Method Article

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

DOI:

10.3791/51308

March 25th, 2014

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp 1,2. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald tot 384 putjes. De verkleinde protocol vermindert reagens met 75% en is hoger doorvoer dan eerder beschreven 96-well protocollen 1,3-5. Specifiek proefopzet maakt robuuste en reproduceerbare analyse tot 15 peptiden tegen een MHC allel per 384-well ELISA-plaat. Met een vloeistofverwerking robot, deze methode maakt het mogelijk onderzoeker ongeveer negentig testpeptiden in drievoud over een bereik van concentraties acht en vier MHC allel soorten van minder dan 48 uur geanalyseerd. Anderen werken op het gebied van eiwit deimmunization of vaccin ontwerp en ontwikkeling vinden het protocol om nuttig zijn in hun eigen werk vergemakkelijken zijn. Met name de stap-voor-stap instructies en visueel formaatvan Jupiter moet het mogelijk maken dat andere gebruikers deze methode snel en eenvoudig vast te stellen in hun eigen laboratoria.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitten zijn de snelst groeiende klasse van therapeutische middelen 6, en de snelle expansie van biotherapeutic pijpleidingen heeft steeds meer aandacht gericht op de uitdagingen in verband met de ontwikkeling en het gebruik van eiwit drugs. Een unieke behandeling voort uit het feit dat in een gezond en functionerend immuunsysteem, alle extracellulaire eiwitten worden bemonsterd door antigeen presenterende cellen (APC's). Eenmaal geïnternaliseerd door APCs, is een eiwit gesplitst in kleine peptidefragmenten en vermeende immunogene segmenten in de groef van klasse II major histocompatibility complex eiwit (MHC II) geladen. De peptide-MHC complexen word....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vier belangrijkste activiteiten bestaan ​​uit het peptide-MHC II bindingtest: 1-Binding: Test peptiden concurreren met gelabelde controle peptiden voor oplossing fase binding van oplosbare MHC II-eiwitten. Binding wordt gemeten over een breed scala van testpeptide concentraties. 2-Capture: Na de binding reactie benaderingen evenwicht, zijn peptide-MHC II-complexen opgevangen en gescheiden van niet-gebonden peptide en proteïne door conformatieafhankelijke erkenning met een geïmmobiliseerd antilichaam. 3-Detectie: Gevangen controle peptide wordt kwantitatief gedetecteerd met behulp van time-resolved fluorescentie. 4-Analyse: spectroscopische gegevens worden verwerkt, u....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgroeide peptidesequentie van Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) werd geanalyseerd met ProPred 16 naar mogelijke peptide bindmiddelen MHC allel DRB1 * 1501 (Tabel 4). ProPred geïdentificeerd 117 nonameer peptiden met aangegeven P1 anker residu (dwz een M, L, I, V, F, Y of W op positie 1, vereist voor MHC binding 31). Bij een drempel 5%, alleen peptiden met scores groter dan of gelijk aan 2,6 waarschijnlijk bindmiddelen. Aldu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biotherapeutics hebben zich gevestigd als een hoeksteen van de moderne geneeskunde, die vier van de top vijf van de verkoop van drugs in 2012 32. De sector biofarmaceutische heeft aangetoond aanhoudende groei voor meerdere jaren 6, en de voortdurende ontwikkeling van nieuwe agenten, evenals de opkomst van biosimilars heeft biofarmaceutische pijpleidingen uitgebreid. Kijkend naar de toekomst, het beoordelen en het inperken van de immunogeniciteit van therapeutische eiwitten zal een integraal onderde.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leonard Moise is in dienst van en houdt aandelenopties in EpiVax, Inc, een particulier biotechnologiebedrijf gevestigd in Providence, RI. De werkzaamheden in dit onderzoeksrapport is vrij van vooroordeel dat kan worden geassocieerd met de commerciële doelstellingen van het bedrijf.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01-GM-098977 en R21-AI-098122 naar CBK en KEG. RSS werd mede ondersteund door een Luce Foundation Fellowship en voor een deel door een Thayer Innovation Program Fellowship van de Thayer School of Engineering.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium Tetraborate DecahydrateSigma221732
Citric AcidSigmaC1901
Dibasic Sodium PhosphateSigmaS7907
Trizma HClOmniPur9310
Tween-20SigmaP7949
100% DMSOSigmaD8418
Octyl-β-D-GlucopyranasideFischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered SalineInvitrogen14200-166
DELFIA Assay BufferPerkin Elmer4002-0010
DELFIA Enhancement BufferPerkin Elmer4001-0010
Europium Labelled StreptavidinPerkin Elmer1244-360
L243 anti-HLA-DR antibodyBiolegend307602
Biotinylated tracer peptides21st Century BiochemicalsCustom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity)GenscriptCustom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)Benaroya Research Institute*Custom Order
384-well white EIA/RIA plateThermo460372
Polypropylene 384-well plateCostar3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ WaterN/AN/A
Epimotion Liquid Handler (or similar)Eppendorf5075
Select TS Plate Washer (or similar)BioTek405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)Molecular DevicesN/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MHC II Binding AssayPeptide Epitope AnalysisHigh Throughput ELISASolution Phase CompetitionTime Resolved FluorometryPeptide MHC II ComplexImmunogenic Epitope IdentificationProtein DeimmunizationVaccine DesignLiquid Handling Robot

Related Articles