Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion

Summary

Weefselbewerkt-fibroblast afgeleid inheemse matrix is ​​een opkomende hulpmiddel om een ​​stromale substraat dat epitheelcelproliferatie en differentiatie ondersteunt genereren. Hier een protocol deze methode toegepast op de impact van verschillende stromale celtypen op tumorcel biologie beoordelen wordt gepresenteerd.

Abstract

3D organotypische kweken van epitheliale cellen op een matrix ingebed met mesenchymale cellen worden veel gebruikt voor epitheliale celdifferentiatie en invasie bestuderen. Soort rat staart I collageen en / of matrix afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom cellen zijn van oudsher gebruikt als de substraten het modelleren van de matrix of stromale micromilieu waarin mesenchymale cellen (meestal fibroblasten) worden bevolkt. Hoewel experimenten met dergelijke matrices zijn zeer informatief, kan worden gesteld dat door een dwingende aanwezigheid van een enkel eiwit (zoals type I collageen) of een hoog gehalte aan basale membraan componenten en groeifactoren (zoals matrix afgeleid uit muis sarcoom cellen), deze substraten niet de beste bijdrage matrixsamenstelling door de stromale cellen zelf weerspiegelen. Om inheemse matrices geproduceerd door primaire dermale fibroblasten geïsoleerd van patiënten met een tumor gevoelig, genetische blaarvorming stoornis (recessief Dystrofe studerenepidermolysis bullosa), hebben we een bestaande natief matrix protocol tumorcelinvasie studie aangepast. Fibroblasten worden geïnduceerd om hun eigen matrix produceren gedurende langere tijd in kweek. Deze inheemse matrix wordt dan losgemaakt van de cultuur schotel en epitheliale cellen worden gezaaid op het voordat het gehele co-cultuur wordt verhoogd tot het lucht-water grensvlak. Celdifferentiatie en / of invasie kan vervolgens worden beoordeeld in de tijd. Deze techniek biedt de mogelijkheid om epitheliale-mesenchymale cel interacties in een 3D-omgeving beoordelen zonder een synthetisch of buitenlandse matrix met als enige nadeel dat het lange tijd nodig om de natieve matrix produceren. De toepassing van deze techniek Hier beschrijven we het vermogen van een molecuul van fibroblasten type VII collageen, tumorcel invasie te remmen te beoordelen.

Introduction

Het gebruik van biomateriaal in 3D weefselkweek heeft onderzoekers in staat gesteld celgedrag te bestuderen in het laboratorium onder fysiologische omstandigheden meer verwant is aan een in vivo omgeving dan een samengevat met 2D hechting en kunststof. In het bijzonder, naar voren hebben grote vooruitgang geboekt in het modelleren van gelaagde epitheel met de goedkeuring van 3D kweekmethoden bij de lucht-water grensvlak ^1-4. Dergelijke technieken getrouw na te bootsen keratinocytdifferentiatie en tumorcelinvasie waardoor meer flexibiliteit en trouw voor onderzoekers bestuderen deze processen. De keuze van biomateriaal substraat aan de stromale omgeving nabootsen heeft vooral betrekking op het gebruik van type I collageen, Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoom matrix en de-epidermized dermis. Bijvoorbeeld zijn kanker-geassocieerde fibroblasten aangetoond bijdragen aan kankerinvasie ^5, initiatie en progressie via stroma-epitheliale interacties ^6,7 when gekweekt in dergelijke substraten.

De gouden standaard voor het nabootsen van de stromale omgeving in de huid, het grootste en meest bestudeerde gelaagde epitheel gebruik van dergelijke technieken is te de-epidermized humane dermis (DED) beschouwd. Bereiding van DED betreft het verwijderen van de epidermis via trypsine of fysische dissociatie van menselijke kadaver huid ^3,4. Niettemin kan de toegang tot dergelijke huid zeer moeilijk zijn voor laboratoria niet geassocieerd met klinische instellingen, en zieke dermis is bijna onmogelijk te verkrijgen. Als alternatief, laboratoria gebruiken vaak een combinatie van type I collageen (geïsoleerd uit staarten rat) en / of Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix.

Na de ontdekking in 1927 door Nageotte ⁸ dat collageen gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd met behulp van azijnzuur en zout neerslag, werd de toepassing ervan op weefselkweek vervolgens ontwikkeld door huzella en collega's ^9. Collageen coating bleek superieur aan glas voor celkweek van 29 stammen en weefselexplantaten als ondervraagd door Ehrmann en Gey ⁹ te zijn. Momenteel is de belangrijkste soort collageen in weefselcultuur van rat-staart pezen en wordt meestal gekocht van commerciële bronnen. Echter, het nadeel voor een getrouwe substraat recapitulatie is dat de rattenstaart collageen is niet identiek aan menselijk collageen, of de menselijke dermis, waar type I en III collageen aanwezig als belangrijkste bestanddelen zijn, en geïsoleerde rattenstaart collageen is altijd gefragmenteerd.

Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix is een geleiachtige eiwit mengsel afgescheiden door gekweekte Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoomcellen ^10. De belangrijkste bestanddelen zijn laminin, type IV collageen, heparine sulfaat proteoglycanen, entactine en nidogen en de precieze verhoudingen van deze eiwitten zal variëren van partij tot partij. Naast structurele proeiwitten, deze matrix bevat ook aanzienlijke niveaus van groeifactoren zoals transformerende groeifactor β, epidermale groeifactor, insuline-achtige groeifactor 1, runder fibroblast groeifactor en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor die celgedrag ^11,12 zou veranderen. De richting van de enorme complexiteit van Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix, een totaal van 1851 eiwitten werden geïdentificeerd in een recente proteomics onderzoek ^13. In het licht van de rijke en complexe aard van deze matrix, is voorzichtigheid is geboden bij het ​​interpreteren en vergelijken van verschillende experimenten met het gebruik van het ^11.

Onze laboratoria hebben een grote interesse in genetische huidziekten, met name die met een aanleg voor het ontwikkelen van plaveiselcelcarcinoom van de huid (CSCC) ^14. Bij recessieve dystrofische epidermolysis bullosa (RDEB), ernstige blaarvorming ziekte met kiembaanmutaties in COL7A1 gen ^{15-17, hebben wij vastgesteld dat de dermale micro bij deze patiënten tumorbevorderend 18. In de loop van deze studie konden we geen tumor bevorderende eigenschappen van dermale fibroblasten ingebed in collageen I / Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoom matrix en onderzocht hoe beoordelen eigen, inheemse matrix cellen te beoordelen. Om dit te bereiken, hebben we bewerkt een eerdere techniek vanuit het laboratorium van Lucie Germain werken op de menselijke huid equivalenten 19,20. Techniek Germain kon menselijke huid reconstrueren overzichtelijke basaalmembraan met primaire humane keratinocyten en fibroblasten kweken in afwezigheid van een synthetisch of cadaveric steiger.}

In dit artikel worden de stappen die gebruikt worden om de cutane tumor stromale micro-omgeving (native matrix) recapituleren direct afgeleid uit primaire stromale fibroblasten in vitro worden beschreven ^18. Inheemse matrices produced door langdurige kweek van fibroblasten werden als een dermale equivalent aan assay voor CSCC celinvasie. We presenteren gegevens met behulp natieve matrix verkregen uit de extracellulaire matrix afgescheiden door RDEB fibroblasten (tekort bij type VII collageen (C7)) of RDEB fibroblasten retroviraal getransduceerde met type VII collageen expressie construct en tonen de grote invloed van een collageen op tumor celinvasie.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki Principes en werd goedgekeurd door de bevoegde ethische commissies.

1. Voorbereiding van de media en reagentia

1. Bereiding van 200x van L-ascorbinezuur 2-fosfaat stock
   1. Los 29 mg L-ascorbinezuur 2-fosfaat per 5 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) oplossing en filtreer door 0,22 urn membraanfilter. Vastleggen als 0,25 ml steriel fracties in -20 ° C.
   2. Voeg 0,25 ml van 200x L-ascorbinezuur 2-fosfaat stock elk 50 ml fibroblast medium (DMEM met 1% L-glutamine en 10% foetaal runderserum) op de dag vereist, voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM L -ascorbinezuur 2-fosfaat.
2. Bereiding van keratinocyt groeimedia
   1. Isolatie en kweek van primair SCC keratinocyten zijn eerder ²¹ beschreven. Bereiding van keratinocyten groeimedia wordt beschrevendaarin ook.
   2. Kortom, bereid de media als volgt:
      300 ml DMEM en 100 ml Ham's F-12 aangevuld met 10% FBS
      0,4 mg / ml hydrocortison
      5 mg / ml insuline
      10 ng / ml EGF
      5 mg / ml transferrine
      8.4 ng / ml cholera toxine
      13 ng / ml liothyronine
      1x penicilline-streptomycine oplossing

2. In Vitro Bouw van fibroblast-afgeleide Inheemse Matrix in L-ascorbinezuur 2-Fosfaat aangevuld medium

1. Zaad 200.000 fibroblasten per putje in 6-well platen (20.000 cellen / cm ²⁾ in fibroblast medium aangevuld met L-ascorbinezuur 2-fosfaat. Opnieuw ingevoerd om de 2-3 dagen met 2-5 ml van de media. (Opmerking: Refeeding frequentie en het volume kan worden aangepast aan de individuele behoeften van verschillende cellen passen Zie "Discussies".).
2. Een dikke laag van cellen ingebed in de extracellulaire matrix aan het eind van 6 weken, zichtbaar voor het blote oog (formulier Figuur 1). Om deze laag te bevrijden van de weefselkweek plaat, zachtjes schrapen de omtrek van matrix met een 1 ml micropipet tip en duw de randen van de matrix naar het midden van de put. Deze laag van cellen en matrix (matrix natief) moeten gemakkelijk losneembaar van het plaatoppervlak, en nu te zweven in de media. Spreid de inheemse matrix in de media om te voorkomen dat het vouwen op zichzelf.
3. Laat de inheemse matrix vlotter en verbouwen voor 5 dagen, het veranderen van de media om de 2-3 dagen. Door treksterkte en intrinsieke remodeling in matrix, de matrix sterk samentrekt en wordt gereduceerd tot een kleinere, maar dikker inheemse matrix, en is klaar om te worden gebruikt voor invasie assay.

3. Invasieanalyse met Tumor SCC Keratinocyten

1. Pak de inheemse matrix voorzichtig met stompe tang en over te dragen aan nylon net. Eenmaal op de nylon net, verspreid de matrix zacht zo plat mogelijk liggen met een 1 ml micropipettip en stompe tang.
2. Bereid de steriele klonale cilinders door smeren een kleine hoeveelheid steriele vaseline aan een uiteinde.
3. Plaats de klonale cilinders op de inheemse matrix, met de vaseline naar beneden. Dit is om een ​​afdichting tussen de natieve matrix en klonale ringen waarborgen.
4. Voeg CSCC cellen aan de klonale cilinders (250.000 cellen in 100 ul keratinocyt groeimedium).
5. Verwijder de klonale cilinders na 6 uur wanneer de CSCC cellen neer op de inheemse matrix hebben gevestigd.
6. Til de nylon net met de inheemse matrix en CSCC cellen aan de lucht-water grensvlak op gebogen roestvrij staal gaas steun.
7. Voeg keratinocytengroeifactor medium aangevuld met ascorbinezuur tot de media level de bodem raakt van de oorspronkelijke matrix.
8. Verander media om de 2-3 dagen en de oogst op 7 en 14 dagen na het zaaien van CSCC cellen.

4. Oogsten van 3D Culturen en voorbereiding voor histologie

1. Fix in 4% paraformaldehyde overnacht bij kamertemperatuur.
2. Bisect de monsters en embed in was voor formaline gefixeerde in paraffine ingebedde blokken, met het snijvlak naar buiten.
3. Als alternatief insluiten de doorsneden monsters in oktober en snap-vries onmiddellijk in vloeibare stikstof voor vers ingevroren weefsel blokken.
4. Snijd 4 micrometer secties over microtoom en dewax (indien nodig). Vlekken met behulp van standaard hematoxyline en eosine. De CSCC cellen te visualiseren, monoklonaal antilichaam tegen keratine 14 (LL001, in-house) kan worden gebruikt in immunohistochemische kleuring.

Results

Deze techniek opent de mogelijkheid van onderzoek en vergelijking van de invasieve gedrag van tumorcellen (in dit geval CSCC) onder verschillende 3D stromale omgevingen. Met deze techniek kan niet alleen C7-deficiënte natieve matrices die de RDEB dermale milieu samengevat gegenereerd, maar ook andere matrices die genetisch gemanipuleerd tot overexpressie C7 ^18. Zoals gezien in figuur 2, invasie van RDEB CSCC keratinocyten was significant vertraagd in C7-overexpressie natief matrices opz...

Discussion

Vanwege de aard van dit experiment, kan de totale tijd van uitvoering maximaal twee maanden. Gedurende deze tijd moeten uiterste zorg en steriele weefselkweek methoden worden toegepast om microbiële contaminatie te voorkomen.

Naast zijn rol als cofactor bij de synthese van hydroxyproline en hydroxylysine van collagenen, ascorbinezuur stimuleert collageen mRNA expressie in fibroblasten ^22. Het ascorbinezuur keuze hier is het stabieler L-ascorbinezuur 2-f...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-Ascorbic acid 2-fosfaat	Sigma	A8960
DMEM met L-glutamine, 4.500 mg/L D-glucose, 110 mg/L natriumpyruvaat	Life Technologies	11995-073
100x Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070
Vaselina	VWR	PROL28908.290
Clonale cilinders	Sigma	Z370789
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk	Millipore	NY1H02500
Gebogen roestvrij staal gaasdraad ondersteuning	Gemaakt in huis		Afmetingen zijn gemaakt zodat het gaas zou passen in 6-well platen