Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Samenvatting

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Samenvatting

Veel eiwitten interageren tijdelijk met andere eiwitten of geïntegreerd in multi-eiwitcomplexen hun biologische functie. Bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) is een in vivo methode om dergelijke interacties in plantencellen te monitoren. In de gepresenteerde protocol de onderzochte kandidaat eiwitten worden gefuseerd aan complementaire helften van fluorescerende eiwitten en de respectievelijke constructen worden geïntroduceerd in planten cellen via door Agrobacterium gemedieerde transformatie. Vervolgens worden de proteïnen tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren en herstelde fluorescente signalen worden gedetecteerd met een confocale laser scanning microscoop in intacte cellen. Dit maakt niet alleen visualisatie van de interactie zelf, maar ook de subcellulaire lokalisatie van het eiwit complexen kan worden bepaald. Hiertoe kan merkergenen die een fluorescerend label worden tezamen tot expressie gebracht met de BiFC constructen, waardoor cellulaire structuren zoals t visualiserenhij endoplasmatisch reticulum, mitochondriën, het Golgi-apparaat of de plasmamembraan. De fluorescerende signaal kan worden bewaakt direct epidermale bladcellen of enkele protoplasten, die gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd uit de getransformeerde tabaksbladeren. BiFC is bij uitstek geschikt om eiwit-eiwit interacties te bestuderen in hun natuurlijke omgeving in de levende cel. Er moet echter worden aangenomen dat de expressie moet worden door sterke promoters en de interactiepartners gemodificeerd door fusie van de relatief grote fluorescentie labels, die kunnen interfereren met de interactie mechanisme. Niettemin BiFC een uitstekende complementaire aanpak van andere algemeen toegepaste methoden onderzoeken eiwit-eiwit interacties, zoals co-immunoprecipitatie, in vitro pull-down tests of gist-twee-hybride experimenten.

Inleiding

Het bestuderen van de vorming van eiwitcomplexen en hun lokalisatie in plantencellen in vivo is essentieel voor cellulaire netwerken onderzoeken, signalering en metabole processen. BiFC maakt visualisatie van eiwit-eiwit interacties in hun natuurlijke milieu zijn in het levende plantencel ^1-5.

In de BiFC benadering de complementatie van twee niet-fluorescerende N-en C-terminale fragmenten van een fluorescerend eiwit leiden tot een opnieuw fluorescerend eiwit. Fragmenten van verschillende fluorescerende eiwitten zijn gebruikt om eiwit interacties te detecteren, bijvoorbeeld het groen fluorescent eiwit (GFP) de chromofoor waarvan chemisch gevormd door drie verschillende resten ^6. Fluorescente eiwitten kunnen worden gehalveerd binnen een lus of ß-streng leiden tot twee niet-fluorescerende fragmenten die kunnen worden gefuseerd aan twee eiwitten van belang. De test kan worden gebruikt om interacties te detecteren in elk subcellulaire compartimnt in elk aëroob kweken organisme of cellen die genetisch kunnen worden gemodificeerd om de fusie-eiwitten tot expressie. Als de twee eiwitten zijn in dichte nabijheid in de cel, wordt fluorescentie gereconstitueerd en kan worden gecontroleerd door microscopisch zonder toevoeging van exogeen fluoroforen of kleurstoffen ^3.

Tabak (Nicotiana benthamiana) heeft bewezen een geschikte modelorganisme de interactie van eiwithoudende visualiseren, aangezien vormen gemakkelijk door gebruik Agrobacterium-gemedieerde transformatie van tabaksbladeren met de gegenereerde constructen kan worden uitgedrukt. Agrobacterium gebruik een zogenaamde Ti-plasmide (tumor-inducerende) coderen voor enzymen die de transductie van het gen van interesse in plantencellen mediëren. BiFC is goed toepasbaar voor oplosbare en voor membraaneiwitten in cellulaire compartimenten en is met succes gebruikt in de afgelopen jaren identificeren interagerende eiwitten in vivo alsook interactieplaatsen analyserenbinnen de eiwitten ^7-9. Bij expressie van de ingebrachte genen, kan de interactie van de fluorescerende eiwitten direct worden gevisualiseerd in bladeren, die geschikt is voor grotere cellulaire structuren, zoals het endoplasmatisch reticulum (ER), de plasmamembraan of chloroplasten. Echter, de lokalisatie in meer verfijnde structuren controleren, bijvoorbeeld de chloroplast envelop, is het raadzaam om de fluorescentie te visualiseren in protoplasten geïsoleerd uit getransformeerde tabaksbladeren. Een reeks BiFC vectoren die ofwel een C-terminal of N-terminale fluorescente label moet worden gebruikt voor de BiFC benadering in planten ^10. Het hieronder beschreven protocol werd gebruikt om de interactie van cytosolisch heat shock eiwit 90 (HSP90) bestuderen de tetratricopeptide repeat (TPR) domein bevattende eiwitten docking Toc64 en AtTPR7 die in de chloroplast buitenomhulling en het endoplasmatisch reticulum, respectievelijk ^11-13. Hiertoe werd HSP90 gefuseerd aan de Cterminal deel van SCFP (SCFP ^C). Het label werd N-terminaal gefuseerd aan de chaperon toegankelijkheid van de C-eindstandige MEEVD bindende motief van HSP90 TPR domeinen type klemmen garanderen. Tegelijkertijd werd het N-terminale deel van Venus (Venus ^N) gefuseerd aan het cytosolische domein van het TPR-domein bevattende eiwitten docking Toc64 en AtTPR7 respectievelijk. Als negatieve controle wij gekloneerd de oplosbare C-terminale deel van SCFP ^C uitsluitend is onderdeel van het cytosol en daarom een geschikte controle.

De fluorescerende tags van de onderzochte eiwitten aan dezelfde cellulaire compartiment oog in nabijheid en daardoor reconstitutie van het fluorescentiesignaal mogelijk. Om de lokalisatie van de gereconstitueerde fluorescentiesignaal markerproteïne gefuseerd aan een ander fluorescerend label kan worden gecotransformeerd de subcellulaire lokalisatie van de interactie demonstreren bepalen. Een ER marker eiwit gefuseerd mCherrry werd gelijktijdig getransformeerd in deBij het ​​ER gelegen AtTPR7 ^14. De autofluorescentie van chlorofyl diende als chloroplast marker in het geval van Toc64. Door dit niet alleen de in vivo interactie van Toc64 en AtTPR7 respectievelijk de cytosolische HSP90 chaperon kan direct worden gecontroleerd in tabaksbladeren maar ook de subcellulaire lokalisatie van de interactie kan worden onderzocht.

BiFC is goed geschikt als aanvullende benadering van andere methoden bestuderen van eiwit-eiwit interacties. Vergeleken met co-immunoprecipitatie of in vitro pull-down experimenten, bijvoorbeeld, geen specifieke antilichamen beschikbaar zijn voor de eiwitten van belang, en de eiwitten niet te recombinant worden uitgedrukt in vitro, die lastig zijn, vooral voor membraaneiwitten. Bovendien ook voorbijgaande interacties worden gevolgd met BiFC, aangezien de eiwitten weergegeven door de interactie van de gefuseerde fluorescente markeringen ^15.

Protocol

1. Transformatie van BiFC constructen Agrobacteria

1. Klonen van BiFC constructen
   1. Versterken het gen van belang uit een geschikt sjabloon gebruiken oligonucleotiden die flankerende attB-sites. Voer een PCR met behulp van een corrigerend polymerase. Pas de lengte van de uitgloeistap de ontworpen primer combinatie en de lengte van het rek stap volgens de fragmentgrootte. Controleer het PCR-product door agarosegelelektroforese en zuiveren met behulp van een PCR Clean-up Kit.
   2. Voer de BP reactie met het verkregen fragment en de invoer vector met behulp van een BP recombinase. Meng 15-150 ng de attB-PCR product met 150 ng de vermelding vector, voeg 2 pl van de BP recombinase en vul met TE buffer tot een totaal volume van 8 pl. Incubeer het reactiemengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en stop de reactie door toevoeging van 2 ul proteïnase K gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
   3. Transformeer de gehele reactie in competente E. coli DH5a, Cellen en screenen van de verkregen kolonies door kolonie PCR voor correcte insertie van het DNA fragment in de vector. DNA-sequentiebepaling van positieve plasmiden wordt uitgevoerd om de afwezigheid van mutaties te verifiëren.
   4. Gebruik de verkregen toegang kloon voor LR recombinatie met de juiste bestemming vector met behulp van een LR recombinase. Meng 50-150 ng vector met de ingang 150 ng de bestemming vector, voeg 1 pl LR recombinase en vul met TE buffer tot een totaal volume van 5 pl. Incubeer het reactiemengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en stop de reactie door toevoeging van 1 ul proteïnase K gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
   5. Transformeer de gehele reactie in competente E. coli DH5a cellen en scherm kolonies verkregen door kolonie PCR voor correcte insertie van het DNA fragment in de vector. DNA sequencing is niet nodig deze stap.
   6. Isoleer plasmide-DNA met een plasmide Mini kit een hoge zuiverheidsgraad te waarborgen.
2. Bereiding van chemisch competente Agrobacterium (stam AGL1, Rifampicine en Carbenicilline weerstand)
   1. Streak uit agrobacteriën uit een voorraad cultuur en groeien gedurende 24 uur bij 28 ° C.
   2. Inoculeer 5 ml LB medium met een enkele kolonie en incubeer overnacht bij 28 ° C.
   3. Inoculeer 50 ml LB-medium met 2 ml van de overnacht cultuur en kweken gedurende ongeveer 4 uur bij 28 ° C tot een OD ₆₀₀ van 1,0.
   4. Centrifugeer de cellen bij 3000 g gedurende 15 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellet in 1 ml gesteriliseerd ijskoude _CaCl2 (10 mM). Houd cellen op ijs na deze stap.
   5. Aliquots (100 ul) van de cellen onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C vriezer
3. Transformatie van chemisch competente Agrobacteria
   1. Ontdooi een portie van competente AGL1 cellen op ijs. Voeg 1-2 ug plasmide-DNA aan de cellen. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs, 5 min. in vloeibare stikstof en 5 min bij 37 ° C. Voeg 600 pi LB-medium aan de cellen en shake bij 650 rpm gedurende 4 uur bij 28 ° C.
   2. Centrifugeer de cellen gedurende 1 min bij 8.000 xg en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de pellet in 50 ul van de resterende LB-medium en plaat op LB-platen met de juiste antibiotica. Dicht de platen en incubeer gedurende 2 dagen bij 28 ° C. Scherm kolonies op de aanwezigheid van het plasmide door kolonie PCR.
   3. Inoculeer een positieve kolonie in 5 ml LB-medium met de juiste antibiotica en incubeer bij 28 ° C overnacht. Meng 500 pl van de kweek van een nacht met 500 pi 50% glycerol gesteriliseerd en bevriezen bij -80 ° C.
   4. Inoculeren de agrobacteriën in LB-medium direct met de juiste antibiotica uit de glycerol voorraad voor transiënte transformatie van tabaksbladeren.

2. Voorbijgaande Transformatie van Tabaksbladeren

1. Agrobacteriën groei
   1. Bereid de volgende voorraad oplossingen: acetosyringone (150 mm, los op in 70% EtOH), opslaan als fracties bij -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, bewaren bij 4 ° C (steriele filter door een 0,2 um filter om bacteriële groei tijdens langere opslag te voorkomen), _MgCl2 (1 M) voorraad, bewaren bij kamertemperatuur.
   2. Inoculeer 10 ml LB-medium met de juiste antibiotica met 50 ul van de AGL1 glycerol stock kweek die het plasmide van belang in een steriele 50 ml buis en incubeer bij 28 ° C gedurende ten minste 24 uur schudden bij 190 rpm tot een _OD600 van 1,0 -2,0 bereikt.
   3. Centrifugeer kiemen bij 3000 xg gedurende 15 minuten. Resuspendeer de pellet in vers gemaakte infiltratie medium _[MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, acetosyringone (150 uM)] en pas de schorsing van een OD ₆₀₀ van 1,0.
   4. Incubeer de agrobacteriën cellen in een overhead-schudder gedurende 2 uur in het donker. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor infiltratie.
2. Infiltratie van tabaksbladeren
   1. Gebruik drieweken oude tabak (Nicotiana benthamiana) planten. Kies een aantal oudere bladeren voor infiltratie.
   2. Meng gelijke volumes van de agrobacteriën die de constructen plaats (elk 3 ml). Neem een ​​spuit 5 ml zonder naald voor infiltratie. Infiltreren in de celsuspensie voorzichtig in de tabaksbladeren door op de spuit op de onderzijde van de bladeren in verschillende plaatsen.
   3. De planten water en laat ze in de duisternis voor twee dagen.

3. Protoplastpreparaat

Protoplastpreparaat tabaksbladeren werd aangepast van Koop et al.. ¹⁶ en enigszins gewijzigd.

1. Buffer voorbereiding
   1. Bereid F-PCN medium: Macro-zouten _[KNO3 (1012 ug / ml), _CaCl2 • 2H ₂ O (440 ug / ml), _MgSO4 • 7H ₂ O (370 ug / ml), KH _{2PO 4} ( 170 ug / ml), _{NH4-succinaat} [(20 mM, bereidt een 2 M stock solution (succinaat (236 ug / ml) en _NH4CI (106 ug / ml) op pH 5,8 te lossen)], micro-zouten [EDTA-Fe (III) x Na-zout (40 ug / ml), KJ (0,75 ug / ml), H ₃ BO ₃ (3 ug / ml), MnSO ₄ • _H2O (10 ug / ml), ZnSO ₄ • 7H ₂ O (2 ug / ml), Na ₂ MoO ₄ • 7H ₂ O (0,25 ug / ml), CuSO ₄ • 5H ₂ O (0,025 ug / ml), _CoCl2 • 6H ₂ O (0,025 ug / ml)], MES (390 ug / ml), glucose (ongeveer 80 ug / ml) osmolariteit 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Bewaren in aliquots bij -20 ° C.
   2. Bereid F-PIN medium: Alle ingrediënten F-PCN maar in plaats van sucrose glucose gebruik (ongeveer 110 ug / ml), osmolariteit 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Bewaren in aliquots bij -20 ° C.
   3. Bereid W5 medium: 150 mM NaCl, 125 mM _CaCl2, 5 mM KCl, 2 mM MES, osmolariteit 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Bewaren bij 4 °; C (steriele filter door een 0,2 um filter om bacteriële groei tijdens langere opslag te voorkomen).
   4. Bereid verse enzym oplossing voor protoplastisolatie (0,1 g cellulase, 0,03 g macerozym in 10 ml F-PIN). Incubeer de oplossing bij 55 ° C gedurende 10 minuten en koel af tot kamertemperatuur. Voeg 100 ui 10% BSA tot 10 ml oplossing.
2. Isolatie van protoplasten
   1. Plaats een geïnfiltreerd blad in een petrischaal en voeg de verse enzymoplossing. Gebruik een nieuw scheermesje om het blad in ongeveer 0,5 cm ² middelgrote stukken gesneden. Breng de blad-stukken met het enzym oplossing in een vacuüm-infiltratie kolf en vacuüm infiltreren gedurende ongeveer 20 seconden totdat er luchtbellen uit de bladeren (versie vacuüm heel voorzichtig).
   2. Schud de kolf gedurende 90 min bij 40 tpm in het donker.
   3. Laat protoplasten door gedurende 1 min bij 90 rpm. Filtreer de oplossing door gaas (100 uM) in een 15 ml centrifugebuis (ronde bodem).
   4. Overlay de protoplast oplossing 2 ml F-PCN buffer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 70 xg (langzame versnelling en vertraging) bij KT.
   5. Intacte protoplasten ophopen op het grensvlak van enzymoplossing en F-PCN. Neem een ​​brede opening 1 ml pipet tip om de intacte protoplasten te zetten in een nieuwe centrifugebuis en vul met W5 buffer. Centrifugeer gedurende 2 min bij 100 xg (langzame versnelling en vertraging) aan de protoplasten pellet.
   6. Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet en resuspendeer pellet in ongeveer 200 pi buffer W5, afhankelijk van de hoeveelheid protoplasten.
   7. Gebruik altijd brede opening tips om scheuren van intacte protoplasten voorkomen.

4. Laser scanning microscopie

1. Voorbereiding van het monster
   1. Plak twee kleine strookjes kit rond een objectglaasje (2 cm uit elkaar). Breng 20 ul van de protoplast oplossing tussen de strips en zorgvuldig plaats een afdekglasbovenop. De afdichting strips ervoor zorgen dat de protoplasten niet worden geplet met het dekglas.
   2. Voor totale bladmonsters snijd een 1 cm stuk van het blad en plaats het op een objectglaasje met de onderzijde van het blad naar boven. Voeg ongeveer 30 ul H ₂ O, leg een deksel glas aan de bovenkant en zet het vast goed af met plakband aan beide zijden.
2. Confocale beeldvorming en microscoop instellingen
   1. Imaging wordt uitgevoerd met een confocale laser scanning microscoop van Leica, Type: TCS SP5. Voor vergroting gebruik van een objectief (HCX PL APO CS) met een kracht van 63X met glycerol als beeldvorming medium. Stel de numerieke opening tot 1,3. Gebruik de Leica Application Suite / Geavanceerde Fluorescentie software voor evaluatie (zie Aanvullende gegevens S1).
   2. Stel de Argon laser 30% en het laservermogen bij 488 nm met een intensiteit van 18% aan het gereconstitueerde BiFC af te luisteren bij 515 nm en zet een PMT-detector emissie bandbreedte 495-550.
   3. Om chlorofyl autofluorescentie bewaken stel een tweede PMT detector emissie bandbreedte 650-705.
   4. Voor het bewaken mCherry signaal gebruiken de HeNe 561 laser, stelt u de intensiteit van de laser 561-18% en de emissie bandbreedte van een derde PMT detector 587-610.
   5. Zorg ervoor dat de foto's van alle PMT-detector kanalen worden genomen met dezelfde gain instellingen (gain moet tussen 800-900 achtergrondinformatie signalen uit te sluiten).
   6. Foto's nemen in een formaat breedte / hoogte van 1024 x 1024 pixels met een scansnelheid van 100 Hz.
   7. Voor Z-stapelingen gebruikt een maximale afstand van 0,5 urn tussen elke stapel.

Resultaten

In dit voorbeeld hebben we het BiFC methode om de interactie van de cytosolische moleculaire chaperon HSP90 met membraan docking eiwitten AtTPR7 en Toc64 controleren. AtTPR7 is onderdeel van de Sec translocon en de wisselwerking met cytosolische chaperones, die eventueel leveren uitscheiding preproteins voor post-translationele translocatie naar het ER membraan. Ook Toc64 bij de chloroplast buitenste omhulling handelt in post-translationele import door het ontvangen van HSP90 geassocieerd chloroplast preproteins. Beide ...

Discussie

Bij het plannen van een BiFC experiment een aantal punten moet worden beschouwd. Hoewel geen structurele informaties eiwitten van belang vereist, de topologie bekend bij het werken met membraan-overspannende eiwitten. De fluorescerende eiwitten moeten zich in dezelfde subcellulair compartiment of staan ​​voor dezelfde zijde van een membraan interactie mogelijk. Natuurlijk, bij het analyseren eiwitten die een N-terminale targeting sequentie nodig, maar alleen een C-terminaal tag kan worden beschouwd. Omdat het mogelijk i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetofenon	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringon
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	van Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	van Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzym Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzym Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel en PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-klonen
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-klonen
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-klonen