Methodenartikel

Reconstructie van 3-dimensionale Histologie Volume en de toepassing ervan te studeren Mouse borstklieren

14.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51325

⸱

26 juli 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Platform Biological Sciences, Sunnybrook Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Physical Sciences, Sunnybrook Research Institute, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 6Manitoba Institute of Cell Biology, University of Manitoba

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een benadering voor beeldregistratie voor reconstructie van 3-dimensionale (3D) histologievolumes, die het onderzoek naar de veranderingen van een orgaan op het niveau van macrostructuren van cellen vergemakkelijkt. Met behulp van deze aanpak hebben we de 3D-veranderingen tussen wild-type en Igfbp7-null borstklier beoordeeld.

Samenvatting

Histologie volume reconstructie vergemakkelijkt de studie van 3D vorm en volumeverandering van een orgaan ter hoogte van macrostructuren opgebouwd uit cellen. Het kan ook worden gebruikt om nieuwe en algoritmen volumetrische medische beeldvorming en therapie onderzoeken en valideren. Het maken van 3D high-resolution atlassen van verschillende organen 1,2,3 is een andere toepassing van histologie volume wederopbouw. Dit verschaft een middel voor het onderzoeken van weefsel structuren en de ruimtelijke relatie tussen verschillende cellulaire functies. We geven een beeld registratie aanpak voor histologie volume reconstructie, die een reeks van optische blockface beelden gebruikt. De gereconstrueerde histologie volume vertegenwoordigt een betrouwbare vorm van de verwerkte monster zonder kunstmatig gekweekte nabewerking registratie fout. De hematoxyline en eosine (H & E) gekleurde coupes van twee muizen borstklieren geregistreerd hun overeenkomstige blockface beelden gebruiken grenspunten uit het edges van het monster in de histologie en blockface afbeeldingen. De nauwkeurigheid van de registratie werd visueel beoordeeld. De uitlijning van de macrostructuren van de melkklieren werd ook visueel beoordeeld met een hoge resolutie.

Deze studie schetst de verschillende stappen van deze beeldregistratie pijpleiding, van excisie van de borstklier tot 3D histologie volume reconstructie. Terwijl 2D histologie beelden tonen de structurele verschillen tussen paren van gedeelten, 3D histologie volume biedt de mogelijkheid om de verschillen in vorm en volume van de borstklieren visualiseren.

Inleiding

IGFBP7 (insuline-achtige groeifactor bindend eiwit 7) is een lid van de IGF-bindende eiwit familie, en is aangetoond dat de IGF-1 receptor 4 binden. Neerregeling van IGFBP7 bekend is gecorreleerd met slechte prognose bij borstkanker 5, terwijl de herinvoering van IGFBP7 in xenograft tumormodellen sterk remt de groei van tumoren 6 tot inductie van apoptose en cellulaire senescentie 7. Teneinde de effecten van IGFPB7 bestuderen, werd een IGFBP7-null muizen gecreëerd 5 (ongepubliceerde gegevens). Hoewel deze muizen geen tumoren, ze tonen de veranderingen in de histologie van de eierstokken, spier en lever, evenals defecten in borstklieren ontwikkeling patronen (ongepubliceerde gegevens). De defecte fenotype werd eerst aangeduid als KOmuizen kleinere worpen en niet in staat om meerdere grote tomen (ongepubliceerde gegevens) ondersteunen.

3D histologie volumes hebben de potentie om nuttige informat biedenion voor kwantitatieve en vergelijkende analyses en evaluatie van pathologische bevindingen in volumetrische medische beelden. Drie-dimensionale confocale kunnen twee-foton microscopie hoge resolutie cellen morfologische informatie van de klier op lokaal deel 14, maar heeft een beperkt gezichtsveld en diepte. Histologie volume reconstructie geeft meer informatie over een veel grotere ruimtelijke omvang. Met traditionele benaderingen enige vervorming wordt verwacht tijdens de bereiding van histologische secties, zoals krimp, uitbreiding, scheuren en plooien. Deze verstoringen bemoeilijken seriële histologische beelden register naar een 3D-stapel een 3D volume te reconstrueren. Als het aantal opeenvolgende secties met defecten verhoogt de overeenkomsten tussen intacte secties wordt verminderd en daardoor maakt het registratieproces ingewikkelder.

Verschillende werkwijzen zijn voorgesteld om coupes te registreren en een continue histologie vo creërenlume. Sommige technieken afhankelijk intensiteitsvariaties 8 en anderen zijn gebaseerd op de vorm van de profielen 9. Voor sommige exemplaren van de anatomische structuren kan worden gebruikt als oriëntatiepunten 10,11 samen met-mijlpaal registratie op basis van methoden 12,13. Maar deze interne structuren misschien niet aantoonbaar zijn in het hele volume en voor sommige exemplaren geen betrouwbare anatomische structuren kunnen worden geïdentificeerd. Sommige groepen hebben een paarsgewijs registratie aanpak gebruikt en geregistreerd opeenvolgende histologie beelden ene naar de andere met contouren of anatomische structuren 16-18. Registreren seriële histologie secties met elkaar zonder het gebruik van referentiebeelden kunnen registratiefout propageren en verander de werkelijke vorm van de histologie volume. Pair-wise registratie aanpak is gebaseerd op de consistentie van de vorm van de histologie secties en de interne structuren in de hele stapel van de beelden; daarom dichte bemonstering van het model, die vereistmisschien niet altijd mogelijk, bijvoorbeeld voor klinische monsters.

In deze pijpleiding gebruiken we blockface beelden als een set van referentiebeelden voor histologie volume reconstructie 19. Blockface beelden worden genomen van de paraffine weefsel blokken na montage op de microtoom en voor elke sectie wordt gesneden. Zo hoeft schade aan individuele seriecoupes cut niet bemoeien met de registratie van seriecoupes 8,11,15. We detecteren blockface beelden op een andere wijze dan de andere groepen. Het optisch blok gezicht beelden worden verkregen door een telecentrische lens te elimineren of te minimaliseren de loop en perspectivische vertekening, die meestal optreedt bij het gebruik van gewone lenzen in de optica. Dit is een van de voordelen van de voorgestelde aanpak via andere gepubliceerde methoden die blockface beeldvorming uitgevoerd met gewone lenzen. De beelden worden genomen onder een kleine schuine hoek met de reflectie van het oppervlak van het blok voor contrastverbetering tussen Tissue en paraffine oppervlak en de schaduw van het weefsel te elimineren in de diepte, onder de paraffine oppervlak. Een fotografisch filter wordt ook gebruikt om het licht afkomstig van het blok oppervlak en het weefsel om het contrast 19 evenwicht polariseren. Om te corrigeren voor de verplaatsing van het blok op de roterende microtoom worden 02:58 gaten in de hoeken van het blok, die gemakkelijk detecteerbaar zijn in de blockface afbeeldingen. De hartlijnen van deze gaten worden gebruikt samen met landmark-gebaseerde rigide registratie de blockface afbeeldingen uitlijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Specimen

  1. Accijnzen de melkklieren chirurgisch van wild-type CDH1 evenals IGFBP7-null muizen drie dagen na het begin van de lactatie.
  2. Spreid de klieren op glasplaatjes te helpen herwinnen inheemse borstklier morfologie.

2. Bevestiging en weefselbehandeling

  1. Bevestig de melkklieren in neutraal gebufferde 4% PFA O / N bij 4 ° C.
  2. Bewaar de klieren in 70% ethanol voor weefselverwerking.
  3. Breng de klieren om kleine weefselverwerking cassettes.
  4. Verwerk de weefsels met behulp van een geautomatiseerde weefselprocessor
    1. Dehydrateer de weefsels in toenemende ethanol en xyleen baden van 70% ethanol gedurende 45 minuten, 2 keer in 95% ethanol gedurende 45 minuten, 3 maal in 100% ethanol gedurende 1 uur en 2 keer in xyleen gedurende 45 minuten.
    2. Permeaat de weefsels paraffine 3 maal 1 uur elk in een vacuüm met aangebrachte druk.
  5. Insluiten de weefsels in paraffine om blokken te vormenVoor snijden.

3. Histologie en Blockface Imaging

  1. Trim de paraffine blokken met behulp van een rotatiemicrotoom totdat de overmaat paraffine wordt verwijderd.
  2. Gebruik een verticale freesmachine 1 mm gaten in ten minste twee hoeken van het paraffine blok loodrecht op de cassette.
  3. Monteer het weefsel blok op de rotatiemicrotoom.
  4. Stel het blockface imaging systeem 19 in de voorkant van het microtoom.
  5. Image optische blockface vangen voorafgaand aan het snijden.
  6. Snijd linten uit vier secties 5 micrometer dikte op de microtoom.
    1. Breng de linten om het koud waterbad.
    2. Scheid de tweede en vierde gedeelten van de lint en mount prepareren. Het kiezen van de tweede en vierde secties verschaft een 5 um tussen secties.
    3. Vouw elke sectie in een warm waterbad (48 ° C) om het unwrinkle, vervolgens opnieuw monteren op de microscoop dia.
      OPMERKING: CUtting, montage, unwrinkling de secties leiden tot een aantal verstoringen op de sectie, zoals scheuren, vouwen, krimp en uitzetting. Deze artefacten compliceren de registratie van de histologie secties.
    4. Vlekken op de secties met H & E met behulp van een automatische stainer.
    5. Dekglaasje de dia's met behulp van een automatische afdekautomaat.
    6. Digitaliseren van de dia's met behulp van een digitale histologie dia scanner op de resolutie van belang. Voor dit protocol de vergroting is 20x en de resolutie is 0,47 micrometer.
    7. Down-proeven van de histologie beelden naar de resolutie van blockface beelden, 18 micrometer.

4. Beeldregistratie

  1. Afbeelding Segmentatie en punt Selection
    1. In blockface beelden meet de pixelwaarden van de registratiegaten en gebruik de gemiddelde waarde vaste drempel segment registratie gaten in de hoeken van het paraffineblok.
    2. Sinds een aantal extra onderdelen kunnen ook worden gesegmenteerd doorhet gebruik van de vaste drempel, gebruik maken van de rondheid en het gebied van de gesegmenteerde objecten om de gaten te vinden en de extra objecten verwijderen. Om dit te doen, schrijf een kleine code en vind de verhouding van (4π x gebied) / (perimeter) 2 voor de gesegmenteerde objecten. Deze ratio voor ronde voorwerpen 1.
    3. Voor elke borstklier, selecteert u een blockface beeld als referentie en lijn de rest van de blockface afbeeldingen om de verwijzing door het centrum van de registratie gaten en-mijlpaal registratie op basis van technieken.
    4. Voor de uitgelijnde blockface afbeeldingen handmatig segment of extraheren weefsel van de achtergrond. Gebruik de meest omvangrijke object in het masker voor de rest van het protocol.
    5. Voor H & E secties Volg de onderstaande stappen voor de automatische segmentatie.
      1. Gebruik Otsu thresholding techniek 20 tot segment beelden van de achtergrond en maak binaire maskers van de histologie afbeeldingen.
      2. Identificeren en selecteren van de meest omvangrijke object in elk masker met behulp van de histogram van de gelabelde objecten.
      3. Pak het een pixel breed grenspunten van zowel histologie en blockface maskers.
      4. Gebruik Chain code algoritme 21, aan de grens punten vertegenwoordigen door een opeenvolging van stuksgewijze lineaire past.
  2. Initial rigide registratie
    1. Gebruik Fourier Descriptoren algoritme 22, op zoek naar de eerste starre transformeren tussen de grenspunten van de histologie en de bijbehorende blockface beelden. Deze eerste transformatie omvat de translatie, rotatie en schaal factoren.
    2. Transformeer elk beeld histologie met de eerste transformatie verkregen uit de vorige stap.
  3. Verfijning van de rigide registratie
    1. Verwijder de hoge kromming randprofielen van de histologie contour met een rollende bal filter 23.
    2. Selecteer 500 punten uit de resterende histologie grenspunten willekeurig op basis van uniforme verdeling.
    3. Transformeer de dehistologie willekeurige grens punten met de eerste transformatie verkregen van Fourier descriptors.
    4. Selecteer de hele set van blockface grenspunten en gebruiken iteratieve Dichtstbijzijnde Points (ICP) algoritme 24 de starre transformatie tussen de blockface grenspunten, bestemming, en histologie willekeurige punten grens te vinden.
    5. Transformeer de uitgelijnde histologische beelden verkregen uit de vorige stap en de stapel uitgelijnd histologie beelden creëert histologie volume.
    6. Gebruik een 3D-visualisatie software om een ​​visueel beeld van de histologie volume te creëren.
  4. Het bekijken van de Stapel Beelden op 5x vergroting
    1. Down-proeven van de originele histologie beelden naar vergroting 5x.
    2. Snijd de regio van belang in een van de histologie afbeeldingen.
    3. Bereken de locatie van dat gebied in andere 5x histologie beelden met de combinatie van de starre transformaties van de twee niet van registratie.
    4. Snijd de regions van belang dezelfde grootte regio alle andere histologie afbeeldingen.
    5. Eindelijk verfijnen van de afstemming tussen de regio's handmatig. Schrijf een programma dat twee beelden overlapt en zorgt voor het selecteren van waarden voor rotatie en translatie van een van de beelden over het andere en slaat het getransformeerde beeld wanneer de uitlijning wordt aanvaard.
    6. Bekijk de stapels van de uitgelijnde 5x histologie regio's met behulp van een 3D-visualisatie software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een valkuil traditionele microscopische technieken is dat het begrip van een orgaan op microscopisch niveau is beperkt tot een gebied-van-aanzicht tegelijk. Zelfs "volledige openbaarmaking" dia's, die volledige dia secties bieden, niet om driedimensionale informatie te verstrekken. Met de ontwikkeling van het objectglaasje, dynamische scantechnologieën ons vermogen om een ​​gedeelte zien in zijn geheel is toegenomen, maar extrapolatie structuren vereist 3D histologie volume reconstructie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie hebben we een beeld registratie workflow om een ​​3D histologie volume reconstrueren van seriële 2D histologie beelden, die intern willekeurig geselecteerde monumenten of geïmplanteerde ijkmarkeringen binnen het weefsel, dat het weefsel kan vervalsen niet vereist ontwikkeld. Door de beschreven methode worden optische blockface beelden zelf als referentie beelden voorafgaand aan het snijden. Wij maken gebruik van externe gaten geboord in het paraffine blok om te helpen bij het uitlijnen van de blockface af...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

De auteurs willen het Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) bij het Sunnybrook Research Institute bedanken voor hun histologiediensten. De steun voor dit werk werd geboden door de Terry Fox Foundation, de Canadian Breast Cancer Foundation‐de Prairie‐NWT evenals een CIHR-subsidie, #MOP-97996.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16% PFAVWR International1571016% Paraformaldehyde-oplossing
Kleine weefselverwerkingscassettesVWR InternationalCA95029-956
Leica ASP300 geautomatiseerde weefselprocessorLeica14047643515
100% EthanolFisher ScientificS25307B
XYleenVWR International CA95057-822
Paraffine Thermo Fisher39501006Paraplast weefselinbeddingsmedium
Leica EG 1160 inbeddingscentrumLeica
Leica roterende microtoomLeica
SlijpmachineArgo
MicroscoopglazenVWR International CA48312-015
H&E kleurstofVWR International
Automatische kleurinrichting
Dekvlakken VWR International 48404-452
MEDITE RCM 7000 glazen dekvlakbevestigerMEDITE
Leica SCN400 diascannerLeica
MATLABMathWorks IncMATLAB 2007bOntwikkelingssoftware
MeVisLabMeVis Medical Solutions AGMeVisLab 2.13D visualisatiesoftware

Referenties

  1. Sunkin, S. M., et al. Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system. Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).
  2. Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. The Allen Human Brain Atlas: Comprehensive gene expression mapping of the human brain. Trends in Neurosciences. 35 (12), 711-714 (2012).
  3. Trifunović, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (6), 2330-2336 (2008).
  4. Evdokimova, V., et al. IGFBP7 binds to the IGF-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors. Science Signaling. 5 (255), 92(2012).
  5. Burger, A., Leyland-Jones, B., Banerjee, K., Spyropoulos, D., Seth, A. Essential roles for IGFBP-3 and IGFBP-rP1 in breast cancer. European J. Cancer. 41 (11), 1515-1527 (2005).
  6. Amemiya, Y., et al. Insulin like growth factor binding protein-7 reduces growth of human breast cancer cells and xenografted tumors. Breast Cancer Res Treat. 126 (2), 373-384 (2011).
  7. Benatar, T., et al. IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathways. Breast Cancer Res Treat. 133 (2), 563-573 (2012).
  8. Bardinet, E., et al. Co-registration of histological, optical and MR data of the human brain. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention-Part I. , Springer-Verlag. London, UK. 548-555 (2002).
  9. Jacobs, M. A., Windham, J. P., Soltanian-Zadeh, H., Peck, D. J., Knight, R. A. Registration and warping of magnetic resonance images to histological sections. Medical Physics. 26 (8), 1568-1578 (1999).
  10. Zhan, Y., Ou, Y., Feldman, M., Tomaszeweski, J., Davatzikos, C., Shen, D. Registering histologic and MR images of prostate for image-based cancer detection. Academic radiology. 14 (11), 1367-1381 (2007).
  11. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in vivo MRI for whole baboon brain. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  12. Lazebnik, R. S., Lancaster, T. L., Breen, M. S., Lewin, J. S., Wilson, D. L. Volume registration using needle paths and point landmarks for evaluation of interventional MRI treatments. IEEE Transactions on Medical Imaging. 22 (5), 653-660 (2003).
  13. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Annals of Biomedical Engineering. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  14. Mori, H., Borowsky, A. D., Bhat, R., Ghajar, C. M., Seiki, M., Bissell, M. J. The American Journal of Pathology. 180 (6), 2249-2256 (2012).
  15. Gibb, M., et al. Resolving the three-dimensional histology of the heart. Computational Methods in Systems Biology. Gilbert, D., Heiner, M. , 2-16 Springer-Verlag. London, UK. 2-16 (2012).
  16. Wu, M. L., et al. Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 129 (4), 507-510 (2005).
  17. Arganda-Carreras, I., et al. 3D Reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microscopy Research and Technique. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  18. Song, Y., Treanor, D., Bulpitt, A. J., Magee, D. R. 3D reconstruction of multiple stained histology images. Journal of Pathology Informatics. 4 (2), 7(2013).
  19. Shojaii, R., Karavardanyan, T., Yaffe, M., Martel, A. L. Validation of histology image registration. SPIE Medical Imaging. 7962, 79621E, doi:10.1117/12.878762. 7962 (7962E), (2011).
  20. Ridler, T. W., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
  21. Freeman, H. Computer processing of line-drawing images. ACM Computing Surveys (CSUR. 6 (1), 57-97 (1974).
  22. Giardina, C. Accuracy of curve approximation by harmonically related vectors with elliptical loci). Computer Graphics and Image Processing. 6 (3), 277-285 (1977).
  23. Shojaii, R., Martel, A. L. A novel edge point selection method for registration of histology images. Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy. (OPTIMHisE) Workshop, MICCAI. , (2009).
  24. Besl, P., McKay, N. A method for registration of 3-D shapes. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 14 (2), 239-256 (1992).
  25. Chatterjee, S., et al. Loss of Igfbp7 causes precocious involution in lactating mouse mammary gland. PLoS ONE. 9 (2), e87858(2013).
  26. Manjunath, B. S., Chellappa, R. Unsupervised texture segmentation using Markov random field models. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 13 (5), 478-482 (1991).
  27. Krishnamachari, S., Chellappa, R. Multiresolution Gauss-Markov random field models for texture segmentation. IEEE Transactions on Image Processing: a publication of the IEEE Signal Processing Society. 6 (2), 251-267 (1997).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D histologische volumereconstructiebeeldregistratiebenaderingoptische blockface beeldenhematoxyline en eosinekleuringuitlijning met aangepaste softwareFourier descriptoren algoritmeIterative Closest Points3D visualisatiesoftwarevolumetrische medische beeldvorming

Gerelateerde artikelen