We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Testen het lot van embryonale of pluripotente stamcel-derivaten in vitro protocollen tot controversiële resultaten die niet noodzakelijkerwijs hun in vivo potentie weerspiegelen. Bij voorkeur moet deze cellen in een geschikte embryonale omgeving geplaatst teneinde de definitieve fenotype te verkrijgen. Bovendien heeft cell lineage tracing studies in de muis na het labelen van cellen met kleurstoffen of retrovirale vectoren meestal beperkt tot vroeg stadium muizenembryo's met nog slecht ontwikkelde organen gebleven. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we standaard en ultrasoon gemedieerde micro-injectie protocollen aan verschillende agenten te injecteren in gerichte gebieden van het hart in muizenembryo's op E9.5 en latere stadia van ontwikkeling. Embryonale explant of embryo's worden vervolgens gekweekt of links om verder te ontwikkelen in de baarmoeder. Deze middelen omvatten fluorescerende kleurstoffen, virus, shRNAs of stamcel-afgeleide stamcellen. Onze aanpak kan voor het behoud van de functies van het orgel terwijl het toezicht op de migratie en het lot van gelabelde en / of geïnjecteerde cellen. Deze technologieën kunnen worden uitgebreid naar andere organen en zal zeer nuttig zijn om de belangrijkste biologische vragen te beantwoorden in de biologie van ontwikkeling.
Inleiding
Meer dan een decennium geleden, hebben menselijke embryonale stamcellen (HuESCs) is afgeleid van menselijk blastocysts 1. Sindsdien hebben deze cellen het onderwerp van een belangrijk gebied van onderzoek dat onvervulde vragen in ontwikkelingsbiologie mens behandelt te worden. HuESCs zijn verder voorzien van hoop in de regeneratieve geneeskunde. De laatste jaren zijn menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) gegenereerd van patiënt-specifieke somatische cellen, die modellen van genetische ziekte 2. Vele in vitro protocollen voor differentiatie van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen naar verschillende cellij....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding
Animal procedures
Verkrijgen goedkeuring van een dier ethische commissie en volg institutionele richtlijnen voor het werk met het virus, huESC en / of IPSC (indien van toepassing), evenals muis hanteren, het verkrijgen van muizenembryo's, en het uitvoeren van de muis chirurgie. Voor getimede paringen, wordt de dag van de plug als embryonale dag (E) 0,5 / 0,5 dagen na de coïtus.
- Micro-injectie naalden:
Voor ex utero micro-injectie, trek glazen pipetten (1,2 mm buitendiameter borosilicaat capillaire buizen) met een pipet trekker / beveller een 1 of 10 micrometer intern....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De injectie protocollen hierboven beschreven, kunnen cellen worden gemerkt en / of geïnjecteerd in de muis embryonale hart. Als proof of concept, zijn verschillende voorbeelden getoond waarin de injectieprotocol en ex vivo AVC explantaat, geïsoleerde hart of geheel embryokweek werden gecombineerd (Figuur 1).
Figuur 1 toont de bereiding van het embryo voor celinjectie. De E9.5 embryo wordt verwijderd uit zijn decidua met behoud van de integriteit van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De intra-cardiale ex vivo injectie protocollen hierboven beschreven zijn ontworpen om hartfunctie gedurende minstens 48 uur in mid-stage (E9.5-E11.5) muizenembryo's te behouden. Deze injectie aanpak kan voor ruimtelijk gerichte injectie van DNA of cellen. De weinige voorbeelden in figuren 1-3 bieden proof of concept voor de afbakening ex vivo en in vivo moleculaire mechanismen van ontwikkelingsprocessen die plaatsvinden in beperkte cardiale regio's, zoals EMT van endoc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de Foundation Leducq (mitralisklep) en het Agence Nationale pour la Recherche (ANR verlenen Specistem) voor de financiering van dit onderzoek.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | vereist om de injector te comprimeren | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | om glasbuis met embryo's in de incubator te draaien | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillaire buizen | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1,2-μm externe diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection naalden | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1,14 mm/53 mm, met 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton spuiten | |||
| Petrischalen | 10-cm diameter | ||
| Mineralolie | Sigma | M8410 | |
| Siliconen membraan | Visualsonics | 4,3 x 4,3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isofluraan | Vet One | ||
| haarverwijderingsmiddel | Nair | ||
| Oogvocht | Optixcare | 31779 | |
| Elektrode gel (Signa) | Parker | ||
| Hechtdraad | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasoon gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorfinehydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0,05-0,1 mg/kg in zoutoplossing |
| Overige | |||
| Siliconen elastomeer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glazen petrischalen | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insectenspelden | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media en cultuurreagentia | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | hoge glucose en 50% ratten serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rattenserum | Janvier | ODI 7158 | |
| Penicilline/streptomycine | Life Technologies | 15140-12 | |
| zuurstof 40% | Air liquid | vereist om het embryocultuurmedium te oxygeneren | |
| Fetaal runder serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collageen type I | BD | 354236 | om kweekschalen te coaten voor explantcultuur |
| Kweekschalen | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectaten | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Bewaar bij -20 °C. Verdun 1:100-200 in zoutoplossing voor gebruik. |
| PGK-GFP-expresserend lentivirus | ~8E9 transducerende eenheden/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Referenties
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (200....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
