Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken

Samenvatting

Een werkwijze wordt beschreven visuele begeleiding voor het uitvoeren schaalbare, high throughput selecties van faagweergegeven combinatoriële synthetische antilichaam bibliotheken tegen honderden antigenen tegelijkertijd. Met behulp van deze parallelle aanpak, hebben we geïsoleerd antilichaam fragmenten die een hoge affiniteit en specificiteit vertonen voor diverse antigenen die functioneel in standaard immunoassays zijn.

Samenvatting

De vraag naar antilichamen die de behoeften van zowel fundamenteel en klinisch onderzoek toepassingen te vervullen is hoog en zal drastisch toenemen in de toekomst. Het is echter duidelijk dat de traditionele monoklonaal technologieën niet alleen aan deze taak. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden om de vraag naar kwalitatief hoogwaardige en duurzame affiniteitsreagentia alle toegankelijke elementen van het proteoom voldoen. Met dit doel hebben high throughput methoden voor het uitvoeren van selecties uit faagweergegeven synthetische antilichaam bibliotheken werden ontwikkeld voor toepassingen in uiteenlopende antigenen en geoptimaliseerd voor snelle productie en succes. Hierin wordt een protocol in detail beschreven dat illustreert met video demonstratie van de parallelle selectie van Fab-faag klonen uit een hoge diversiteit bibliotheken tegen honderden doelen met behulp van een handleiding 96 kanaals vloeibare handler of geautomatiseerde robotica systeem. Met dit protocol kan een enkele gebruiker honderden antigenen genererenselecteer antilichamen om hen parallel en bevestig antilichaambinding binnen 6-8 weken. Gemarkeerd zijn: i) een levensvatbare antigeen formaat, ii) voorselectie antigen karakterisering, iii) kritische stappen die de selectie van specifieke en hoge affiniteit klonen beïnvloeden, en iv) vormen van toezicht selectie doeltreffendheid en jonge antilichaam kloon karakterisatie. Met deze benadering hebben we synthetische antilichaamfragmenten (Fab) verkregen vele doelwitten zoals single-pass membraanreceptoren, gesecreteerd eiwit hormonen en meerdere domeinen intracellulaire eiwitten. Deze fragmenten worden gemakkelijk omgezet in full-length antilichamen en gevalideerd hoge affiniteit en specificiteit vertonen. Verder hebben zij aangetoond functioneel in diverse standaard immunoassays zoals Western blotting, ELISA, cellulaire immunofluorescentie, immunoprecipitatie en aanverwante assays. Deze methodologie zal antilichaam ontdekking te versnellen en uiteindelijk terug te brengen ons dichter bij het realiseren van het doel of opwekking van duurzame, hoogwaardige antilichamen tegen het proteoom.

Inleiding

Met het begin van de post-genoom tijdperk, de beschikbaarheid van hoogwaardige bindingreagentia te karakteriseren en moduleren eiwitten is essentieel voor nieuwe onderzoeks- en therapeutische mogelijkheden openen. Antilichamen blijven van cruciaal belang voor zowel de academische en industriële onderzoekers als fundamenteel onderzoek en diagnose-instrumenten en mogelijke therapieën te zijn. Niet verrassend, is er sprake van een indrukwekkende groei van het contract antilichaam-ontwikkeling bedrijven, waarvan de meeste vertrouwen op conventionele hybridoma- technologieën om aangepaste antilichamen te genereren. Niettemin, in vitro selectie met behulp van faagweergegeven antilichaam bibliotheken wordt een krachtig alternatief technologie die unieke voordelen en het succes waar de conventionele technologieën beperkingen ^{1, 2} kan zien kan bieden.

In het licht van de aanzienlijke vraag naar kwalitatief hoogwaardige antistoffen als research tools, twee primaire uitdagingen voor het opwekken van hernieuwbare antilichamen 1) selectie throughput en 2) antigeen availability. Een aantal groepen zijn nu beschreven in vitro selectie pijpleidingen die gericht zijn op het verhogen van de doorvoer en de mate van identificatie antilichaam. Deze beschrijvingen detail van een verscheidenheid van levensvatbare benaderingen die onder andere het selecteren van een van beide full-length richt ^3,4, of structureel verwante domeinen ^5,6,7, met op de kraal gebaseerd ^6,8 of -plaat-gebaseerde ^3,4 antigen immobilisatie regelingen. Bovendien heeft de groeiende interesse gen synthesetechnologieën ⁹ systematisch antigeen generatie gemaakt, bijzonder geïsoleerde domeinen redelijk kosteneffectief en kan mogelijk de moeilijkheid om voldoende hoeveelheden gezuiverd, full-length antigeen verlichten. Door de twee technologieën samen werd een zelfstandige en schaalbare antigen genereren en antilichaam selectie pijpleiding ingericht, dat parallel isolatie van antilichamen voor grote reeksen uitgedrukt antigeen domeinen mogelijk wordt en de ontwikkeling van reagentia voor cha vergemakkelijkenracterizing hele klassen van structureel of functioneel verwante eiwitten.

Tegen dit doel is een geïntegreerde pijpleiding die paren in silico identificatie van expressie antigen domeinen gensynthese, high-throughput bacteriële expressie van antigenen en schaalbare faagweergegeven antilichaam selecties ontwikkeld. Deze pijpleiding vereist slechts basisinfrastructuur beschikbaar voor de meeste life science laboratoria (waaronder antilichaam bibliotheken die steeds beschikbaar via licentie of inzake overdracht van materiaal zijn), maar is ook vatbaar voor automatisering voor gebruik op industriële schaal. Met dit protocol is het mogelijk om honderden affiniteit gelabeld antigen domeinen genereren en routinematig isoleren zeer specifieke antilichaamfragmenten veel van deze antigenen.

Faag display technologie toont aangetoond compatibiliteit met een breed scala van recombinant affiniteitsreagens formaten zoals Fab, scFv, Fv en autonome domeinen en eengroeiend aantal kleine 'alternatieve frameworks' (ontworpen ankyrin repeat eiwitten (DARPINS), fibronectine (Fn), lipocaline domeinen en meer ^10). Discussie beperkt in dit voorbeeld voor de isolatie van Fab antilichaamfragmenten, hoewel wordt aangenomen deze werkwijzen kunnen worden aangepast aan andere soorten bibliotheken. Met deze technologie Fabs met lage nanomolaire affiniteit voor kleine, gelabeld eiwit domeinen waaronder transcriptie factor domeinen, SH2-domeinen, RNA-bindende eiwitten en anderen succesvol is, waarvan vele binden eiwit van volledige lengte en zijn functioneel in immunoassays zoals immunofluorescentie , immunoprecipitatie en immunohistochemie. Belangrijk recombinante bindende klonen volledig verlengd en kan opnieuw gegenereerd uit expressieconstructen via bacteriële productie aanbieden meer consistentie, reproduceerbaarheid en kosteneffectiviteit, waardoor de kosten van strenge kloon validatie rechtvaardigen.

In dit protocol en bijbehorende video, basismethoden voor antilichaam selectie uit faagweergegeven bibliotheken met behulp van geïmmobiliseerde antigeen domeinen worden aangetoond. Deze specifieke werkwijze maakt GST gemerkt eiwitdomeinen geïmmobiliseerd door passieve adsorptie in microwell platen, alhoewel andere labels ^11,12,13 en selectie formats ^13,14,2 zijn ook met succes toegepast. Kritische overwegingen voor de opzet en uitvoering van selecties met parallelle monitoring van selectie parameters gericht op het identificeren en isoleren van specifiek verrijkte klonale antilichamen voor validatie zijn gedetailleerd.

Protocol

1. Antigen Generation

OPMERKING: Antigen domeinen kunnen worden gesynthetiseerd en gekloneerd door een verscheidenheid van commerciële leveranciers in een geschikte IPTG-induceerbare expressie construct.

1. Conversie-expressie constructen in chemisch competente, T1-faag bestendig, BL21 E. coli cellen door 10 ng coderende DNA in 20 pl 1X KCM op ijs in een 96 well PCR plaat gevolgd door de toevoeging van 20 liter chemisch competente cellen.
2. Incubeer de cel / DNA mengsel op ijs gedurende 20 min bij kamertemperatuur gedurende 10 min en vervolgens op ijs opnieuw gedurende 2 minuten voor het redden met 100 ul voorverwarmde super optimale bouillon met glucose (SOC) media, die met een ademende plaat afdichting en schudden bij 37 ° C gedurende 1 uur bij 200 rpm in een 2,5 cm rondschudapparaat.
3. Plaat 5 ul van getransformeerde cellen op Luria-Bertani (LB) / agarplaten aangevuld met carbenicilline (100 g / ml) en kweken O / N tot afzonderlijke kolonies voor het verkrijgengenereren van glycerol voorraden.
4. Inoculeer 1 ml 2YT / carb media met 5 gl glycerol en kweken gedurende 12 uur bij 37 ° C in een 96 well deep-well blok met schudden bij 200 rpm in een 2,5 cm rondschudapparaat.
5. Inoculeer NZY media15 (aangevuld met 0,05% glucose, 2% lactose en 100 g / ml carbenicilline) met een 1:40 verdunning van deze cultuur, schud gedurende 6-8 uur bij 30 ° C en 200 rpm in een 2,5 cm orbitale shaker.
6. Pellet bacteriën en zuiveren antigene eiwitten in high-throughput in een 96-well filterplaat met 100 pl Ni-NTA-hars volgens eerder gepubliceerde protocols16,17.
7. Bepaal de concentratie van gezuiverde eiwitten door Bradford kleurstofbindende assay18 en karakteriseren van de grootte en zuiverheid scheiding en visualisatie van 10-50 ug met Coomassie kleuring op een SDS-PAGE gel (zie figuur 2).
   Opmerking: In dit stadium eiwitten kunnen verder worden gekarakteriseerd door werkwijzen die eiwitaggregatie ¹⁹ beoordelen of vouwen ²⁰ afhankelijk van de aard van het antigeen en de eisen van de selectie pijpleiding.

2. Voorbereiding en titratie van de faagbibliotheek

1. Kies een enkele kolonie van T1 faagresistente E. coli-cellen in 1 ml van 2YT medium aangevuld met 50 ug / ml tetracycline.
2. Zodra celgroei visueel vastgesteld verdunnen cultuur in groter volume 2YT aangevuld met 50 ug / ml tetracycline aan een voldoende hoeveelheid cellen voor infectie waarborgen (gewoonlijk 45 pl per verdunning bibliotheek, zie hieronder.).
3. Bereid de bibliotheek voor gebruik door precipiteren van het faag van opslagbuffer met 1 / 5de volume van autoclaaf 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl (PEG-NaCl) incuberen op ijs gedurende 30 min en pelletiseren neergeslagen faag door centrifugeren bij 12.000 x g.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer geprecipiteerd faag in een geschikt volume van 1 x PBS pH 7,4, 0,2% BSA en 0,05% Tween (PBT), aanpassing to een geschikte faag concentratie selecties (indien nodig) om voldoende bibliotheek dekking te garanderen. Zie Stap 2.9 en discussie.
5. Verdun een 5 pl aliquot faag in 45 pl 1x PBS pH 7,4 in een steriele plaat met meerdere putjes, meng, en een reeks van 10-voudige verdunningen in dezelfde buffer.
6. Voeg 5 pi van elke faag verdunning tot 45 pl T1 faagresistente E. coli-cellen in log-fase groei (OD ₆₀₀ = 0,4-0,8) in een multi- putjesplaat, bedekken met een ademende afdichting en incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm gedurende 30 min in een 2,5 cm rondschudapparaat.
7. Plaat 5 pl van geïnfecteerde cellen van elk van de putjes op een voorverwarmde agarplaat aangevuld met 100 g / ml carbenicilline en kweken O / N bij 37 ° C totdat kolonies zichtbaar.
8. Bereken de totale faag / ml als volgt:
   Faag / ml = aantal kolonies op een carbenicilline plaat in de meest verdunde monster x 200 x 10 ^I (waarbij i = de maximale number verdunningen waarbij kolonies duidelijk).
9. Om het aantal gecoate antigeen putjes bepalen dekking van de bibliotheek diversiteit te waarborgen, als volgt te berekenen:
   Aantal gecoate antigeen putten nodig =
   Gewenste voudige dekking * diversiteit bibliotheek
   # Fagen per 100 gl

3. Antilichaam Selectie van faag display bibliotheken

3.1) Antigen Immobilisatie

1. Om vries-dooi cycli die kunnen beïnvloeden antigeen kwaliteit en verdunningen vergemakkelijken, stelt een stam- eiwit plaat genormaliseerd 100x werkende concentraties (bijvoorbeeld 500 g / ml) en hoeveelheid in niet-bindende 96-well platen voorkomen.
2. Bereid-antigeen beklede platen uit voorraad eiwit oplossingen één dag voorafgaand aan elke ronde van selecties door verdunning uit voorraad platen met PBS.
3. Coat 96 putjes hoge eiwitbinding polystyreen platen met 100 ul van GST-gelabeld antigeen eiwit of negatieve controle pProtein (GST, BSA, neutravidine, etc.) en 5 ug / ml in PBS. Schudden bij 250 rpm 4 ° CO / N op een microplaat schudinrichting.
4. Verwijder proteïneoplossing uit de beklede microplaten, blokkeren de met antigeen beklede en negatieve selectie platen met 200 ui blokkerende buffer (0,2% BSA in 1 x PBS pH 7,4) en schudden bij 250 tpm bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur.
5. Na blokkering was de geblokkeerde proteïne beklede platen vier maal met 200 ul van 1 x PBS pH 7,4 met 0,05% Tween (PT) buffer handmatig of middels een geautomatiseerde microplaat wasmachine.

3.2) Bibliotheek Pre-klaring en Antigen-faag Incubation

1. Afbreken van de bibliotheek van niet (of tag) specifieke bindende faag gepresenteerde antilichaamfragment klonen door overschrijving van 100 pl (10 ¹² faag) faag bibliotheek bereid in PBT buffer tot een aantal putjes bekleed met negatieve controle eiwit of vrij affiniteitslabel eiwit (bijvoorbeeld GST) overeenkomt met het aantal doelen en incubeer faagin putjes 1-2 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 250 rpm.
   OPMERKING: Als een alternatieve of aanvullende middel van negatieve selectie, incubatie kan ook worden in de aanwezigheid van een overmaat (5-25 uM) oplosbaar eiwit affiniteit tag (bijvoorbeeld GST) uitgevoerd om verder te verwijderen-tag bindende klonen en snel herstel van specifieke doelgroepen bindende klonen.
2. Transfer faag supernatant van negatieve selectie met antigeen beklede platen en incubeer gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 250 rpm voor het vangen van specifiek bindende klonen.
3. Verwijder ongebonden faag en was putjes van de microplaat 8-15 keer met PT buffer handmatig of met behulp van een microplaat wasmachine. Verwijder overtollig wasbuffer net voor elutie.

3.3) Elutie, Infectie en Fagen Amplification

1. Vroeg op de dag van de selecties, kies een enkele kolonie van T1 faagresistente E. coli-cellen in 1 ml van 2YT medium aangevuld met 50 ug / ml tetracycline en groeien bij 37 ° C with schudden bij 200 rpm in een 2,5 cm rondschudapparaat of gelijkwaardig.
2. Zodra celgroei wordt vastgesteld en kan worden gezien door het oog, het volume van 2YT media aangevuld met 50 ug / ml tetracycline aan een voldoende hoeveelheid cellen voor infectie waarborgen (meestal 100 pl per selectie putje).
3. Kweek de cellen tot een _OD600 van 0,4-0,8 bereikt (ongeveer 5-7 uur), dan elueerde gebonden faag voeg 100 ul van de cellen gewassen antigeenplaat en schud bij 37 ° C gedurende 30 min.
4. Voeg M13K07 helperfaag tot een uiteindelijke concentratie van 1 x ¹⁰ 10 cfu / ml en incuberen bij 37 ° C gedurende 45 min onder schudden bij 200 rpm.
5. Overdracht cellen 1,2 ml 2YT aangevuld met 150 ug / ml carbenicilline en 75 ug / ml kanamycine in een 96-well deepwell blok met V-bodem en kweken O / N bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm in een 2,5 cm rondschudapparaat.

3.4) Fagen Voorbereiding en Herhaalde Rondes van Selectie

1. Pellet bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
2. Meng gelijke volumes faagsupernatanten uit replicaplaten in een mini-tube 96-well steriele microplate blauwe doos, neutraliseren met ^1/10 volume van 10X PBT en meng. Herhaal selectieronden (vanaf stap 3.1.1) voor 3-4 rondes of tot verrijking wordt waargenomen (zie rubriek 4 en 7) in vergelijking met de negatieve controle-eiwit.
   OPMERKING: In de eerste ronden van selectie bij significant / detecteerbaar verrijking is niet te verwachten (dwz rondes 1 en 2), kan kwantificering van input en output faag titers (in hoofdstuk 7 en representatieve resultaten weergegeven in figuur 3 beschreven) behulpzaam bij het ​​waarborgen zijn faag concentraties minimum voor een succesvolle selecties (in Discussion beschreven) en zijn meer geschikt dan samengevoegd ELISA's.

4. Karakterisering van gepoolde ELISA

1. Coat 96-well hoog eiwit-binding polystyreen platen met 100 ul van GST-gelabeld antigeen eiwit of negatieve controle eiwit (GST, BSA, neutravidine enz.) op 2 ug / ml als per paragraaf 3.1 en schud bij 4 ° CO / N.
2. Verwijder overtollig antigeen, blokkeren de plaat met 200 ul blokkeerbuffer onder schudden gedurende 1-2 uur bij KT bij 250 rpm op een microplaat schudinrichting en was vier keer met 200 ul PT buffer met de hand of met geautomatiseerde plaatwasser.
3. Breng 100 pi van faag supernatant (verdunning 1: 10-1: 20 in PBT buffer), schudden bij 250 rpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en was de plaat acht maal met 200 ui buffer PT.
4. Voeg 100 ul van anti-M13-HRP (1: 5000 in PBT buffer). Schudden bij 200 rpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, dan was de plaat zes maal met 200 ui PT-buffer en tweemaal met 200 ui PBS.
5. Breng 100 pi van 1: 1 TMB substraat en ontwikkelen gedurende 5-15 minuten (of totdat substantiële kleur heeft ontwikkeld), stop de reactie door toevoeging van 100 ui 1 MH ₃ PO ₄ en lees de plaat bij 450 nm.
6. In het algemeen kan verrijking in faagverzamelingen in rondes 3-4 worden waargenomen als een verhouding van specifiek bindende versus niet-specifieke binding van> 2 (zie figuur 4)
   LET OP: Het is informatief om dat hoge absolute bindende signaal op de affiniteitsmerker eiwit mee geeft verrijking van tag-specifieke bindmiddelen (in plaats van doel bindmiddelen), en dat hoge absolute bindende signaal op de negatieve controle eiwit geeft verrijking van niet-specifieke of " sticky "bindmiddelen.

5. Clone Selectie, Sequencing en karakterisering

5.1) Isolatie van Single Fab-faag Clones

1. Afzonderlijke klonen voor sequencing en karakterisering te isoleren, infecteren ^1/10 volume van het geamplificeerde faag zwembad op T1 faagresistente E. coli-cellen in de log-fase van groei (OD ₆₀₀ = 0,4-0,8) in een ronde bodem microtiterplaat, dek af met een Breathable plaat afdichting en incubeer onder schudden bij 200 rpm gedurende 30 min bij 37 ° C.
2. Bereid 10-voudige seriële verdunningen in 2YT media en plaat op aparte agarplaten gesupplementeerd met 100 g / ml carbenicilline.
3. Pick enkele kolonies in 450 ui 2YT / carb medium aangevuld met 1 x 10 ⁹ M13K07 faag / ml en kweken O / N in een mini-buis 96 putjes steriele microplaat blue box incuberen bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm.
4. Pellet bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
5. Klonale faag supernatant kan worden gebruikt voor het rangschikken van Fab-faag klonen (zoals beschreven in paragraaf 5.4) of klonale directe binding ELISA om specificiteit tegen geïmmobiliseerde antigenen (zoals beschreven in secties 5.3 en ²¹⁾ die representatieve resultaten worden getoond in Fig 5.

5.2) Expressie van Fab-klonen voor de karakterisering

1. Naar aanleiding van het klonen in een passende eXpression vector (zie bespreking), pick enkele E. coli kolonies getransformeerd met expressieconstructen in 1 ml 2YT / carb media in een 96 well deep-well plaat met een steriele tandenstoker of pipetpunt en kweken gedurende 12-16 uur bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm. Dit kan handmatig of met een geautomatiseerde kolonie picker worden gedaan.
2. Breng 40 pl groeiende kweek tot 1,5 ml NZY medium aangevuld met glucose / lactose / glycerol in een 96 well deepwell blok volgens de methodologie van Studier et al. ¹⁵
   Opmerking: Als alternatief kunnen cellen worden gekweekt gedurende 3-4 uur (OD 0,8-1,0) in niet aangevuld en eiwitexpressie geïnduceerd door toevoeging van 1 mM IPTG.
3. Bedek de kweek (ken) met een ademende afdichting en drukken Fab klonen gedurende 6-8 uur bij 30 ° C onder schudden bij 200 rpm. Spin platen bij 4000 xg gedurende 15 min om bacteriële cellen te pelleteren, verwijder het supernatant, afdekplaten met een folie afdichting en vries pellets bij -20 ° C tot lysis.
4. Bevrijden expressie Fabs uit verzamelde pellets met 100 ul lysis buffer (Tris HCl 50 mM, 200 mM NaCl, 1,25% Triton X-100 pH 8,0 met 1 mg / ml lysozym en 10 U benzonase / ml kweek en proteaseremmers) en schudden 2 uur bij 4 ° C.
5. Verwijder de celresten door centrifugatie bij 4000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en laat ruw lysaat supernatant voor gebruik in de initiële karakterisering van de specificiteit van ELISA platen (zie paragraaf 5.3).

5.3) Clone Karakterisering door directe binding Klonale Fab ELISA

1. Immobiliseer antigenen zoals beschreven in paragraaf 3.1 plaats aliquotting 30 pi van 2 ug / ml antigeen in PBS aan putjes van een plaat met 384 putjes. -Quad gebaseerd antigeen-outs in de plaat kan reagensoverdracht faciliteren bij het gebruik van 96-kanaals gebaseerd doseren hoofden. Wassen en blokkeren ELISA-platen volgens paragraaf 3.1.
2. Ontruimd lysaten verzameld uit Sectie 5.2 kan direct worden aangebracht op geïmmobiliseerd antigeen voor evaluatie van binding. Incubeer 30 pl lysaat per putje gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder schudden bij 200 rpm.
   OPMERKING: Gezuiverde Fab kloon eiwit kan afwisselend gebruikt worden door verdunnen tot 10 ug / ml in PBT buffer en toepassen 30 pi van elke kloon geblokkeerde putjes met antigeen of negatieve controle-eiwit (GST, BSA) en ontwikkeling op dezelfde wijze beschreven hieronder. Alternatief kunnen Fab-faag worden gebruikt door verdunning 10 ui faag supernatant (beschreven in paragraaf 5.1) in 20 pl PBT buffer (1: 3) en het detecteren met anti-M13-HRP-antilichamen (in stap 4.4 beschreven - 4.5)
3. Verwijder overtollig lysate en wassen putten handmatig of met behulp van een geautomatiseerd plaat gewassen 8x met 100 ul van PT buffer en verwijder overtollig buffer.
4. Incubeer 30 ui van een 1: 5000 verdunning van secundair anti-FLAG antilichaam in PBT buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden bij 200 rpm.
5. Wassen, te ontwikkelen en te kwantificeren als per Secties 4,3-4,5.
   OPMERKING: Representatieve resultatenillustreren zowel specifieke en niet-specifieke binding klonen zijn weergegeven in figuur 5.

5.4) Clone Sequencing

1. Bereid een PCR master mix zoals aangegeven in tabel 2.
2. Voeg 2 pi van het geschikte PCR-matrijs (of faag supernatant of geresuspendeerde één faagmide bevattende bacteriële kolonie) 20 pi PCR Master Mix bereid met de geschikte primers in putjes van een PCR-plaat.
   OPMERKING: Afzonderlijke mastermengsels nodig zijn voor sequentiebepaling van zowel de zware als lichte keten genen.
3. Voer de PCR reactie met de in tabel 2 opgesomde parameters - PCR instellingen.
4. Controleer succes van de PCR-reactie door het mengen van 5 ul van de voltooide reactie met ladingskleurstof op een 1% agarosegel aangevuld met DNA visualisering vlek en beeldvorming op een 300 nm transilluminator.
5. Voeg 2 pi PCR product 10 uit steriel water bevattende 0,2, Pi elk van exonuclease en garnalen alkalische fosfatase en incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min gevolgd door enzym inactivatie bij 80 ° C gedurende 10 min om overmaat primers in voorbereiding sequencing verwijderen.

6. Scaling voor Automated Selecties

6.1)-pipet gebaseerd Liquid Handling

1. Maak een 1% (w / v) broomfenolblauw in water en verwijder onoplosbare deeltjes met een 0,45 ml filter.
2. Om het lineaire bereik van absorptie op de plaatlezer bepalen bereiden een 1: 1000 verdunning van 1% broomfenolblauw-oplossing in water en verder met tweevoudige seriële verdunningen (16 verdunningen totaal).
3. Breng 100 pi van elke verdunning tot een vlakke bodem met 96 putjes plaat en lees absorptie bij 590 nm. Perceel absolute absorptie versus verdunningsfactor en kies een verwatering van het midden tot hoge einde van het lineaire bereik voor de volgende testen.
4. Broomfenolblauw toevoegen aan water of aan de werkelijke oplossingdie wordt gepipetteerd op basis van de drie platen met 96 putjes geselecteerd in de vorige stap in voldoende volume voor pipetteren verdunning, plus dode volume in het reservoir.
5. Kalibreer een single-channel pipet op de proef volume leveren door pipetteren water op een analytische balans (100 ul van water weegt 100 mg bij RT.)
6. De gekalibreerde pipet, breng het testvolume van de gekleurde oplossing ten minste drie putjes van een vlakke bodem met 96 putjes plaat en lezen hun absorptie bij 590 nm, in drievoud.
7. Weeg drie lege vlakke bodem platen met 96 putjes op een analytische balans en opnemen van hun massa.
8. Pipetteer testvolume van reservoir naar elk van de drie platen met 96 putjes en meet de absorptie bij 590 nm, in drievoud.
9. Weeg elke plaat en bereken het verschil in massa.
10. Evalueer of de absorpties in elk putje uniformiteit binnen het tolerantiebereik (bijv. +/- 5%) en of zij stroken met the extincties verkregen door de hand-pipetteren met de gekalibreerde pipetman. Als bepaalde kanalen zijn steeds over- of leveren (bijvoorbeeld zie figuur 6), te volgen procedures reparatie en herhaal de evaluatie procedure totdat alle kanalen leveren uniforme volumes.
11. Ten tweede, zodra alle kanalen worden bevestigd om een ​​uniforme volumes leveren, controleren de juistheid van dat volume door het berekenen van de gemiddelde massa verschil, per putje. Zo zal een perfect gekalibreerd vloeibare handler set voor 100 ul leveren 9,60 g water per plaat, of 0,10 g water per well. Als de werkelijke geleverde volume is constant boven of onder het beoogde volume, dan is een correctiefactor kan worden toegepast, dat wil zeggen, het programmeren van 110 ul om daadwerkelijk leveren 100 pi.
    OPMERKING: Voor kleine hoeveelheden, bijvoorbeeld 10 ul gebruikt tienvoudig meer broomfenolblauw in de geverfde oplossing en pre-aliquot 90 pl water aan de platen met 96 putjes met de hand, zodat de absorbances zijn meetbaar en vallen in het lineaire bereik.

6.2) Geautomatiseerde Plate Wassen

1. Immobiliseren positieve doel en negatieve controle eiwitten in afzonderlijke putjes van 96 putjes microplaten (twee platen per conditie te testen) zoals beschreven in paragraaf 3.1.
2. Blokkeer aspecifieke bindingsplaatsen door incubatie met blokkerende oplossing een uur bij KT.
3. Voeg identieke 100 ul aliquots 10 ¹³ cfu / ml targeten-bindende Fab-faag oplossing PBT aan alle putjes in alle platen en geïncubeerd onder zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
4. Was twee platen op basis van elke conditie, één plaat voor infectie en titratie en een plaat voor ELISA.
5. Evalueren van de werkzaamheid van de was door directe infectie in bacteriën en titratie (zoals beschreven in paragraaf 3.3 (zonder M13K07 toevoeging) en 7.2.1) of de ontwikkeling van anti-M13-HRP antilichaam en colorimetrische substraat (zoals beschreven in hoofdstuk 4).
6. Faag titers frOM specifieke klonen vaak op in het bereik van 10 ⁵ -10 ⁷ faag / ml van een geïmmobiliseerd eiwit waartegen de kloon specifiek bindt. Sommige residuele binding negatieve controle-eiwit (bijvoorbeeld BSA) is te verwachten en algemeen 10 ² -10 ⁵ faag / ml waargenomen, maar zeer lage titers (dwz., <10 ¹⁾ kan overdreven stringente wassen signaal, die compromis een selectie.
7. Voor faag binding bepaald door ELISA vergelijken absolute bindende signalen voor positieve en negatieve controle eiwitten om te bepalen of robot wassen overeenkomt met gevestigde resultaten handen wassen (figuur 7).

6.3) plaatwasser Decontaminatie

1. Om te beginnen, voert de sanering protocol te testen.
   OPMERKING: Wij raden u aan ten minste het dubbele van de totale line volume, en prime en genieten van de wasmachine hoofd gedurende 5 minuten in 0,5% natriumhypochloriet, vers verdund frOM commercieel bleekmiddel (typisch 6% natriumhypochloriet).
2. Prime en genieten van de wasmachine hoofd gedurende 5 min in steriele (geautoclaveerd) water en tenslotte, prime het systeem totdat de lijnen zijn vol met lucht.
3. Prime de lijnen met steriel water of wassen buffer.
4. Was een steriele 96 goed microplate een keer, te verwijderen uit de wasmachine en verzegelen met steriele plaat afdichting. Dit is de pre-contamination control plaat.
5. Aliquot 100 pl O / N geamplificeerde faag supernatant aan alle putjes van een plaat met 96 putjes.
6. Was de faagbevattende plaat een keer, dan verwijderen uit de wasmachine en verzegelen met een plastic of folie plaat afdichting. Dit is de verontreiniging controle bord.
7. Het uitvoeren van de sanering protocol wordt getest. In dit voorbeeld, herhaalt u stap 6.3.1 en 6.3.2.
8. Was steriele microplate keer, dan verwijder uit wasmachine en afdichting. Dit is de sanering testplaat.
9. Plaat 50 pi logfase E. coli titratie platen; Dit is de pre-infectie controle plaat.
10. Ontzegelen pre-verontreiniging, vervuiling en decontaminatie 96 putjes en voeg 100 pl E. coli in de log-fase groei stadium aan alle putjes, met behulp van nieuwe tips voor elk putje.
11. Seal en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten bij 200 rpm.
12. Plaat 50 ui geïnfecteerde cellen uit drie willekeurige putjes van elke plaat met 96 putjes tot 10 cm 2YT / carb platen en incubeer bij 37 ° CO / N.
13. Pipetteer 50 ul van geïnfecteerde cellen uit alle putjes van elke plaat diepe putjes die 1 ml 2YT plus 100 g / ml carbenicilline per putje en groeien O / N bij 37 ° C.
14. Herhaal de ontsmetting protocol en laat de wasmachine lijnen drogen.
    OPMERKING: Nee O / N groei op platen of in vloeibaar medium moet worden waargenomen op de pre-infectie controle, pre-contaminatie controle of decontaminatie-test platen. Veel kolonies en groei moet worden waargenomen op de contaminatie controle plaat; zo niet geen conclusie over de effectiviteit van dedecontaminatie protocol kan worden gemaakt. Idealiter zal de decontaminatie platen geen kolonies en geen O / N groei van elk van de putten in de O / N platen verkregen. De stringentie van de decontaminatie protocol kan worden verhoogd bij hogere bleekconcentraties, langere uitzettijden en additionele cycli.

7. Input / Output Titraties

7.1) Input Fagen Titraties

1. Verdun een 5 pl aliquot van faag 50 pi met steriel gefiltreerd PBS en meng.
2. Bereid seriële 10-voudige verdunning in steriel gefiltreerd PBS tot 10 ¹⁰ met behulp van multi-channel pipet of een 96-kanaal pipet.
3. Inoculeer 5 gl verdund faag in 45 ui T1 faagresistente E. coli-cellen in log-fase groei (OD 0.6-0.8) en incubeer bedekt met een ademende afdichting voor 30 min bij 37 ° C.
4. Plaat 5 ul van geïnfecteerde cellen op een LB / agarplaat aangevuld met 100 ug / ml carbenicilline en geïncubeerd O / N at 37 ° C.
5. De faag concentratie kan worden geschat op basis van de meest verdunde monster waarin kolonies lijken volgens de berekeningen beschreven in paragraaf 2.8.

7.2) Output Fagen Pitrations

1. Na elutie van gebonden faag-plaat door toevoeging van E. coli-cellen, verdun een 5 pl aliquot van faag geïnfecteerde cellen 50 ul met geautoclaveerd 2YT media
2. Bereid seriële 10-voudige verdunning in een autoclaaf 2YT media tot 10 ⁶ met behulp van een multi-channel pipet of 96 kanaals pipet.
3. Plaat 5 ul van geïnfecteerde cellen op een agarplaat aangevuld met 100 ug / ml carbenicilline en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
4. De faag concentratie kan worden geschat op basis van de meest verdunde monster waarin kolonies lijken volgens de berekeningen beschreven in paragraaf 2.8.
   LET OP: In beide gevallen (dwz, input en output faag titers, vergeleken met kolonie nummers op zowel tetracycline (totaal cell nummer) en kanamycine (hulpfaag titer) kan ook informatief zijn.

Resultaten

Is gebruikt De hierin beschreven protocol antilichaam-fragmenten van verschillende zowel qua structuur en functioneel gerelateerde antigen domeinen van combinatorische faag gepresenteerde Fab databanken parallel. Problemen gerelateerd antigeen beschikbaarheid kan worden omzeild, vaak door in silico identificatie van expressie antigen domeinen die geschikt zijn voor antilichamen selectie ²³ zijn. Door het koppelen antigeenexpressie antilichaam selectie binnen hetzelfde laboratorium (figuur 1) ...

Discussie

Bij het ​​uitvoeren van in vitro antilichaam selecties, de twee belangrijkste determinanten van selectie succesvol zijn 1) het isoleren van goed gevouwen antigene doelen voor het selecteren op en 2) de beschikbaarheid van een hoge functionele diversiteit antilichaambibliotheek. In veel gevallen kan de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden goed gevouwen, full-length eiwit beperkend. Een benadering voor het overwinnen van deze beperking is om domeinen geïdentificeerd van bioinformatica analyse ²² ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MATERIALS
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker	Eppendorf	M1282-0004
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system	Anachem Ltd	LIQ-96-200
Microplate shaker	VWR	12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge	Thermo Product	75004525
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer	Biotek	ELX405USD
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot	S&P Robotics
Plastic conical Falcon tube: 50 ml	VWR	21008-178
Plastic conical Falcon tube: 15 ml	VWR	89039-668
Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes	Corning	MCT-175-L-C
96-well/384-well Maxisorp plate	Sigma	M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom deep-well block	Corning	3960
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box	Corning	AXY-MTS-06-C-R-S
Breathable adhesive plate sealing film	VWR	60941-084
REAGENTS
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer
polyethyleenglycol	Bioshop	PEG800.1
gistextract	Bioshop	YEX401.1
bio-tryptone	Bioshop	TRP402.1
N-Z amine	Sigma	C7290
glucose	Sigma	G8270-1KG
lactose	Bioshop	LAC234
glycerol	Bioshop	GLY001.500
carbenicillin	Bioshop	CAR544.10
kanamycin	Bioshop	KAN201.25
tetracycline	Bioshop	TET701.25
Tween 20	Bioshop	TWN510.500
monobasic potassium fosfaat	Bioshop	PPM302.1
dibasic sodiumfosfaat	Anachemia	84486-440
natriumchloride	Bioshop	SOD001.10
kaliumchloride	Bioshop	POC308.1
calciumchloride	Bioshop	CCL302.500
magnesiumsulfaat	EMD	MX0070-1
magnesiumchloride	Bioshop	MAG510.500
NH4Cl	Amresco	0621-1KG
Na2SO4	Bioshop	SOS513.500
agar	Bioshop	AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain	Invitrogen	S33102
fosforzuur	Acros Organics	201140010
lysozym	Bioshop	LYS702.25
benzonase	Novagen	71205
Triton X-100		Bioshop	TRX506.500
protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11 836 170 001
Ni-NTA resin	Qiagen	1018240
1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml)	NEB	N0315S
HRP geconjugeerd M13-specifiek antilichaam (anti-M13-HRP).	GE Healthcare	27-9241-01
TMB substraat: meng gelijke volumes van TMB en H2O2 peroxidase substraat	KPL	50-76-00
dNTP's	Biobasic	DD0056
Taq polymerase	Genscript	E00007
Exonuclease	GE Healthcare	EZ0073X-EZ
Garnalen alkalische fosfatase	GE Healthcare	E70092Z-EZ