Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken

Summary

Een werkwijze wordt beschreven visuele begeleiding voor het uitvoeren schaalbare, high throughput selecties van faagweergegeven combinatoriële synthetische antilichaam bibliotheken tegen honderden antigenen tegelijkertijd. Met behulp van deze parallelle aanpak, hebben we geïsoleerd antilichaam fragmenten die een hoge affiniteit en specificiteit vertonen voor diverse antigenen die functioneel in standaard immunoassays zijn.

Abstract

De vraag naar antilichamen die de behoeften van zowel fundamenteel en klinisch onderzoek toepassingen te vervullen is hoog en zal drastisch toenemen in de toekomst. Het is echter duidelijk dat de traditionele monoklonaal technologieën niet alleen aan deze taak. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden om de vraag naar kwalitatief hoogwaardige en duurzame affiniteitsreagentia alle toegankelijke elementen van het proteoom voldoen. Met dit doel hebben high throughput methoden voor het uitvoeren van selecties uit faagweergegeven synthetische antilichaam bibliotheken werden ontwikkeld voor toepassingen in uiteenlopende antigenen en geoptimaliseerd voor snelle productie en succes. Hierin wordt een protocol in detail beschreven dat illustreert met video demonstratie van de parallelle selectie van Fab-faag klonen uit een hoge diversiteit bibliotheken tegen honderden doelen met behulp van een handleiding 96 kanaals vloeibare handler of geautomatiseerde robotica systeem. Met dit protocol kan een enkele gebruiker honderden antigenen genererenselecteer antilichamen om hen parallel en bevestig antilichaambinding binnen 6-8 weken. Gemarkeerd zijn: i) een levensvatbare antigeen formaat, ii) voorselectie antigen karakterisering, iii) kritische stappen die de selectie van specifieke en hoge affiniteit klonen beïnvloeden, en iv) vormen van toezicht selectie doeltreffendheid en jonge antilichaam kloon karakterisatie. Met deze benadering hebben we synthetische antilichaamfragmenten (Fab) verkregen vele doelwitten zoals single-pass membraanreceptoren, gesecreteerd eiwit hormonen en meerdere domeinen intracellulaire eiwitten. Deze fragmenten worden gemakkelijk omgezet in full-length antilichamen en gevalideerd hoge affiniteit en specificiteit vertonen. Verder hebben zij aangetoond functioneel in diverse standaard immunoassays zoals Western blotting, ELISA, cellulaire immunofluorescentie, immunoprecipitatie en aanverwante assays. Deze methodologie zal antilichaam ontdekking te versnellen en uiteindelijk terug te brengen ons dichter bij het realiseren van het doel of opwekking van duurzame, hoogwaardige antilichamen tegen het proteoom.

Introduction

Met het begin van de post-genoom tijdperk, de beschikbaarheid van hoogwaardige bindingreagentia te karakteriseren en moduleren eiwitten is essentieel voor nieuwe onderzoeks- en therapeutische mogelijkheden openen. Antilichamen blijven van cruciaal belang voor zowel de academische en industriële onderzoekers als fundamenteel onderzoek en diagnose-instrumenten en mogelijke therapieën te zijn. Niet verrassend, is er sprake van een indrukwekkende groei van het contract antilichaam-ontwikkeling bedrijven, waarvan de meeste vertrouwen op conventionele hybridoma- technologieën om aangepaste antilichamen te genereren. Niettemin, in vitro selectie met behulp van faag....

Protocol

1. Antigen Generation

OPMERKING: Antigen domeinen kunnen worden gesynthetiseerd en gekloneerd door een verscheidenheid van commerciële leveranciers in een geschikte IPTG-induceerbare expressie construct.

1. Conversie-expressie constructen in chemisch competente, T1-faag bestendig, BL21 E. coli cellen door 10 ng coderende DNA in 20 pl 1X KCM op ijs in een 96 well PCR plaat gevolgd door de toevoeging van 20 liter chemisch competente cellen.
2. Incubeer de cel / DNA mengsel op ijs gedurende 20 min bij kamertemperatuur gedurende 10 min en vervolgens op ijs opnieuw gedurende 2 minuten voor het redden met 100 ul voorverw....

Results

Is gebruikt De hierin beschreven protocol antilichaam-fragmenten van verschillende zowel qua structuur en functioneel gerelateerde antigen domeinen van combinatorische faag gepresenteerde Fab databanken parallel. Problemen gerelateerd antigeen beschikbaarheid kan worden omzeild, vaak door in silico identificatie van expressie antigen domeinen die geschikt zijn voor antilichamen selectie ²³ zijn. Door het koppelen antigeenexpressie antilichaam selectie binnen hetzelfde laboratorium (figuur 1) .......

Discussion

Bij het ​​uitvoeren van in vitro antilichaam selecties, de twee belangrijkste determinanten van selectie succesvol zijn 1) het isoleren van goed gevouwen antigene doelen voor het selecteren op en 2) de beschikbaarheid van een hoge functionele diversiteit antilichaambibliotheek. In veel gevallen kan de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden goed gevouwen, full-length eiwit beperkend. Een benadering voor het overwinnen van deze beperking is om domeinen geïdentificeerd van bioinformatica analyse ²² .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker	Eppendorf	M1282-0004
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system	Anachem Ltd	LIQ-96-200
Microplate shaker	VWR	12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge	Thermo Product	75004525
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer	Biotek	ELX405USD
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot	S&P Robotics
Plastic conical Falcon tube: 50 ml	VWR	21008-178
Plastic conical Falcon tube: 15 ml	VWR	89039-668
Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes	Corning	MCT-175-L-C
96-well/384-well Maxisorp plate	Sigma	M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom deep-well block	Corning	3960
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box	Corning	AXY-MTS-06-C-R-S
Breathable adhesive plate sealing film	VWR	60941-084
REAGENTS
Name	Company	Catalog Number
polyethylene glycol	Bioshop	PEG800.1
yeast extract	Bioshop	YEX401.1
bio-tryptone	Bioshop	TRP402.1
N-Z amine	Sigma	C7290
glucose	Sigma	G8270-1KG
lactose	Bioshop	LAC234
glycerol	Bioshop	GLY001.500
carbenicillin	Bioshop	CAR544.10
kanamycin	Bioshop	KAN201.25
tetracycline	Bioshop	TET701.25
Tween 20	Bioshop	TWN510.500
monobasic potassium phophate	Bioshop	PPM302.1
dibasic sodium phosphate	Anachemia	84486-440
sodium chloride	Bioshop	SOD001.10
potassium chloride	Bioshop	POC308.1
calcium chloride	Bioshop	CCL302.500
magnesium sulphate	EMD	MX0070-1
magnesium chloride	Bioshop	MAG510.500
NH4Cl	Amresco	0621-1KG
Na2SO4	Bioshop	SOS513.500
agar	Bioshop	AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain	Invitrogen	S33102
phosphoric acid	Acros Organics	201140010
lysozyme	Bioshop	LYS702.25
benzonase	Novagen	71205
Triton X-100		Bioshop	TRX506.500
protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11 836 170 001
Ni-NTA resin	Qiagen	1018240
1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml)	NEB	N0315S
HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP).	GE Healthcare	27-9241-01
TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate	KPL	50-76-00
dNTPs	Biobasic	DD0056
Taq polymerase	Genscript	E00007
Exonuclease	GE Healthcare	EZ0073X-EZ
Shrimp alkaline phosphatase	GE Healthcare	E70092Z-EZ