Cel-gebaseerde therapie voor hartfalen bij Rat: Dubbele Thoracotomie voor myocardinfarct en Epicardiale Implantatie van Cellen en Biomatrix

Samenvatting

Implantatie van een biograft myocardiaal infarct geïnduceerd door LAD ligatie in een knaagdier model behandelen conventioneel vereist twee open-hartoperaties. Om terug te dringen en de optimale omstandigheden voor fixatie van vaste en gelatineachtige biomatrices geassocieerd met cellen, hebben minimaal invasieve procedures ontwikkeld.

Samenvatting

Cardiale celtherapie heeft opgedaan toenemende belangstelling en de implantatie van biomaterialen in verband met cellen is uitgegroeid tot een groot probleem om myocardcel levering te optimaliseren. Knaagdier model van een myocardinfarct (MI), bestaande uit LAD (LAD) ligatie is meestal uitgevoerd via een thoracotomie; een tweede open-hart operatie via een sternotomie is van oudsher uitgevoerd voor epicardial toepassing van de behandeling. Sinds de beschrijving van LAD ligatie model, heeft na de operatie sterftecijfer daalde 35-13%, maar de tweede operatie heeft kritiek gebleven. Om na de operatie het herstel te verbeteren en pijn en infectie te verminderen, zijn minimaal invasieve chirurgische procedures gepresenteerd. Twee thoracotomie uitgevoerd, dat het eerste voor LAD ligatie en het tweede voor behandeling epicardiale toediening. Biografts bestaande uit cellen gekoppeld aan vaste of gel Type matrices werden aangebracht op het infarct area. LAD ligatie resulteerde in verlies van hartfunctie zoals bevestigd door echocardiografie uitgevoerd na 2 en 6 weken. Goldner trichroomkleuring uitgevoerd op hart secties bevestigd transmuraal littekenvorming. Eerste en tweede operaties resulteerde in minder dan 10% postoperatieve mortaliteit.

Inleiding

Sinds het einde van de 19 ^{e eeuw,} heeft hart-en vaatziekten de nummer een seriemoordenaar in de geïndustrialiseerde landen bleef. Onder hen, coronaire hartziekte is de belangrijkste oorzaak. De acute fase resulteert in een myocardinfarct (MI) en wordt gevolgd door onaangepast remodeling dat geleidelijk ontwikkelt in de richting van een chronische fase en ernstig hartfalen. Ondanks de recente belangrijke technologische en therapeutische vooruitgang, is de morbiditeit en mortaliteit ten gevolge van de progressie van hartfalen nog steeds ^1. In deze context heeft celtherapie opgedaan toenemende belangstelling als een nieuwe therapeutische optie om de progressie van de ziekte naar hartfalen stoppen en de recent geïdentificeerde regeneratieve capaciteit van het myocardium te stimuleren. Experimentele en klinische onderzoeken hebben overtuigend bewijs van de gunstige effecten verkregen na harttransplantatie van verschillende celtypes aanwezig. Belangrijkste resultaten opgenomen verbeterde cardiac contractiele functie, verminderde linker ventrikel remodeling, verminderde infarctgrootte en verhoogde vasculaire dichtheid in het infarctgebied. Het lage retentie na celinjectie celaantal blijft een belangrijk nadeel. Vereniging van cellen met een biomatrix verbeteren van cel levertijd ² hebben onlangs bevorderd onderzoeker en klinische belangen.

Ligatie van de linker anterior descending kransslagader (LAD) is een referentiemethode voor MI in kleine diermodel dat resulteert in een transmuraal infarct en een volwassen litteken. Celtherapie toegepast in de chronische fase van MI is een tweede chirurgische ingreep. Een mediane sternotomie wordt gewoonlijk uitgevoerd om intramyocardiale injectie van de cellen of epicardiale implantatie van biografts mogelijk. Dergelijke invasieve chirurgische procedures te verhogen van het sterftecijfer, na de operatie het herstel tijd, pijn, en het risico van infectie. De minimaal invasieve benadering hier gepresenteerde voorkomt niet alleen dergelijke voorspanning maar ook optimal toegankelijkheid van het centrum voor de behandeling van toepassing. MI en epicardial implantatie van cellen geassocieerd met een soort gel biomatrix worden uitgevoerd op een kloppend hart via links intercostale thoracotomie.

Protocol

OPMERKING: Lewis mannelijke en vrouwelijke ratten, 200-220 g werden gehuisvest onder standaard laboratorium omstandigheden (12 uur licht en donker cyclus, ad libitum water en voedsel, IVC kooi). Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de aanbevelingen van de FELASA en de Zwitserse wet op de dierenbescherming.

1 Cell Voorbereiding: mesenchymale stamcellen Isolatie uit beenmerg

1. Verdoven de ratten met isofluraan 5% en O ₂ 5 L / min in een inductie kamer voor 5 minuten. Plaats snuit van het dier in een neuskegel verbonden met het anesthesiesysteem. Voer een teen of staart knijpen om sedatie te bevestigen.
2. Verwijder het vel van het been met een schaar door het snijden van de huid van de enkel aan de heup. Verwijder de spieren en snijd de slagader voor dierlijke verbloeding. Expose het heupgewricht en ontwrichten het dijbeen hoofd. Het is belangrijk niet te vergeten de femur kop beschadigen. Leg de botten in steriele PBS in een 50 ml plastic buis.
3. Verwijder alle muscles en ligamenten van de botten zonder ze te breken. Opmerking: Het is belangrijk dat het bot blijft intact koppeling van spoeloplossing of contaminatie met ethanol voorkomen. Spoel de geschilde botten in 70% ethanol gedurende 5 minuten.
4. Onder de steriele laminaire stroming kap, snijd beide uiteinden van de botten met een schaar. Spoel het beenmerg door het injecteren steriele PBS van het bot uiteinde. Verzamel merg in een 15 ml buis. Centrifugeer 7 min bij 300 x g.
5. Verwijder het supernatant. Hang de pellet in 3 ml Red Blood cellysebuffer. Incubeer de suspensie gedurende 1 min bij kamertemperatuur alvorens opnieuw spinnen gedurende 7 min bij 300 x g. In een 150 ml kolf, voeg steriele cel kweekmedium (395 ml IMDM medium, 5 ml pen / strep, 100 ml FBS) en zaad van de cellen.
6. Wijzig medium de tweede dag om niet-hechtende cellen te verwijderen.
   1. Voeren medium verandert elke tweede dag gedurende 2-3 weken tot de gewenste cel hoeveelheid wordt verkregen.
   2. Als alternatief, bereiden de biograft door zaading van de cellen op de vaste matrix als nodig en elders beschreven ^3.
7. De dag van cardiale implantatie, de voorbereiding van de cellen of de oogst van het biograft net voor epicardiaal toepassing.
   1. Het verzamelen van de cellen met behulp van Accutase cel detachement oplossing. Tel de cellen. Vul een 1,5 ml centrifugebuis met het volume van celsuspensie berekende gewenste hoeveelheid cellen te verkrijgen. Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 300 g en verwijder het supernatant.
   2. Als alternatief, de oogst van het biograft van cel kweekmedium, afspoelen in steriele PBS, en in vers kweekmedium te houden zonder serum.

2 Eerste Thoracotomie en LAD Ligation

1. Weeg de rat. Zet de verwarming pad bij 37 ° C. Verdoven van de rat met 5% isofluraan en 5 L / min 100% O ₂ in een inductie kamer voor 5-7 minuten. Voer een teen of staart knijpen om sedatie te bevestigen. Plaats de rat op de verwarming pad.
2. Intuberen het dier met een 14G iv catheter. Sluit de intubatie katheter naar een knaagdier ventilator geprogrammeerd voor 2,5 L / min zuurstof, 2,5% isofluraan, tidal volume van 2 ml, en een ademhalingsfrequentie van 90 ademhalingen / min.
3. Bereid een buprenorfine-oplossing bij 0,1 mg / kg. Injecteer subcutaan een derde van de oplossing. Scheer het linker gedeelte van de thorax. Desinfecteren met een 1% Betadine oplossing.
4. Incise de huid loodrecht op het borstbeen bij de vierde intercostale ruimte. Scheid de 3 lagen van de thoracale spieren (pectoralis major, oplopend pectoralis en externe schuine pectoralis). Open de vierde intercostale ruimte (tussen de ribben 4 en 5).
5. Gebruik een kleine retractor aan de ribben te spreiden en het hart bloot te leggen. Open het hartzakje zorgvuldig. Zoek en ligeren van de linker anterieure dalende kransslagader (LAD) met een 7,0 hechtdraad 4 mm onder het atrium.
6. Sluit de intercostale ruimte met twee steken met 3,0 hechtingen. Plaats de twee hechtingen proximaal en distaal van het borstbeen. First, tighten het distale hechtdraad. Klem het beademingsapparaat evacuatieslang 2 seconden teneinde de borst blazen en vermijden pneumothorax. Draai de tweede hechtdraad. Plaats de spieren lagen weer op zijn plaats (geen hechtingen nodig zijn). Sluit de huid met een 5,0 hechtdraad.
7. Ontsmet de hechtdraad met 1% Betadine oplossing. Injecteer de rest van de buprenorfine oplossing. Schakel de anesthesie-systeem. Verwijder intubatie catheter.
8. Houd de rat in de kooi onder een warme lamp voor 1-2 uur. Houd een thermometer in de kooi en de afstand instellen tussen de warme lamp en de kooi om te voorkomen oververhitting. Zet de rat in de IVC-eenheid. Injecteren subcutaan Buprenorfine 0,05-0,1 mg / kg na -operatively elke 6-12 uur gedurende 48 uur.

3 Epicardiale administratie van de behandeling via een tweede Thoracotomie

1. Herhaal de stappen 2.1-2.3.
2. Incise de huid loodrecht op het borstbeen bij de vijfde intercostale ruimte. Scheid de 3 laags van de thoracale spieren (pectoralis major, oplopend pectoralis en externe schuine pectoralis). Open de vijfde intercostale ruimte (tussen de ribben 5 en 6).
3. Gebruik een kleine retractor aan de ribben te spreiden en het hart bloot te leggen. Als er enige aanhang, ze voorzichtig te verwijderen met een fijne tang.
4. Zoek het infarct gebied dat wordt weergegeven als een bleke gebied onder de ligatuur. OPMERKING: Als het nodig is, gebruik dan een 10 cm stuk hechtdraad (7.0) geplaatst aan de top om beter te visualiseren de linker hartkamer. Trek zachtjes aan de hechtdraad losjes gehouden door een klem om het hart bloot te leggen.
5. Breng een van de volgende behandelingen:
   1. Plaats de biograft aan het oppervlak van het hart. Gebruik de voorgevulde spuit fibrinelijm voorverwarmd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng een druppel (50-100 pl) van fibrineafdichtmiddel onder de biograft met behulp van een 25 G naald Luer. Controleer of de biograft perfect is afgedicht.
   2. Ook verzoeken de cel pellet verzameld met een pipet op het oppervlak of het hart op de bleke gebied onder de ligatuur. Breng een druppel (50-100 pl) van fibrinelijm op de celpellet.
6. Verwijder het stukje hechtdraad van de apex.
7. Herhaal de stappen 2,6-2,8.

Resultaten

Alle dieren hersteld binnen 1 uur na thoracotomie. De wondgenezing was snel. Geen infectie of oedeem waargenomen.

De dubbele linker thoracotomie toegestaan ​​optimale toegang tot het hart (figuur 1). Pijn en post-operatie mortaliteit waren laag. Het dier herstelde snel van de operatie en in gewicht (figuur 2). Kaplan Meir survival procent bedroeg 96% voor de eerste thoracotomie. Vier ratten van meer dan 104 stierven binnen de 24 uur na de behandeling applica...

Discussie

De permanente ligatie van de LAD veroorzaakt onomkeerbare hartschade. Het eerste diermodel werd beschreven in 1960 ^4. Sindsdien is het beschouwd als een standaard en geschikt model voor chronische MI. Zijn stabiliteit en reproduceerbaarheid toegestaan ​​experimentele evaluatie van therapieën voor ^MI-5. Verbeterde procedures na de eerste beschrijving meldde een operatieve mortaliteit van 35-13% ^6.

Zoals verwacht, LAD ligatie geïnduceerde verminderde hartfuncti...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polysorb 3-0 suture	Covidien	UL 204
Polysorb 5-0 suture	Covidien	UL 202
Surgipro II 7-0 Suture	Covidien	VP904X
Catheter Insyte 14 G	BD	381267
Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator	Harvard Apparatus	557058
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
Fibrin Sealant	Baxter	1501441	TISSEEL Glue, Frozen -20 °C
Castroviejo Eye Specula	Harvard Apparatus	72-8925	use as retractor for the ribs
IMDM GlutaMAX	Gibco	31980
Pen/Strep	Gibco	15140
FBS	PAA Clone	A15-101
Bone Scissors	Fine Science Tools	16044-10
Red Blood Cell Lysis Solution	Gentra Systems	D-50k1
Accutase Cell Detachment Solution	Stem Cell Technology	7920