Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts

Samenvatting

We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.

Samenvatting

Testen het lot van embryonale of pluripotente stamcel-derivaten in vitro protocollen tot controversiële resultaten die niet noodzakelijkerwijs hun in vivo potentie weerspiegelen. Bij voorkeur moet deze cellen in een geschikte embryonale omgeving geplaatst teneinde de definitieve fenotype te verkrijgen. Bovendien heeft cell lineage tracing studies in de muis na het labelen van cellen met kleurstoffen of retrovirale vectoren meestal beperkt tot vroeg stadium muizenembryo's met nog slecht ontwikkelde organen gebleven. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we standaard en ultrasoon gemedieerde micro-injectie protocollen aan verschillende agenten te injecteren in gerichte gebieden van het hart in muizenembryo's op E9.5 en latere stadia van ontwikkeling. Embryonale explant of embryo's worden vervolgens gekweekt of links om verder te ontwikkelen in de baarmoeder. Deze middelen omvatten fluorescerende kleurstoffen, virus, shRNAs of stamcel-afgeleide stamcellen. Onze aanpak kan voor het behoud van de functies van het orgel terwijl het toezicht op de migratie en het lot van gelabelde en / of geïnjecteerde cellen. Deze technologieën kunnen worden uitgebreid naar andere organen en zal zeer nuttig zijn om de belangrijkste biologische vragen te beantwoorden in de biologie van ontwikkeling.

Inleiding

Meer dan een decennium geleden, hebben menselijke embryonale stamcellen (HuESCs) is afgeleid van menselijk blastocysts ^1. Sindsdien hebben deze cellen het onderwerp van een belangrijk gebied van onderzoek dat onvervulde vragen in ontwikkelingsbiologie mens behandelt te worden. HuESCs zijn verder voorzien van hoop in de regeneratieve geneeskunde. De laatste jaren zijn menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) gegenereerd van patiënt-specifieke somatische cellen, die modellen van genetische ziekte ^2. Vele in vitro protocollen voor differentiatie van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen naar verschillende cellijnen, waaronder hart-lijnen ^3, zijn gemeld. De gedifferentieerde cellen worden vaak fenotype door analyse van RNA en eiwit expressie, immunokleuring en / of in vitro functionele testen. Echter, pluripotente stamcellen derivaten in een embryonale juiste omgeving worden geplaatst om te testen of ze de cel volledig verwervenl lot van hun embryonale tegenhanger en of ze recapituleren de echte in vivo functie in reactie op de regionale cues. Terwijl de tissue engineering is veelbelovend, maar nog niet voorzien van alle bekende en onbekende signalen van de echte in vivo ontwikkeling van embryonaal weefsel ^4,5.

Cel labeling met kleurstoffen of retrovirale vectoren in embryo, waaronder muizenembryo's hebben belangrijke informatie gebracht over de embryonale oorsprong van cellijnen gedurende cardiale ontwikkeling ^6. Bijvoorbeeld, kleurstof injectie in de pericardiale ruimte van muizenembryo's ex vivo, gevolgd door in vitro kweek van geïsoleerde harten, gebruikt om epicardiale cellen en hun nakomelingen ⁷ etiketteren. Echter, kleurstof en retrovirale cel etikettering zijn meestal toegepast op vroege muizenembryo's met nog slecht ontwikkelde organen, of kip embryo's, die beter bereikbaar ⁸ zijn. Een uitzondering is de hersenen, die gemakkelijker te richten in embryos ^9,10. Een dergelijke aanpak is nog niet toegepast op het kloppend embryonale muis hart.

Om direct merken vullen met kleurstoffen of virus en lineage tracing in verder gevorderd stadium muizenembryo's en volwassen muizen uit te voeren, heeft de cel etikettering aanpak gecombineerd met de analyse van transgene muizen met behulp van het Cre / Lox technologie. De Cre / Lox benadering ¹¹ heeft echter een aantal beperkingen in verband met de spatiotemporal specificiteit van de genomische regulatoire gebieden die de expressie van het recombinase drijven, en de efficiëntie van het Cre / Lox recombinatie ^12. Bovendien is deze aanpak niet volledig in op de specifieke vragen van de cel-migratie gedreven overname van cel lot als het slechts een voorloper kan labelen na activering van de regulerende gebied gebruikt om Cre expressie rijden. Het kan ook niet van toepassing op menselijke embryo's voor de hand liggende ethische kwesties.

Gezien deze beperkingen we een reeks nieuwe p ontworpenrotocols van verschillende cel merkmiddelen, zoals fluorescerende kleurstoffen, virus, genexpressie modulatoren zoals shRNAs en DNA-gebaseerde mobiele etikettering vectoren of cellen in het muizenembryo op E9.5 en latere ontwikkelingsstadia injecteren in gerichte gebieden van de hart.

Het DNA / cel injecties een stereomicroscoop en een eenvoudige micro-injectie toestel gecombineerd met ex vivo embryo cultuur tot 48 uur, of geïsoleerde hart of embryonale explantaatkweek voor 48-72 uur. We een ultrasoon gemedieerde micro-injectie protocol in muis embryonale harten in de baarmoeder ook verslag. Deze techniek maakt het toezicht op de ontwikkeling van embryo's ¹³ en zorgt voor lange termijn follow-up van de injectates en / of gelabelde cellen.

We vonden dat deze benaderingen behouden de functie van het orgaan en een meer representatieve omgeving dan in vitro testen stamcellen potentieel. Het biedt ook de mogelijkheid om migratie te volgengelabelde en / of geïnjecteerde cellen aan hun lot controleren. Uiteindelijk zou dit een beter begrip van regionale weefsel patronen en belangrijke biologische processen leveren.

Protocol

1. Bereiding

Animal procedures

Verkrijgen goedkeuring van een dier ethische commissie en volg institutionele richtlijnen voor het werk met het virus, huESC en / of IPSC (indien van toepassing), evenals muis hanteren, het verkrijgen van muizenembryo's, en het uitvoeren van de muis chirurgie. Voor getimede paringen, wordt de dag van de plug als embryonale dag (E) 0,5 / 0,5 dagen na de coïtus.

1. Micro-injectie naalden:
   Voor ex utero micro-injectie, trek glazen pipetten (1,2 mm buitendiameter borosilicaat capillaire buizen) met een pipet trekker / beveller een 1 of 10 micrometer interne tip diameter en een scherpe en conische tip shape om DNA of cellen te injecteren, respectievelijk te krijgen. Voor ultrasoon gemedieerde injecties, gebruik aangepaste steriele naalden, die een buitendiameter / binnendiameter (OD / ID) van 1,14 mm/0.53 mm, met een 50/35 um OD / ID tip hebben.
2. Silicon gevulde petrischaaltjes:
   Bereid silicium als beschreven in de handleiding. Vulleneen mm diameter schoon glas 60 petrischaal met een elastomeerlaag van ~ 1 cm. Vermijd luchtbellen.
3. Instrumenten:
   Houd alle chirurgische instrumenten steriel voorafgaand aan en tijdens de procedure.
4. DNA voorbereiding:
   Voeg 3 pg DNA en 12 pi Opti-MEM in een buis. Voeg 3 ul Lipofectamine 2000 en 12 pl Opti-MEM in een andere buis. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en meng beide oplossingen. Onmiddellijk gebruiken.
5. Celpreparaat:
   Maak een suspensie van 10 ⁶ cellen / ml DMEM (Dulbecco's Eagle Medium, hoge glucose en 50% serum rat). 50 pl uiteindelijke celsuspensie voldoende voor 8-10 embryo.
6. Kleurstofpreparaat:
   Gebruik de groene fluorescerende CDCFDA-SE met 25 mg / ml DMSO. Bereid 20 pi aliquots en bewaar bij -20 ° C. Verdun 1:100 / 1:200 in steriele zoutoplossing of PBS voor gebruik.
7. Viruspreparaat:
   Gebruik een commerciële ^3e generatie PGK-GFP-expressie lentivirus met een titer van ~ 10 ⁹ -10 ¹⁰ transducing eenheden / ml DMEM. Voor de bereiding van lentivirus, zie Tiscornia et al.. ¹⁴ Persoonlijke beschermingsmiddelen dragen en veilig te gebruiken en te vervreemden van het virus.

2. Verzameling van E9.5 en E10.5 embryo's voor Ex vivo injectie

1. Euthanaseren een zwangere muis op embryonale dag 9.5 of 10.5.
2. Steriliseer de borst en de buik van de muis met 70% ethanol.
3. Voeg een ventrale middellijn incisie de buik geopend en de uterushoorn ophalen bij kamertemperatuur in PBS en overgebracht na twee wasbeurten PBS een siliconen gevulde petrischaal met M16 medium.
4. Pin de baarmoeder hoorn met insecten kunnen de siliconenlaag zodat de gevasculariseerde zijde van de baarmoeder onderaan.
5. Snijd het oppervlak van de baarmoeder met fijne pincet en een kap van de decidua 1 mm onder het oppervlak.
6. Voorzichtig ophalen van de embryo in de dooierzak door het verspreiden van de wanden van de decidua.
7. Bewaar de embryo's bij 37 °; C in M16 medium voor celinjectie. Voor injectie wordt elk embryo overgedragen aan de siliconen schaal gevuld met M16 medium voorverwarmd bij 37 ° C.

3. DNA of celinjectie Onder een Stereomicroscope

1. Vul het glas pipet uit de rug met een Hamilton spuit en schud de pipet om luchtbellen te verwijderen aan het uiteinde.
2. Zet de tube op de micro-injectie houder; stellen het bedrijf druk tot 50 (DNA) of 30 (cellen) hPa, en de inspuitdruk tot 150 (DNA) naar 300 (cellen) hPa. Stel de injectietijd 0,2 sec (DNA) of 0,5 sec (cellen). Deze instellingen kan enigszins variëren afhankelijk van het type microinjector en pipet.
3. Speld het embryo naar de siliconen onderkant door de dooierzak zonder het embryo. Bekijk de regio van het hart en de zak open net boven deze regio.
4. Voeg 4 pins rond het embryo tot een beweging tijdens cel injectie te voorkomen.
5. Met behulp van de micromanipulator (ingesteld op handmatig), slowly-positie de pipetpunt onder een hoek van 45 ° boven het hartzakje, net boven het gebied van het hart dat wordt geïnjecteerd (figuur 1).
6. Beweeg de pipet in het gebied van belang en leiden tot de injectie. Haal de pipet zo snel mogelijk. Zorg ervoor dat het hart goed kloppen na DNA / cel injectie.

4. Embryo, geïsoleerde hart, en explantaatkweek

1. Cultuur de E9.5 embryo 25% M2 medium en 75% rattenserum, aangevuld met penicilline / streptomycine, voorverwarmd bij 37 ° C en zuurstof met 40% _O2.
2. Voeg 2 ml kweekmedium in een 25 ml glazen buis, voeg zachtjes het embryo, en zuurstofhoudende verbindingen met 40% O ₂ voor vastschroeven van de dop op de tube. Incubeer tot 36 uur bij 37 ° C onder roteren of schudden (30 rotaties / min).
3. Op het gewenste tijdstip (bijvoorbeeld 24 uur), ontleden de harten zorgvuldig met fijne tang, zonder het aanraken van de harten, door eerst decapitating de embryo; het hart is makkelijk te accijns door deze uit te trekken met behulp van de distale uitstroom-darmkanaal.
4. Cultuur het geïsoleerde hart voor een ander 36-48 uur in DMEM met 50% FCS op een Matrigel-gecoate insert in een 12-well plaat. Zie Dyer & Patterson (2013) voor een verbeterde protocol van hart cultuur ^15.
5. Maak elke explant van de regio van belang. Als voorbeeld, ontleden de atrioventriculaire kanaal (AVC) en cultuur voor 48 uur op collageen type 1 gel ^16.

5. Echogeleide Injectie in het Hart I n de baarmoeder

1. Setup van ultrasound machine en microinjector:
   1. Gebruik de hoge-resolutie echografie systeem met een 40 MHz transducer en micro-injectie setup op een rail.
   2. Stel de injectie volume op de microinjector op 69 nl per injectie. Zie micro-injectie handleiding van de fabrikant voor het programmeren van de microinjector.
2. Voorbereiding van de microinjection setup en injectie:
   1. Plaats een glas micropipet in de microinjector. Om efficiënte injectie eerste laag de binnenkant van de pipet met minerale olie door afzuigen tot het maximale volume. Dan verwijder je de olie weer, waardoor 1-2 mm van olie in de naald.
   2. Zuig het injectaat totdat maximale volume is bereikt. Wees voorzichtig en laat geen oppervlakken niet aanraakt met de naald als deze de tip zal bot en maak injectie moeilijker.
   3. De baarmoeder hoorn met de embryo tijdens de injectie te stabiliseren, gebruikt een gemodificeerd petrischaal met een gat in het midden (2,5 cm diameter), bedekt met een dunne silicone membraan met een kleine spleet gesneden in het midden, en plaats het boven de incisie . Stabiliseer de petrischaal op muiswerkzaamheden tabel door het plaatsen 3-4 klompen klei onder de randen van de schaal.
3. Injectie procedure:
   1. Scheer de buik van een zwangere muis (op de gewenste embryonale stadium) voor anesthesia om haar te verwijderen. Behandel de buik met een chemische ontharing middel om de resterende haren te verwijderen en te steriliseren met 70% ethanol.
   2. Verdoven van een zwangere muis met zuurstof / isofluraan via een gezichtsmasker. Gebruik 3-5% isofluraan in 100% zuurstof initiële verdoving, gevolgd door 1-1,5% gedurende de rest van de procedure. Zorg ervoor dat de muis voldoende is verdoofd door zachtjes te knijpen haar poten en / of staart.
   3. Plaats de muis liggende op muiswerkzaamheden tabel (ingesteld verwarmen bij 37 ° C) en bedekken de ogen met smeermiddel om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
   4. Solliciteer elektrode gel op de elektroden en tape de poten aan de elektroden om de hartslag, ademfrequentie, en ECG-monitor. Plaats een rectale thermometer om de lichaamstemperatuur te controleren.
   5. Controleer eerst of de muis zwanger is van het visualiseren en het tellen van de embryo's door middel van ultrageluid is. Solliciteer ultrasound gel op de buik en de positie van de scan hoofd boven de blaas. Voor de consistentie, visualiseren de blaas eerste,en tel embryo in de linker en rechter baarmoederhoorns vanaf de positie van de blaas. Zorg ervoor dat embryonale harten normaal kloppen.
   6. Als de muis zwanger is, plaatst de petrischaal boven de toekomst incisie site met klei. Druk de schotel enigszins op de buik zodat de schotel in direct contact.
   7. Verwijder de schaal en steriliseer de buik weer. Wordt 1,5-2 cm ventrale middellijn incisie, ongeveer 0,75-1 cm boven de vagina, de buik en buikvlies openen. Voorkom schade aan inwendige organen.
   8. Exterioriseren links of rechts baarmoedertak met een pincet en trek het voorzichtig door het silicium membraan van de schotel, en het stabiliseren van de schotel op de klei weer. Voorkom uitgebreide trekken of manipulatie, aangezien dit bloeden van de baarmoeder schepen en vroegtijdige dood van de vrouwelijke en / of embryo's kunnen veroorzaken.
   9. Tel weer de embryo's om een ​​adequate registratie van die embryo's werden ingespoten garanderen.
   10. Solliciteer ultrasound gel op de uTerine hoorns op de foto om het hart en om uitdroging te voorkomen.
   11. Afbeelding eerste embryo te injecteren. Controleer normale kloppen van het embryonale hart en een register bijhouden van de craniale-caudale en links-rechts oriëntatie van het embryo. Indien nodig, de positie van de baarmoeder hoorn licht om de juiste oriëntatie te garanderen. Als dit moeilijk is, ga dan naar de volgende embryo.
   12. Prik de baarmoeder voorzichtig met de micro-injectie naald om de naald te positioneren in een hoek van 45 ° boven het embryo, iets buiten het hartzakje (figuur 3). Voor de etikettering van epicardial cellen, beeld het hart in een vier-kamer uitzicht en de positie van de naald zodat het wijst naar de atrioventriculaire groef (figuur 3). Als de hoek moet worden aangepast, trek de naald, en herpositioneren. Stel de hoek niet aanpassen met de naald in de baarmoeder, aangezien dit de naald kan breken. Te beschadigen andere weefsels, zoals ledematen of placenta.
   13. Verplaats de naaldop de pericardiale muur en prik er met een zachte, maar snelle beweging. In het algemeen zal er enige weerstand, maar beweegt de naald te snel kan de naald naar het hart zelf te prikken. De tip moet eindigen in de pericardiale ruimte van de atrioventriculaire groef. Bij pericardiale bloeden, zal bloedcellen zichtbaar als een witte sneeuw-achtig patroon zijn. Als dit het geval stopt het injecteren van de embryo en gaan naar een andere embryo.
   14. Spuit de injectaat. Injecteren maximaal 700 nl in de pericardiale ruimte te nadelig effect hebben op hart ontwikkeling te voorkomen. Toezicht houden op de juiste injectie door kleine, tijdelijke zwelling van de hartzak.
   15. Na injectie, trek de naald eruit en bevestig dat injectaat nog kan worden uitgeworpen om ervoor te zorgen dat de naald niet is verstopt door weefsel fragmenten.
   16. Verplaats de behandeling tafel op de foto en injecteer de volgende embryo. Houd het aantal geïnjecteerde embryo maximaal 3-4 (in een uterushoorn) ter voorkominguitgebreid anesthesie, zodat de controle embryo's in de baarmoeder hoorn tegenover en dat de procedure embryonale ontwikkeling niet verstoord.
   17. Na de injectie het gewenste aantal embryo, overtollig echogel en plaats voorzichtig de baarmoeder hoorn terug in de buik op de juiste plaats.
   18. Sluit de moederlijke buik met behulp van een laag van hechtdraad voor het peritoneum en buikspieren, en een tweede laag van hechtdraad voor de huid.
   19. Injecteer de muis met de eerste dosis pijnmedicatie. Met een injectie van 0.05-0.1 mg / kg buprenorfine 15 min voorafgaand aan het beëindigen van de anesthesie en drie extra injecties met 12 uur interval.
   20. Staak anesthesie en het toezicht op de muis voor adequaat herstel van de procedure. Huis zwangere muis in een individuele kooi de gewenste duur van de follow-up.

Resultaten

De injectie protocollen hierboven beschreven, kunnen cellen worden gemerkt en / of geïnjecteerd in de muis embryonale hart. Als proof of concept, zijn verschillende voorbeelden getoond waarin de injectieprotocol en ex vivo AVC explantaat, geïsoleerde hart of geheel embryokweek werden gecombineerd (Figuur 1).

Figuur 1 toont de bereiding van het embryo voor celinjectie. De E9.5 embryo wordt verwijderd uit zijn decidua met behoud van de integriteit van...

Discussie

De intra-cardiale ex vivo injectie protocollen hierboven beschreven zijn ontworpen om hartfunctie gedurende minstens 48 uur in mid-stage (E9.5-E11.5) muizenembryo's te behouden. Deze injectie aanpak kan voor ruimtelijk gerichte injectie van DNA of cellen. De weinige voorbeelden in figuren 1-3 bieden proof of concept voor de afbakening ex vivo en in vivo moleculaire mechanismen van ontwikkelingsprocessen die plaatsvinden in beperkte cardiale regio's, zoals EMT van endoc...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			vereist om de injector te comprimeren
Rail system	VisualSonics
rotator			om glasbuis met embryo's in de incubator te draaien
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillaire buizen	World Precision Instrument	KTW-120-6	1,2-μm externe diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection naalden	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1,14 mm/53 mm, met 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton spuiten
Petrischalen			10-cm diameter
Mineralolie	Sigma	M8410
Siliconen membraan	Visualsonics		4,3 x 4,3 cm
Play-Doh
Isofluraan	Vet One
haarverwijderingsmiddel	Nair
Oogvocht	Optixcare	31779
Elektrode gel (Signa)	Parker
Hechtdraad	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasoon gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorfinehydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0,05-0,1 mg/kg in zoutoplossing
Overige
Siliconen elastomeer	Dow Corning	Sylgard 184
Glazen petrischalen	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insectenspelden	Fine Science Tools	26002-20
Media en cultuurreagentia
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	hoge glucose en 50% ratten serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rattenserum	Janvier	ODI 7158
Penicilline/streptomycine	Life Technologies	15140-12
zuurstof 40%	Air liquid		vereist om het embryocultuurmedium te oxygeneren
Fetaal runder serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collageen type I	BD	354236	om kweekschalen te coaten voor explantcultuur
Kweekschalen	Dutcher /Orange	131020
Injectaten
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Bewaar bij -20 °C. Verdun 1:100-200 in zoutoplossing voor gebruik.
PGK-GFP-expresserend lentivirus			~8E9 transducerende eenheden/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019