Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Samenvatting

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Samenvatting

Een paar jaar geleden, de oprichting van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) luidde een nieuw tijdperk in de medische biologie. Mogelijke toepassingen van menselijke iPSCs omvatten modellering pathogenese van menselijke genetische ziekten, autologe celtherapie na gencorrectie en gepersonaliseerde drug screening door middel van een bron van patiënt-specifieke en symptoom relevante cellen. Er zijn echter verschillende hindernissen te overwinnen, zoals het elimineren van de resterende herprogrammering factor transgenexpressie na menselijke iPSCs productie. Wat nog belangrijker is, kunnen de resterende transgene expressie in ongedifferentieerde menselijke iPSCs juiste differentiaties hinderen en misleiden de interpretatie van ziekte-relevante in vitro fenotypes. Met deze reden hebben integratie vrij en / of transgen vrij mens iPSCs ontwikkeld met verschillende methoden, zoals adenovirus, het piggyBac systeem minicircle vector, episomale vectoren, directe eiwitlevering en gesynthetiseerd mRNA. Echter, de efficiëntie van reprogramming gebruik-integratie vrije methoden is vrij laag in de meeste gevallen.

Hier presenteren we een methode menselijke iPSCs isoleren met Sendai-virus (RNA-virus) gebaseerd herprogrammering systeem. Deze herprogrammering werkwijze toont consistente resultaten en hoge efficiëntie kosteneffectieve manier.

Inleiding

Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) een capaciteit om te hernieuwen in vitro en hebben pluripotentie, die nuttig kunnen zijn voor ziektemodel kan, voor drug screening, en cel-gebaseerde therapie te ontwikkelen tegen ziekten en verwondingen te behandelen weefsel. Echter, hESCs een beperking voor celvervangingstherapie vanwege immunologische, oncologische en ethische barrières, en ziekte-gerelateerde genen te bestuderen, kon de ziekte-specifieke hESCs worden geïsoleerd door middel van pre-implantatie genetische diagnostiek (PGD) benaderingen, maar het is nog steeds technisch uitdagend en het embryo donaties zijn vrij zeldzaam. Deze problemen zijn gerelateerd aan de voortgang van stamcel biologie, die heeft geleid tot de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs).

Human iPSCs zijn genetisch geprogrammeerd zijn van menselijke volwassen somatische cellen en de haven pluripotente stamcel-achtige functies vergelijkbaar met hESCs, waardoor ze een nuttige bron voor regeneratieve geneeskunde, zoals d maaktvloerkleed ontdekking, ziekte modellering en celtherapie in patiënt-specifieke wijze ^1,2.

Tot nu toe zijn er verschillende methoden om menselijke iPSCs genereren, waaronder virus-gemedieerde (retrovirus en adenovirus) ^3, niet-virus gemedieerde (BAC systeem en vectoren transfectie) ⁴ gen transductie en eiwit afgiftesysteem ^5-7.

Hoewel een levering van virus gemedieerde genen kunnen zorgen voor een zekere mate van efficiency kunnen virale vectoren genetische voetafdruk verlaten, omdat hun integratie in gastheerchromosomen om herprogrammering genen tot expressie ongecontroleerd. Zelfs wanneer virale integratie van transcriptiefactoren kunnen activeren of inactiveren gastheergenen ^8, kan het een onverwachte genetische aberratie en het risico van tumorigenese ^5,9 veroorzaken. Anderzijds, de directe invoering van eiwitten of RNA in somatische cellen werden gerapporteerd, maar hebben een aantal nadelen, zoals arbeidsintensieve, herhaalde transfectie, en lage niveau van ^7,10 herprogrammeren. Zelfs episomale en niet-integrerende adenovirus, adeno-geassocieerd virus en plasmidevectoren zijn nog relatief minder efficiënt ^11. Om deze redenen is het aannemelijk niet-integratie herprogrammering methoden met een hoge werkzaamheid van IPSC generatie en minder genetische afwijkingen kiezen. In deze studie gebruiken we een Sendai-virus gebaseerde herprogrammering. Deze methode staat bekend als niet-geïntegreerd in het gastheergenoom produceert het altijd menselijke iPSCs zonder transgen integraties.

Protocol

1. Voorbereiding van de Cel en Media (dag 1)

1. Cultuur en vergroten humane fibroblasten met DMEM medium dat 10% FBS.
2. Plaat humane fibroblasten (Figuur 1) op een 24-wells plaat in de juiste dichtheid per putje op de dag voor transductie.
   OPMERKING: De volgende seriële verdunningen worden aanbevolen (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K en 6.25K) omdat verschillende celtypen hebben verschillende gehechtheid vermogen.
3. Incubeer de cellen gedurende nog een dag in een 37 ° C, 5% _CO2 incubator, zodat de cellen volledig verkleefd en uitgebreid.

2. Voer Transduction (Dag 2)

1. Op de dag van transductie, controleer dan de celdichtheid en koos voor de meest efficiënte dichtheid putten (figuur 2). Het is beter om drie verschillende dichtheden halen: hoog (80 ~ 90%), midden (50 ~ 70%) en een lage (20 ~ 40%).
2. Ten minste 1 uur voor transductie, zuigen de fibroblast media uit de cellen en verander nieuwe 300 ul van fibroblast medium.
3. Verwijder een set van 4 verschillende Sendaivirus buizen uit de -80 ° C bewaren. Dooi elke buis op hetzelfde moment in een 37 ° C waterbad gedurende enkele seconden, en neem dan de buizen uit het waterbad. Daarna ontdooien ze op kamertemperatuur; centrifuge buizen bij 6000 xg gedurende 10 seconden en leg ze op ijs tot gebruik. Niet opnieuw invriezen en ontdooien van het virus, omdat de titers niet zal handhaven.
4. Voeg de aangegeven hoeveelheden van elk van de vier Sendaivirus buizen (Oct-4, Klf-4, c-Myc en Sox-2) micro-centrifugebuis. Zorg ervoor dat de oplossing goed gemengd is door pipetteren voorzichtig.
   Als bijvoorbeeld 50K cellen / putje van een 24-wells plaat Lookwell voor transductie:
   (Titer gebaseerd op het Certificate of Analysis van Life Technologies, kunnen verschillen van partij tot partij zijn)
   Tube hOct-4 = 6,0 x 10 ⁷ ICB, 3 MOI = 5 ul
   Tube hSox-2 = 6,5 x 10 ⁷ ICB, 3 MOI = 4,6 μ; L
   Tube hKlf-4 = 6,3 x 10 ⁷ ICB, 3 MOI = 4,8 pl
   Tube hc-Myc = 7,8 x 10 ⁷ ICB, 3 MOI = 3,8 pl
   Totaal = 18,2 ul van vier virus factoren mengsel / een goed (50K cellen) van de 24-well plaat
5. Afhankelijk van de cel dichtheden; voeg 2X, 1X, en 0.5X volume van het virus mengsel in de put. Schud de plaat van voor naar achter, links en rechts (2X: 36,4 ul van virus mengsel, 1X: 18.2 ui en 0.5X: 9,1 pi).
6. Plaats de cellen in een 37 ° C, 5% _CO2 incubator en incubeer overnacht.

3. Vervanging van Cultuur Medium (dag 3 en dag 5)

1. 24 uur na transductie, vervang het medium met 500 ul vers fibroblast medium.
2. Op dag 5, veranderen Medium met verse fibroblast media.

4. Bereid MEF Gerechten voor de co-cultuur (Dag 8)

1. Bereid MEF cellen in 60 mm cultuur gerechten met 10% FBS bevatte DMEM-medium een ​​day voor passage van de getransduceerde fibroblast op MEF feeder-cellen.
   Opmerking: Wij maken gebruik van 5 x 10 ⁵ van MEF in elk 60 mm schaal.

5. Start Co-cultuur Getransduceerde Cellen met MEF Feeder Cells (Dag 9)

1. Voordat plating getransduceerde cellen, aspireren 10% FBS bevatte DMEM media van MEF feeder gerechten en voeg verse 10% FBS bevatte DMEM medium.
2. Verwijder het medium uit de getransduceerde fibroblasten die in de 24-well plaat en was cellen eenmaal met D-PBS. Voeg 200 ul van 0,25% trypsine / EDTA in de fibroblast cellen inde 24-wells plaat. Na minder dan 5 minuten incubatie met trypsine / EDTA, wanneer de cellen beginnen te los van de plaat, het verzamelen van de cellen met groeimedium in 15 ml conische buis. Centrifugeer ze daarna in 6000 g gedurende 4 minuten.
   OPMERKING: Pooling 2X, 1X, en 0.5X virus getransduceerde fibroblast wordt aanbevolen.
3. Verwijder het supernatant en was opnieuw suspenderende cel pellet met 4-5 ml vers fibroblast medium voor neutralisatie van trypsine. Centrifugeer ze vervolgens bij 135 g gedurende 4 minuten.
4. Cellaag seriële verdunning dichtheid en beginnen samen met fibroblast cultuur media op MEF: zoals 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 en 1/128 per 60 mm schaal. Afhankelijk celdood frequentie tijdens de eerste week van transductie, kan men niet hoeft te verdunnen tot 1/2 of 1/128 dichtheid. Opzij zetten overblijvende cellen aan totale RNA-extract als een positieve controle voor Transgene RT-PCR.
5. Plaats 60 mm schalen in 37 ° C, 5% _CO2 incubator overnacht.

6. Feed menselijke embryonale stamcellen Medium en Bewaken van de Cellen (Dag 10)

1. De volgende dag veranderen fibroblast media humane ES-medium met 10 uM Y-27632. Daarna veranderen medium dagelijks met menselijke ES medium: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout Serum Vervanging + 10 ml L-glutamine + 10 ml 10 mM MEM minimale niet-essentiële aminozuren+ 1 ml 2-mercaptoethanol + 10 ng / ml basic Fibroblast Growth Factor.
2. Doe een dagelijkse media verandering met verse menselijke ES media. Na een week, kijk de gerechten eenmaal per 2 ~ 3 dagen onder een microscoop voor de vorming van ES kolonie-achtige cel klonten. Afhankelijk van het celtype, de cultuur meer of minder tijd duren voordat kolonies vertonen.

7. Kiezen van de geïnduceerde pluripotente stamcellen Kolonies en Vouw de Cellen (Dag 20 ~)

1. Drie weken na transductie, moet kolonies goed lijken gekweekt voor het plukken.
2. De dag voor het plukken van de kolonies, bereiden MEF feeder in 24-well plaat.
   LET OP: Wij maken gebruik van 12,5 x 10 ⁵ van MEF in een 24-well plaat.
3. De volgende dag, veranderen medium van MEF gerechten uit fibroblast media voor de menselijke ES media met 10 uM Y-27632. Handmatig kies er een kolonie op elk tijdstip onder de microscoop in de picking-kap opzetten en kleinere bosjes door pipetteren en overbrengenop vers bereide MEF dishes.Try verschillende klonen halen.
4. Passage en uitbreiden van de elk putje van een 24-wells plaat een 6 wells plaat in eerste instantie. Dan van een 6-wells plaat met een 60 mm schalen voor verdere vermeerdering.

8. Karakterisering van Human iPSCs (na 10 Passages)

1. Immunofluorescentie
   1. Plaat menselijke iPSCs in 24-well plaat en cultuur tijdens 4-5 dagen met dagelijks wisselen van materiaal.
   2. Voor het starten van immunofluorescentiebepaling, was de plaat met D-PBS eenmaal. Bevestig vervolgens de cellen direct in 0,4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Daarna Was driemaal in D-PBS gedurende 5 minuten.
   3. Behandel gefixeerde cellen met 0,1% Triton X-100 oplossing in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Zuig het permeabilisering oplossing (0,1% triton X-100 oplossing) en voeg 0,5% BSA blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
   5. Voer een detectie van Nanog, oktober-4, SSEA (fase-specifieke embryonale ANTIGnl) en TRA-1-81 (tumorrejectieantigen) gebruik van een anti-humaan antilichaam in 0,5% BSA-oplossing (controleer het materiaal tafel voor antilichaamverdunning tarief). Incubeer primair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was daarna drie keer in D-PBS gedurende 5 minuten elk.
   6. Controleer met behulp van fluorescentie microscopie na 1 uur incubatie met Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG antilichamen ^2e antilichaam, die 1:2.000 verdund in 0,5% BSA-oplossing bij kamertemperatuur. Vlekken op alle kernen van elke MEF feeder cellen en hiPSCs met DAPI.
2. RT-PCR Transgene Bevestiging
   1. Extract totaal mRNA uit cel pellet met behulp van RNA-extractie reagentia.
   2. Een omgekeerde transcriptie op porties (1 ug) totaal RNA en de resulterende cDNA voor PCR amplificatie door Reverse Transcriptase.
   3. Bereid de PCR mengsels 2 pi cDNA template, 10 pl 2X PCR Master Mix, 2 ui 2 pmol primers bevatten(Vooruit: 1 ui en omgekeerde: 1 pl) en 6 pl DW. Om genexpressie te detecteren, doe de RT-PCR met de in tabel 1 vermelde primers.
   4. Voer de RT-PCR met GAPDH gen als controle voor de efficiëntie van de amplificatiereacties. Visualiseren en PCR product geanalyseerd met 1% agarose-gelelektroforese.

Resultaten

Meestal geïnfecteerde fibroblasten geen morfologische veranderingen in verscheidene dagen na Sendaivirus transductie tonen, maar vijf dagen later, beginnen ze verschillende vormen (figuur 1) hebben. Zoals beschreven in een rechterpaneel van figuur 1, hebben de cellen geen typische fibroblast morfologie meer. Ze hebben een ronde vorm en grotere kern dan cytoplasma. Zelfs wanneer transductie wordt uitgevoerd in 80% cellulaire confluentie, het lijkt alsof ze zijn minder samenvloeiing in de...

Discussie

Herprogrammeren van menselijke somatische cellen om hiPSCs houdt ongekende beloften in fundamentele biologie, persoonlijke geneeskunde, en transplantatie ^12. Voorheen menselijke iPSC generaties vereist DNA-virus dat integratie risico heeft in het gastheergenoom, waarbij ongewenste genetische mutaties die verdere klinische toepassingen zoals ontwikkeling en transplantatie drugtherapie ¹³ beperken kan maken. Met deze reden zijn veel studies gerapporteerd naar vector-en-transgen vrij systeem menselijk...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CytoTune-iPS Reprogramming Kit	Invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated	Global stem	GSC-6105M	5 x 105/6 cm of 12,5 x 105/24-well plate
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin met EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medium	Invitrogen	11330-032
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom met deksel	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μM (Voorraad: 10 mM)
basic fibroblast growth factor	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Voorraad : 100 ug)
Knock-out serum replacement	Gibco	10828028
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), vloeistof (hoge glucose)	Invitrogen	11965118
Fetaal bovien serum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), vloeistof	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	LIFE TECHNOLOGIES	11140050	1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), vloeistof	GIBCO	21985023	1/1,000
Hausser Phase Contrast Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Cell Signaling	4745S	1/200
muis monoklonaal Oct4 antilichaam	Santa Cruz	SC-5279	1/1,000
Nanog	R&D	AF1997	1/1,000
Alexa Flouor 488 geit anti-muis	Invitrogen	948492	1/2,000
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X zonder calcium & magnesium	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
picking hood	NuAire	NU-301
dissecting scope	Nikon	SMZ745