In vitro methode om E-selectine-gemedieerde interacties tussen Prostaat circulerende tumorcellen afkomstig van patiënten en humane endotheelcellen Observeer

Samenvatting

Ons verslag beschrijft een unieke methode om te visualiseren en te analyseren CTC / EG interacties bij prostaatkanker onder fysiologische stromingscondities.

Samenvatting

Metastase is een proces waarin tumorcellen werpen uit de primaire tumor intravasate bloedvatensysteem en lymfestelsel daardoor toegang tot extravasatie en vormen een secundaire niche. De extravasatie van tumorcellen uit het bloedvatensysteem kan worden bestudeerd door endotheelcellen (EC) en tumorcellen verkregen uit verschillende cellijnen. Initiële studies werden uitgevoerd met statische omstandigheden, maar het is goed gedocumenteerd dat EC zich anders gedragen onder fysiologische stroomomstandigheden. Daarom worden verschillende samenstellingen stroom kamer momenteel gebruikt voor het bestuderen kankercel interacties met EC. Huidige stromingskamer assemblages bieden reproduceerbare resultaten met behulp van verschillende cellijnen of vloeistof op verschillende shear stress omstandigheden. Echter, te observeren en te bestuderen interacties met zeldzame cellen, zoals circulerende tumorcellen (CTCs), bepaalde wijzigingen moeten worden aangebracht in de conventionele stroom kamer samenstel. CTCeen zeldzame celpopulatie tussen miljoenen bloedcellen. Bijgevolg is het moeilijk om een ​​zuivere populatie van CTCs vinden. Verontreiniging van CTCs met verschillende soorten cellen die normaal in de circulatie onvermijdelijk middels onderhavige verrijking of depletie technieken. In dit rapport beschrijven we een unieke methode om fluorescent label circulerende prostaatkankercellen en studie van hun interactie met EC in een zelf-geassembleerde stromingskamer systeem. Deze techniek kan verder worden toegepast op interacties tussen prostaat CTCs en een eiwit van belang in acht.

Inleiding

Metastase is een complexe multi-step proces dat nog slecht begrepen. De E-selectin/selectin ligand as is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen bij tumor metastase bevorderen primaire bindingsinteracties tussen het vasculaire endotheel en kankercellen ^1,2. Endotheliale (E)-selectine is een transmembraan eiwit door geactiveerde endotheelcellen tot expressie, terwijl de andere E-selectine ligand (en) tot expressie door tumorcellen ^3. Talloze in vitro benaderingen succes toegepast model E-selectin/selectin ligand interacties tussen tumorcellen en endotheelcellen (EC) ^1. Om deze interacties te bestuderen worden verschillende stromingskamer systemen worden gebruikt voor het simuleren van bloed vaatstelsel. Onder stroom kamer samenstellen wordt parallelle plaat stroming kamer (PPFC) in combinatie met EC routinematig gebruikt als een in vitro model simuleert in vivo shear stress omstandigheden. In dezemethode, EC's worden gekweekt op een 35-mm schotel en na het bereiken van een monolaag, worden EC's verbonden aan de PPFC en shear stress gebaseerde experimenten worden uitgevoerd.

Echter, PPFC en andere huidige systemen presenteren veel beperkingen aan het bestuderen lijm interacties tussen circulerende tumorcellen (CTC's) afkomstig van patiënten en EC, vooral omdat CTC zijn een zeldzame populatie van cellen, vergoten is van de primaire tumor, circuleren onder de miljoenen bloedcellen (1 CTC per 10 ⁹ bloedcellen) ^4. Vandaar dat, in tegenstelling tot onbeperkt aanbod van gekweekte cellijnen, laag CTC tellingen leiden tot zeer weinig en zeldzame CTC / EG interacties, die een goede doorstroming kanaalbreedte om de interacties voor het afspelen analyse op te nemen. Bovendien, aangezien de patiënt afgeleid CTC zijn een onzuivere bevolking, dus een identificatie marker is vereist om CTC's volgen in het bijzonder. Om dit probleem op te lossen, een nieuwe methode om prostaatkanker te identificeren (PCA) CT ontwikkelden weCs door te profiteren van het feit dat vrijwel al deze CTCs expressie prostaat-specifiek membraan antigeen (PSMA) op hun celoppervlak ^5,6. In dit rapport, gebruikten we de prostaatkanker cellijn, MDA PCa2b (MDA), om het potentieel nut van ons nieuwe systeem aan prostate CTC interacties te bestuderen met EC's te tonen, uiteindelijk tot het mechanisme van metastase begrijpen.

De methodologie kan worden toegepast voor verschillende shear gebaseerde experimenten gesimuleerd in vivo vasculaire systeem ^7-9. Naast onderzoeken PCa CTC / EG interacties kan de stroom kamer systeem eenvoudig worden aangepast voor het analyseren van perifeer bloed mononucleaire cellen of interacties tumorcellen met EC. Het gemak van het demonteren en monteren van de stroom kamer, een microglaasje III ^(0.1) (hierna aangeduid als microglaasje), laat kweken EC onder perfusie en het stimuleren van EC met verschillende cytokinen aan pr te inducerenotein expressie. Daarnaast gekweekte EC, recombinante eiwitten zoals E-en P-selectine worden aangebracht op het microscoopglaasje en interacties met tumorcellen kan worden waargenomen onder laminaire stroomomstandigheden ^10.

Protocol

1. Kweken HUVECs op microslides voor het waarnemen van CTC-endotheel interacties

1. Onder de weefselkweek kap, eerste spoel de microglaasje, kanaal breedte van 1 mm met PBS. Voorzichtig jas de microscoopglaasje met 200 gl 50 ug / ml fibronectine (opgelost in PBS) met een 1-ml Luer-lock spuit.
2. Bedek de microglaasje met het deksel en bewaar deze in de weefselkweek kap gedurende 30 minuten. Langzame afgifte van de vloeistof in het microscoopglaasje voorkomt belvorming in het kanaal.
3. Perfuseren 200 pl warm (37 ° C) HUVEC groeimedium (M199 media, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml heparine, 100 ug / ml endotheelcel groeifactor en L-glutamine) via microscoopglaasje en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens de perfusie, bereiden HUVEC celsuspensie.
4. Spoel HUVECs met PBS en voeg 0,05% trypsine-EDTA gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer HUVEC in 2 ml kweekmedium bij 180 xg gedurende 5 minuten.
5. Meet de cel concentratie met behulp van een neubaUER hemocytometer en bereiden 10 ⁷ HUVEC cellen/100 pi groeimedium. Verwijder dan voorzichtig het medium van de inlaat van de microglaasje gebruik van een 200-ul pipet tip.
6. Breng de microglaasje op ooghoogte en met behulp van een 1-ml Luer-lock spuit voorzichtig perfuse 200 ul van bereide concentratie van HUVECs in het kanaal. Voorzichtigheid is vereist bij deze stap om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Als de bellen verschijnen, houden perfunderen voor een iets langere tijd voordat bubbels voer het afvoerkanaal.
7. Plaats een gelijk volume (~ 80 pi) van HUVEC media zowel inlaat en uitlaat van de microscoopglaasje. Dit voorkomt dat de stroom van cellen in beide richtingen.
8. Bedek de glijbaan en bewaar het in de incubator (37 ° C) gedurende 1,5 uur.

2. Voorbereiding van Flow Kamer Assembly for Overnight HUVEC Cultuur op een microplaatje

1. Plaats een steriele 20 ml spuit, vrouwelijke en mannelijke Luer koppelingen, slangen en een injectiepomp in de incubator voor 15 kmn.
2. Voor minimaal dood volume, gebruik maken van de buis met inwendige diameter van 0,04 inch. Kleinere buisdiameter voorkomt de vorming van luchtbellen.
3. Vul het 20-ml spuit met warm (37 ° C) HUVEC medium (12 ml). Bevestig de slang met de connectoren op de injectiespuit. Speel de bellen. Sluit dit samenstel aan de microglaasje.
4. Volledig vullen de inlaat van de microglaasje met HUVEC media. Breng de gevulde 20 ml spuit bevestigd aan de connector naast het microscoopglaasje. Zachtjes sluit de connector aan de microglaasje.
5. Breng de set-up in de couveuse en sluit deze aan op de injectiepomp, vastgesteld op 10 pl / min afschuifsnelheid. Laat de cellen O / N in de incubator bij 37 ° C.
6. De volgende dag, demonteer de set-up door het verwijderen van de connector verbonden aan de inlaat van de microglaasje.
7. E-selectine expressie op EC upregulate, bereid vers kweekmedium dat IL-1β bij 10 ng / ml in 4 ml medium. Zuig de media in een 10-ml spuit. Verwijder thij media van de inlaat van het microscoopglaasje en de injectiespuit aansluiten op de dia.
8. Stel de injectiepomp bij 10 pl / min afschuifsnelheid 4 uur in de incubator.

3. Voorbereiding van de Anti-PSMA (J591-488) gelabelde prostaatkankercellen

1. Tijdens IL-1β incubatie van HUVECs, bereiden anti-PSMA J591-Alexa488 gelabelde prostaatkanker cellen. Voeg 0,05% trypsine-EDTA MDA cellen gedurende 1 minuut. Laat de cellen niet blootgesteld aan trypsine gedurende langere tijd als het kan invloed hebben op de aanwezig op het celoppervlak glycopeptiden. Enzym vrije cel dissociatie reagens kan worden gebruikt in plaats van trypsine. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
2. Resuspendeer MDA cel pellet in 1 ml H / H buffer (Hanks gebalanceerde zout solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM _CaCl2). Voeg anti-PSMA J591-Alexa488 antilichaam bij 20 ug / ml gedurende 30 min bij RT op een donkere plaats. Resuspendeer de cellen tijdens de incubatie.
3. Na 30 min centrifugeren de cel oplossing bij 800 xg gedurende 5 minuten. Aspitarief en resuspendeer de pellet in 1 ml H / H buffer. Tel de gemerkte MDA cellen en breng de uiteindelijke concentratie 1x10 ⁶ cellen / ml. Vul een spuit van 5 ml met J591-488 gelabelde MDA cellen en verwijder de bubbels.

4. Voorbereiding van de Anti-PSMA (J591-488) gelabelde CTC Verrijkt van prostaatkanker Patiënten

1. Verzamel 7,5 ml bloed van patiënten met prostaatkanker in een blauwe dop buis (met natriumcitraat). Voorzichtig verdunnen bloed 1:01 in 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. Voeg 5,3 ml Ficoll-Paque plus in een 50 ml conische buis. Laag verdunde bloed bovenop de Ficoll-Paque. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 minuten.
3. Grondlaag alle buizen of uiteinden in contact met CTCs met 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl _2/4 mM _MgCl2 (R / S buffer) aspecifieke binding van CTCs aan de oppervlakken te voorkomen. Handhaaf 4 ° C temperatuur van media en buffers die in contact met CTCs.
4. Verzamel het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) fractiemet CTCs van de interface in een 50 ml conische buis met 30 ml R / S buffer. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 8 minuten.
5. Resuspendeer de pellet en opnieuw wassen R / S buffer bij 400 xg gedurende 8 minuten. Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in H / H buffer. Voeg anti-PSMA J591-488 antilichaam bij 20 ug / ml gedurende 30 min bij RT op een donkere plaats.
6. Na 30 min gecentrifugeerd PBMC bevattende J591-488 gemerkte CTCs bij 800 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in H / H buffer. Vul een 1 ml injectiespuit (vooraf bekleed met R / S buffer) met het monster.

Voorbereiding 5. Microscoop, spuitpomp en Flow Kamer Vergadering

1. Zet de omgekeerde microscoop en stel de Kohler verlichting op 10X objectief. Breng de spuitpomp op hetzelfde niveau als de monstertafel van de microscoop en zet deze op 1 dyn / cm ² afschuifspanning (~ 10 ul / min).
2. Open de Zeiss AxioVision software. Selecteer de doelstelling op het computerscherm. Maak een nieuwemap onder de optie tools in de software.
3. Open de optie slimme experimenten in AxioVision en de instellingen aanpassen om de korte 30 seconden video's opnemen gedurende 30 minuten.
4. Voor live-tl video, stelt u de afbeelding opties-12 msec Exposure, 2 x 2 bin, 5 Gain. Deze parameters helpen bij het bereiken van video's in de buurt van de video frame rate (~ 23 frames per seconde) met de Zeiss MRM camera.
5. Om de volledige breedte van de stroom kanaal te visualiseren op 10 X doelstelling op het computerscherm, gebruik dan een C-mount adapter (0,63 xf/60 mm Interface).
6. Schakel de kwiklamp.
7. Plaats de spuit en de connector die de cellen op de spuitpomp.
8. Breng IL-1β gestimuleerde HUVEC uit de incubator. Bevestig de zender aan de gevulde inlaatkanaal van de microglaasje met HUVECs.
9. Sluit het uitlaatkanaal met de aansluiting aan de buis. Leg de slang in een schaal of 15 ml conische buis om de stroom door te verzamelen.
10. Start de infusiverder door het microscoopglaasje op 10 pl / min. Let op de interacties tussen endotheliale cellen en MDA gemerkte cellen of gelabelde CTCs afkomstig van patiënten onder 488 nm-filter op de epifluorescentie microscoop.
11. Start de opname het experiment als 30 sec korte video's. Tijdens het afspelen analyse, het meten van de rollende snelheid. Rolling snelheid wordt gemeten door de afstand die de cellen in de tijd te delen.

6. Immunokleuring van het microplaatje

1. Verwijder het medium uit de inlaat en uitlaat van het microscoopglaasje na perfusie MDA cellen op IL-1β-gestimuleerde HUVEC gedurende 10 minuten.
2. Met een 200-ul tip, zet warm (37 ° C) PBS dat calcium en magnesium in de inlaat van het microscoopglaasje gedurende 5 minuten. Kantel de microglaasje met behulp van de deksel als een prop op de bank. Houd de microglaasje in een gekantelde positie voor alle incubaties tijdens immunostaining.
3. Fix HUVECs door perfunderen warme 2% formaldehyde in de inlaat
4. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Twee keer spoelen met PBS gedurende 5 minuten elk.
5. Add triton X-100 (0,1%) in 5% BSA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
6. Twee keer spoelen met PBS gedurende 5 minuten elk. Blok met 5% BSA in PBS gedurende 30 minuten.
7. Incubeer met primair antilichaam geit anti-VE-cadherine (1:100) in 2,5% BSA O / N bij 4 ° C.
8. De volgende dag, twee keer wassen met PBS gedurende 5 minuten elk. Voeg secundaire ezel anti-geit 647 antilichaam gedurende 45 minuten. Tweemaal wassen met PBS gedurende 5 minuten elk.
9. Incubeer bij kamertemperatuur met gehumaniseerde J591 Alexa488-geconjugeerd antilichaam gedurende 1 uur.
10. Tweemaal wassen met PBS gedurende 5 minuten elk. Voeg DAPI gedurende 5 minuten. Wassen met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
11. Voeg PBS (of Mowiol voor opslag op lange termijn). Visualiseer de microglaasje onder de confocale microscoop.

Resultaten

Figuur 1 toont een O / N kweek van een monolaag van EC op het microscoopglaasje. De schaling in Figuur 1A toont dat 100% van het microscoopglaasje zichtbaar met 5X doelstelling bij 70% zichtbaar met een 10x objectief (Figuur 1B). Voor E-selectine gemedieerde interacties worden cellen rollen aan de randen niet als die meer dan 70% van het microscoopglaasje beschikbaar voor video-opname en weergave analyse maakt. In onze ervaring, in eerste instantie deze set-up montage m...

Discussie

Vanwege het lage aantal CTCs tussen bloedcellen, is het moeilijk om CTCs isoleren als een zuivere populatie cellen. Om CTC / EG interacties te bestuderen, de zeldzame en onzuivere bevolking van CTC brengt twee grote uitdagingen: a) identificatie van CTCs onder bloedcellen; b) Waarneming van CTC / EG interacties.

De eerste beperking identificeren prostate CTCs tussen bloedcellen overwinnen, hebben we gebruik van het feit dat vrijwel alle prostaat tumorcellen PSMA <...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02