Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode

Summary

Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede _SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.

Abstract

Lipide dubbellaag membranen de plasmamembranen van cellen en definiëren de grenzen van subcellulaire organellen. In de natuur, deze membranen zijn heterogene mengsels van vele soorten lipiden, membraan-gebonden eiwitten bevatten en zijn versierd met koolhydraten. In sommige experimenten, is het wenselijk om de biofysische en biochemische eigenschappen van de lipide bilaag van die van de natuurlijke membraan ontkoppelen. Dergelijke gevallen oproep voor het gebruik van modelsystemen zoals reus vesicles, liposomen of ondersteunde lipide bilagen (SLBs). Arrays van SLBs zijn bijzonder aantrekkelijk voor toepassing bij het aftasten nabootsen cel-cel interacties. Hier beschrijven we een nieuwe werkwijze voor het vormen SLB arrays. Submicron diameter _SiO2 kralen worden eerst bekleed met lipide bilagen bolvormig SLBs (SSLBs) vormen. De kralen worden vervolgens gestort op een scala aan micro-gefabriceerde submicron-diameter microwells. De bereiding techniek maakt gebruik van een "trekker" naar het substraatoppervlak te reinigen, terwijl leaving achter SSLBs die zich hebben gevestigd in microwells. Deze methode vereist geen chemische modificatie van de microwell substraat, noch het bijzonder gericht op liganden op SSLB. Microwells worden bezet door enkele parels omdat de goed diameter is afgestemd op net groter is dan de kraal diameter. Typisch, meer 75% van de putten bezet, terwijl de rest leeg blijven. In buffer SSLB arrays weer stabiliteit op lange termijn van meer dan een week. Meerdere soorten SSLBs kan in een array geplaatst door seriële afzetting en de arrays kunnen worden gebruikt voor detectie, waarvan we aantonen Door die interactie van choleratoxine met ganglioside GM1. We tonen ook dat fosfolipide vesicula zonder kraal ondersteunt en biomembranen uit cellulaire bronnen kunnen bekleed worden met dezelfde methode en celspecifieke membraanlipiden kunnen worden geïdentificeerd.

Introduction

Lipide dubbellaag membranen essentieel die in de natuur. Cellulaire plasmamembranen en organel membranen bestaan ​​uit lipide bilagen die een aantal moleculen die nodig zijn voor het leven nemen. Veel levensverlengende processen plaatsvinden op het oppervlak van cellen of worden gemedieerd door moleculen geassocieerd met lipide bilaag membranen. In feite zijn veel geneesmiddelen doelprocessen of moleculen aangetroffen op of in membranen ^1,2. Het is daarom noodzakelijk om analytisch processen, zoals chemische reacties of niet-covalente binding gebeurtenissen die zich voordoen op membraanoppervlakken onderzoeken. Omdat natuurlijke membranen moeilijk te isoleren en / of interface met sensoren kan zijn, veel onderzoekers in dienst vereenvoudigd model membranen analytische studies uit te voeren. Een aantal model membraansystemen worden beschreven in de literatuur, van grote blaasjes die kunnen tientallen tot honderden micron in diameter liposomen de nanodeeltjes ^3,4. Alternlatief, vlakke lipide bilagen afgezet op vaste dragers, bijvoorbeeld, ondersteund lipide bilagen (SLBs), kan worden gevormd op een aantal verschillende oppervlakken en zijn op grote schaal gebruikt in de biofysische, biochemische en analytische toepassingen ^5. Koppeling SLBs elektrische of optische materialen stelt onderzoek membraan biochemie en biofysica door het gebruik van verschillende analytische technieken. Fluorescentie microscopie ^6, elektrochemie ^{7, 8} optische spectroscopie, scanning probe microscopie ^9, oppervlakte plasmon resonantie ¹⁰ en massaspectrometrie ¹¹ zijn allemaal gebruikt om de structuur en eigenschappen van SLBs bestuderen.

SLB arrays bieden extra flexibiliteit bij het ​​ontwerpen van sensoren voor multiplex assays ^12,13. Andere toepassingen gebruiken SLB arrays om de kruising die zich vormt tussen immuuncellen ¹⁴ na te bootsen. Bereidingswijzen voor SLB arrays hebben varieerde van microfluIDIC benaderingen ¹⁵ aan degenen die fysieke barrières tussen aangrenzende SLB plekken in dienst. ¹⁶ Andere groepen hebben gebruikt drukmethodes ^17, fotochemische patronen ¹⁸ en diverse nanoengineering benaderingen ¹⁹ tot SLB arrays te maken.

In dit artikel en de bijbehorende video tonen we een methode voor het vormen van SLB arrays door het storten van SLB-gecoate SiO ₂ kralen in besteld arrays van microwells ^20. We verwijzen naar de SLB-gecoate SiO ₂ kralen als sferische ondersteund lipidendubbellagen (SSLBs). Deze techniek is een uitbreiding van eerdere werk dat arrays van fosfolipideblaasjes en biomembranen afkomstig van natuurlijke bronnen ^21, waaruit we tonen ook bijvoorbeeld resultaten gemaakt. Andere werkwijzen voor arraying biomembraan deeltjes of blaasjes hebben zich op patronen van specifieke targeting liganden op oppervlakken die associëren met aanvullende liganden die op het blaasje oppervlak. Voorbeelden omvatten biotine-avidine vereniging ^22,23 en DNA hybridisatie regelingen ^24. Onze aanpak vereist slechts een microwell reeks zonder targeting of erkenning groepen nodig. De grootte van SSLBs wordt bepaald door de diameter van de _SiO2 kraal dragers, die lage poly-dispersiteit heeft. Door het afstemmen van de microputjes diameter net groter is dan de diameter SSLB slechts een SSLB regelt in elk microputje. Een poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) zuigmond verwijdert vervolgens van het oppervlak alle SSLBs die niet worden geïmmobiliseerd in microwells. De microputjes en de resulterende SSLB arrays met hoge dichtheid (~ 10 ⁵ SSLBs / mm ²⁾ met 3 urn hart-op-hart afstand en zeshoekige periodiciteit. Door serieel afzetten SSLBs verschillende lipidesamenstellingen, is het mogelijk om multicomponent arrays met willekeurig geplaatste SSLBs maken. Om het registrerende vermogen van SSLB arrays tonen gebruikten we de interactie van choleratoxine (CTx) met ganglioside (GM1) opgenomen in de SSLBs. Metnatuurlijke membraan deeltjes konden we celspecifieke lipiden detecteren multicomponent arrays met membraanmateriaal twee verschillende celtypen.

Protocol

1. Microfabrication van Microwell Array Ondergrond

1. Begin met een 4 inch siliciumwafel 100 nm thermisch gegroeid oxide.
2. Spin SPR-955 0.7 fotolak op de wafer bij 4.000 rpm gedurende 30 seconden.
3. Bak op een verwarmingsplaat bij 115 ° C gedurende 90 sec.
4. Expose fotolak.
   1. Gebruik een masker 1 urn aangebrachte gaten in een hexagonale array met een 3 micrometer periode waarin de matrix omvat een 2 mm x 2 mm gebied te creëren.
   2. Expose wafer in een i-lijn stepper met een stapgrootte van 6 mm en een blootstelling van 200 mJ / cm ^2.
5. Bak op een verwarmingsplaat bij 115 ° C gedurende 90 sec.
6. Ontwikkelen met behulp van een spin ontwikkelaar om 2 plassen CD-26 op de wafer te storten voor een totale ontwikkelingstijd van 90 sec.
7. Grondig spoelen met ultrapuur DI water en droog met _N2.
8. Ets het oxide in een reactief ionen etser gedurende 6 min bij 50 sccm Ar, 25 sccm _CF4 en 50 sccm _CHF3 flovleugel bij een druk van 75 mTorr.
9. Ets silicium in een ICP diepe sleuf reactieve ionen etser gedurende 2 minuten met 63 sccm C _{4F 8,} 27 sccm _SF6, 40 sccm Ar en 10 sccm _O2 stromen onder een druk van 14 mTorr.
10. Spoel in aceton, methanol en isopropanol te verwijderen weerstaan.
11. Breng in een bad van H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ 01:01 gedurende 10 minuten om het oppervlak schoon.
12. Grondig spoelen met ultrapuur DI water en droog met _N2.
13. Stort 1080 Å van Al ₂ O ₃ door atomic layer deposition bij 250 ° C.

2. Bereiding van poly (dimethylsiloxaan) Rakel

1. Indien mogelijk, werken in een cleanroom. Anders werken in het schoonste milieu mogelijk.
2. Het verkrijgen van een plastic petrischaal (of andere schone wegwerp container) met ≥ 13 mm zijden.
3. In dit gerecht, uitgieten 5 g PDMS verharder, gevolgd door 50 g PDMS base agent (of iets met een 01:10 verhouding die meestal zal vullen de petrischaal). Meng grondig met een wegwerp plastic pipet of staaf.
4. Verwijder luchtbellen door het plaatsen van de gemengde PDMS in een kamer met een vacuüm lijn, het toepassen van vacuüm tot bubbels komen uit mengsel (ongeveer 30 min).
5. Indien niet reeds in de petrischaal, giet PDMS petrischaal, het vermijden van creatie van luchtbellen.
6. Cure 's nachts op een kookplaat bij> 50 ° C (hogere warmte minder lang werkt ook).
7. Met nieuwe / schoon scheermesje, knip voorzichtig een rechthoekig stuk ongeveer 2,5 x 2,5 cm, waardoor bovenkant zo schoon mogelijk. Schil met een schone pincet. Snij een rand (tot 1.5 cm) door te drukken op scheermesje in een beweging, aan de bovenkant zo scherp mogelijk te maken (dit zal de rand gebruikt in de rakel proces).
8. Schoon met aceton, methanol, isopropanol, en ultrapuur DI-water, en daarna föhnen met schoon stikstofgas. Bewaren in een schone petrischaal.

3. Bereiding van blaasjes

1. Verzamel lipide voorraadoplossingen van 25 mg / ml ei-fosfatidylcholine (PC) en 1 mg / ml 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) ammoniumzout (Rho-DPPE) in chloroform en een 0,5 mg / ml voorraadoplossing van monosialoganglioside GM1 in chloroform / methanol (2:1 v / v).
2. In een klein glazen flesje maak een mengsel dat resulteert in 97 mol% PC, 2 mol% GM1 en 1 mol% Rho-DPPE door toevoeging 18,9 gl 25 mg / ml PC, 39,6 gl 0,5 mg / ml GM1 en 7,9 pl 1 mg / ml Rho-DPPE met glazen spuiten.
3. Opmerking:. Het aanvullend materiaal voor Nair et al. ²⁵ bevat een uitstekend aanpasbare Excel-spreadsheet voor de berekening van de bedragen van de lipiden die nodig is om blaasjes van een gewenste samenstelling te creëren.
4. Plaats flacon in een vacuümexsiccator en verwijder het oplosmiddel door waarbij de flacon onder vacuüm gedurende 6 uur.
5. Voeg een waterige oplossing van 0,1M NaCl. Voeg 0,5 ml van de 0,1 M NaCl-oplossing aan de flacon met de gedroogde lipide film.
6. Laat de waterige lipide mengsel een nacht rusten.
7. Kort Vortex een vesicle suspensie te maken, dan ultrasone trillingen gedurende 20 min in een badsonicator bij kamertemperatuur.
8. Extrusie van de vesicle suspensie door een polycarbonaat membraan met 100 nm poriegrootte. Passeer het blaasje schorsing door het filter 17x.
9. Bewaar de geëxtrudeerde blaasjes in een glazen flesje bij 4 ° C.

4. Vorming van Sferische Ondersteunde lipidendubbellagen

1. Verzamel 700 nm diameter SiO ₂ kralen. De kralen worden in gedestilleerd water met een voorraad concentratie van 1,4 x 10 ¹¹ kralen / ml.
2. In een 1,5 ml Eppendorf buisje stelt een 1 ml kraal suspensie met een concentratie van 1,5 x 10 ¹⁰ kralen / ml door toevoeging van 107 ul van kralen stockoplossing aan 893 ui 0,1 M NaCl.
3. Vortex de schorsing om te verzekeren het goed mixed.
4. Centrifugeer de suspensie bij 1700 xg gedurende 20 min gooi het supernatant daarna. Resuspendeer de kralen in 1 ml 0,1 M NaCl. Herhaal deze stap tweemaal om de kralen grondig te wassen.
5. De SSLBs vormen, in een 1,5 ml Eppendorf tube 25 ul van de _SiO2 kralensuspensie 200 ui 1 mg / ml vesicle suspensie. Vortex het mengsel en laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. In dit stadium moet de SSLB concentratie 1,7 x 10 ⁹ SSLBs / ml.
6. Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 20 min aan de SSLBs pellet. De pellet moet roze verschijnen als gevolg van het scheuren van vesicles met Rho-DPPE op de kralen.
7. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 225 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH = 7.4. Herhaal de stappen 4,6-4,7 nog twee keer aan een unruptured blaasjes uit de SSLB schorsing verwijderen.

Vergadering van SSLB Array 5.

1. Cleave wafer van microwell arrays resulteert in rechthoekige stukken met 4-6 micRowell arrays per stuk.
2. Vortex meng de SSLB schorsing, dan plaats 10 ul van SSLB schorsing voor elke microwell array. Lest rust gedurende 1 uur te laten SSLBs om zich te vestigen aan de oppervlakte.
3. Was voorzichtig de microwell serie chip met PBS uit een spuitfles, vervolgens onder te dompelen in een bad PBS bereid in een ondiepe schaal.
4. Terwijl ondergedompeld, plaats voorzichtig het PDMS zuigmond flush op de microwell serie chip en schuif deze langs de oppervlakte 5x om SSLBs die niet worden geïmmobiliseerd in microwells verwijderen.
5. Pak de microwell-array chip met een pincet en schud in de PBS bad om overtollig SSLBs verwijderen.
6. Verwijder snel de chip uit het bad rakel en plaats in een frisse PBS bad tot verder gebruik. Zorg ervoor dat de bovenkant van de chip natte aan de SSLBs behouden blijft.

Opmerking: Het samenstel hierboven beschreven werkwijze kan worden gebruikt om arrays van natuurlijke membraan deeltjes creëren, zoals myeline deeltjes geïsoleerd uit muizenhersenen of phospholipid blaasjes zonder de SiO ₂ kraal ondersteunt. Dit werk is beschreven in Wittenberg et al.. ²¹ en representatieve resultaten worden hieronder getoond.

6. Choleratoxine Bindingsassay

1. Bereid een 2 mg / ml oplossing van runderserumalbumine (BSA) in PBS.
2. Bereid een oplossing met de gewenste concentratie van Alexa 488-geconjugeerde cholera toxine B-subeenheid in PBS met 2 mg / ml BSA.
3. Verwijder de SSLB matrix chip van de PBS bad en lont weg het grootste deel van de PBS-oplossing met behulp van een laboratorium te vegen. Vertrekken net genoeg PBS op de chip te houden van de SSLB matrix gehydrateerd.
4. Om niet-specifieke binding te voorkomen, voeg 200 ul van 2 mg / ml BSA oplossing voor de SSLB matrix chip. Laat gedurende 1 uur in een vochtige doos rust.
5. Met een micropipet, verwijdert 200 pi oplossing van de bovenkant van de SSLB matrix chip.
6. Voeg 200 ul van cholera toxine oplossing voor de SSLB matrix chip en laat rusten gedurende 1 uur in een vochtige doos.
7. Was voorzichtig de SSLB serie chip met PBS uit een spuitfles aan een ongebonden cholera toxine te verwijderen.
8. Wick overtollige PBS met behulp van een laboratorium te vegen. Voordat beeldvorming deksel chip met een 24 mm x 40 mm dekglas.
9. Afbeelding arrays met een rechtopstaande microscoop met filter sets geschikt voor de fluoroforen van belang.
10. Analyseer de fluorescentie-intensiteit van individuele SSLBs in een array met behulp van de geautomatiseerde analyse van deeltjes in functie van ImageJ software.
11. Compileren gemiddelde fluorescentie-intensiteit van individuele SSLBs in histogrammen dat de intensiteiten van SSLBs gevonden op een bepaalde serie te vatten.

Results

Als _SiO2 korrels worden gemengd met een oplossing van vesicles bestaande uit fosfolipiden, fluorescente lipiden en andere lipiden zoals gangliosiden, de vesicles scheuren op de _SiO2 kraal oppervlakken SSLBs vormen, zoals schematisch weergegeven in figuur 1a. Na het wassen van de SSLBs, is een druppel SSLB oplossing geplaatst op een microwell array, en de kralen zijn bezinken naar de oppervlakte. (Figuur 1B1) Dit kan ook worden gedaan met een suspensie van fosfolipi...

Discussion

In dit werk wordt aangetoond dat monodisperse _SiO2 kralen bekleed met ondersteunde lipide bilagen kan worden bekleed in microwell arrays zonder dat targeting liganden op lipide dubbellagen of het substraatoppervlak, en de arrays kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van toxine-lipide interacties. De dissociatieconstante we berekend CTx/GM1 binding steekt gunstig, gezien de grote verschillen van waarden in de literatuur, een eerder rapport van Winter et al.. Waar colloïdale samenvoegen van li...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 inch silicon wafers	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer	MicroChem	CD-26
i-line stepper	Canon	2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher	Plasma Therm	SLR-770
Atomic layer deposition system	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt	Avanti Polar Lipids	810158C
Monosialoganglioside GM1	Avanti Polar Lipids	860065P
Silica beads	Bangs Laboratories	SS03N/4666	De verpakking op de beade container geeft aan dat de korrels 900 nm in diameter zijn. Na lichtverstrooiing en elektronenmicroscopie hebben we echter vastgesteld dat de korrels ongeveer 700 nm in diameter zijn.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugaat	Molecular Probes	C-34775
Anti-oligodendrocyten antilichaam IgM O4, NorthernLights 557-conjugaat	R&D Systems	NL1326R
FM1-43	Molecular Probes	T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge	Fisher Scientific	05-401-09