHC II complexidentificatie van immunogene epitopeneiwit de mmunisatievaccinontwerpliquid handling robot

Gerelateerde artikelen