Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Samenvatting

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Samenvatting

Poxviruses zijn een familie van dubbelstrengs DNA-virussen die actieve menselijke ziekteverwekkers zoals monkeypox, molluscum contagiousum en Contagalo virus bevatten. De familie omvat ook het pokkenvirus, Variola. Vanwege de complexiteit van pokkenvirus replicatie, veel vragen blijven over hun genexpressie strategie. In dit artikel beschrijven we de beeldvorming en het gebruik van recombinante vaccinia virussen die real-time meting van enkelvoudige en meervoudige stadia van virale genexpressie in een high-throughput laat toe. Dit wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van spectraal verschillende fluorescente eiwitten reporters voor elk van de drie stadia van virale replicatie. Deze virussen zorgen voor een hoge signaal-ruisverhouding tijdens stadium specifieke expressiepatronen, zodat plaat gebaseerde testen en microscopische observaties van virusvermeerdering en replicatie behouden. Deze instrumenten hebben toepassingen voor antivirale ontdekking, studies van de interactie tussen virus en gastheer, en evolutionaire biologie.

Inleiding

Traditioneel wordt virusexpressievectoren bestudeerd met behulp van moleculair biologische technieken (bijvoorbeeld Northernblotting, western blotting, microarray hybridisatie, etc.) ^1. Hoewel deze methoden kunnen gedetailleerde informatie betreffende categoriseren expressie veranderingen van afzonderlijke mRNA of eiwitten zijn, zijn ze meestal niet ontvankelijk voor real-time en high-throughput processen. Alternatieve benaderingen met behulp van fluorescentie gebaseerde reporters zijn eerder toegepast bij het werken met poxviruses; echter, is hun ontwikkeling en gebruik ingegeven door gevarieerde doelstellingen. Verschillende van dergelijke werkwijzen zijn ontwikkeld voor de selectie van recombinante virussen ^2,3. Deze technieken uiten EGFP op een correcte integratie en expressie van exogeen DNA van recombinant vaccinia klonen. Ook verscheidene vaccinia stammen die stabiel EGFP oplosbaar of GFP-gemerkte eiwitten tot expressie gebracht onder een natieve vaccinia promoter zijn op grote schaal gebruikt. Deze zijn typtisch gebruikt om virus entry en replicatie tijdens antilichamen gebaseerde neutralisatiebepalingen, chemische remming, of vergelijking van antivirale effectiviteit ^4-6 kwantificeren. Hoewel deze virussen nuttig zijn gebleken, zijn zij beperkt in hun vermogen om gedetailleerde informatie over de bijzondere inhibitie door het gebruik van een dubbelzinnige vroege / late virale promoter. Vorige werkwijzen hebben ook gebruik van EGFP eiwit met suboptimale signaal-ruis-eigenschappen.

Vanwege de complexiteit van pokkenvirus replicatie en het ontbreken van bestaande hulpmiddelen beschikbaar om real-time veranderingen in virale genexpressie assay, hebben we een reeks van een of meerdere stage reporter ^7,8 virussen ontwikkeld. Zoals beschreven in eerdere publicaties, deze virussen uiten een, twee, of drie spectraal verschillende fluorescerende eiwitten uit autochtone vaccinia initiatiefnemers tijdens de vroege, midden of late stadia in infectie. Deze virussen kunnen onsed als indicatoren van het virus replicatie vooruitgang met behulp van een fluorescentie microscoop en ze zijn even goed geschikt voor high-throughput plaat-en-reader gebaseerde testen. Deze virussen zijn makkelijk te gebruiken in plaats van wild type virus, groeit met vergelijkbare kinetiek gelijkwaardige titers ⁷ bereiken. Bij de planning en het creëren van deze virussen is veel zorg besteed aan het selecteren van fluoroforen die hoge signaal-achtergrond kenmerken met superieure vouwen efficiëntie betrouwbare kwantificatie met snelle feedback aan veranderingen in expressie (Venus, mCherry en TagBFP) vergemakkelijken. Bovendien, combinaties van virale promotors werden gekozen die high fidelity, eenduidige fase-specifieke expressie, het verstrekken van informatie over het volledige scala van vroege (C11R promotor), intermediair (G8R promotor) en late (F17R promotor) genexpressie te produceren, in tegenstelling tot dubbelzinnige vroege / late promoters.

Deze virussen kunnen worden gebruikt als instrument voor INVEstigating de levenscyclus van de prototypische pokkenvirus, vaccinia virus. Veel is nog niet bekend over de host-virus interactie ondanks de lange geschiedenis van de studie. Vaccinia is complex, productie van meer dan 200 unieke eiwitten, waarvan vele zijn immunomodulerende en gastheer antagonistische. Na infectie begint vacciniavirus onmiddellijk vroege mRNA transcriptie. Dit wordt vergemakkelijkt door een RNA-polymerase en transcriptiefactoren die op het virale genoom werden geladen tijdens virion verpakking en vastgehouden in een onderbroken toestand tot daaropvolgende infectie. Deze vroege uitdrukking produceert eiwitten vereist voor het onderdrukken van de gastheer immuunsysteem (mRNA decapping, dsRNA opslag en decoy receptor eiwitten alsook remmers van apoptose, stressrespons en Toll, IL en NF-KB-signalering) en genoom replicatie. Vroege uitdrukking produceert ook transcriptiefactoren die nodig zijn voor intermediaire expressie. Intermediate meningsuiting de expressie van late stadium transcriptiefactoren. Dezeexpressie cascade leidt tot productie van structurele en enzymatische virus eiwitten tijdens de late stadia van de infectie, die noodzakelijk zijn voor volledige assemblage van het rijpe virion vaccinia.

Onze reeks van fluorescerende reporter virussen zorgt voor een snelle vooruitgang wordt geboekt in het begrijpen van pokkenvirus biologie. Een van de meest voorkomende en tijdrovende methoden op het gebied van de virologie is de groei assay. Dit betekent meestal infecteren cellen vaststelling van een reeks behandelingen, oogsten virus door geïnfecteerde cellen lyseren en kwantificeren van de virale titer verkregen door plaque assay. De reporter virussen beschreven maakt real-time meting van de virusgroei die gemakkelijk kunnen worden getest en vergeleken tussen talrijke behandelingen parallel uitgevoerd. Wij voorzien deze set reagentia worden gebruikt in verschillende protocollen voor het identificeren van veranderingen in virale genexpressie in respons op behandeling met geneesmiddelen, RNAi knockdown, of host range beperking.

Deze methode maakt het ook mogelijk hoge inhoudsanalyse op grotere schaal dan voorheen beschikbaar, waardoor voor high-throughput anti-virale medicijn schermen voor specifiek omschreven doel fasen van belang. Terwijl talrijke potentiële behandelingen pokkenvirus infectie bestrijden zijn geïdentificeerd, het enige door de FDA goedgekeurde therapie effectief voor de behandeling pokkenvirus infectie het acyclische nucleoside fosfonaat, cidofovir, en behandeling met vaccinia immunoglobuline ^9,10. Ondanks de uitroeiing van pokken in 1977 ^11, poxviruses blijven een belangrijke bedreiging voor de gezondheid van de mens ^12. Stopzetting van wijdverbreide vaccinatie tegen variolavirus heeft geleid tot een verhoogde gevoeligheid voor andere pokkenvirussen ^13. Bijvoorbeeld, zijn de regio's van Centraal-Afrika eerder door vaccinatie beschermd ervaren van een stijging van de Apenpokken virusinfecties ^14. Belangrijke zorg is ookgeuit over de latente gevoeligheid voor opzettelijke vrijlating van variolavirus. Vanwege de beperkte therapieën die momenteel beschikbaar zijn, is er een dringende behoefte aan ontwikkeling van nieuwe behandelingen. Deze verslaggever virussen toestaan ​​snelle en high-throughput klein molecuul-remmer screening op remming van een specifieke fase van virale replicatie. Identificatie van remmers die virale uitdrukking stadia richten momenteel niet het doelwit van remming zal de ontwikkeling van combinatietherapieën vergemakkelijken met een verhoogde potentie.

Er kan veel worden afgeleid over vacciniavirussen celbiologie door het observeren van veranderingen in elke fase van de genexpressie. Verzwakking door chemische of genetische manipulatie van een geïnfecteerde gastheercel wordt typisch uitgedrukt als de virale titers. Echter, door veranderingen in elke fase van de virale expressie cascade vergelijken, kan een vollediger begrip van hoe virus fitness effect is te vindened door een bepaalde behandeling. Deze gegevens zijn getoond om goed correleren met de traditionele virustiter uitgang, maar meer gedetailleerde mechanistische informatie en high throughput mogelijkheden ^7.

Protocol

1. Plate Cellen

1. Distantiëren HeLa-cellen van de plaat en verdund in kweekmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) tot ongeveer 2,0 x 10 ⁵ cellen / ml. Pipetteer 100 ul / putje in een zwarte wanden, duidelijke platte bodem 96-well platen (20.000 cellen / putje).
2. Incubeer cellen gedurende 24 uur tot confluent in een 37 ° C incubator + 5% _CO2.

2. Cellen infecteren

1. Verdun virus en cellen infecteren.
   1. Dooi TRPV (Triple virus; Vroege Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) en PLV (Promotor-minder Venus) TL-virus en splitsen met behulp van sonicatie gedurende 5 minuten. Alternatief kan ruw virusvoorraden worden 1:1 gemengd met 0,25 mg / ml trypsine in infectie media en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
   2. Verdunnen ruwe virusvoorraden in 37 ° C infectie media (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Voor hoge MOI infecties (10 PFU / cel), vul virus voorraad tot 1,0 x 10 ⁷ PFU / ml veronderstelling 5 x 10 ⁴cellen / putje en een inoculum volume van 50 pl. Plan infecteren 3 herhalingsputjes voor elke behandeling met TRPV en nog 3 herhalingsputjes voor dezelfde behandeling PLV om rekening te achtergrondfluorescentie specifiek voor elke behandeling.
   3. Infecteren putten door toevoeging van 50 ul / putje verdund virus infectie media. Dit wordt gedefinieerd als de tijd = 0 uur na infectie (0 hpi).
2. Verdun gewenste behandeling stoffen in infectie media. Voor alle behandelingen een enkel 2x master mix verdunning moet worden gemaakt en toegepast op bronnen (bv. 350 ul totaal volume voor zes 96-putten met 50 pi elk) repliceren.
   1. Verdun experimentele verbindingen in infectie media.
   2. Verdun voertuig controle oplosmiddel (bijv. PBS, DMSO) in infectie media. Opmerking: Vergelijkbare uiteindelijke concentraties van voertuig-control oplosmiddelen worden gebruikt, zoals toegepast voor experimentele verbindingen (bijvoorbeeld als je IBT voorraad is gemaakt met DMSO en gebruikt bij een uiteindelijke concentrations van 1 pi / ml, vervolgens alleen DMSO bij 1 ul / ml als voertuig controle).
   3. Verdun control stoffen in infectie media. Aanbevolen control verbindingen omvatten: 3,6 pM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (AraC), 50 uM (11,7 ug / ml) isatine β-thiosemicarbazon (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampicine, of 5 uM (1.9 ug / ml) ST-246 ^8,15,16. Zie Representatieve resultaten voor de verwachte effecten. Opmerking: maken deze verdunning tweemaal (2x) de gewenste eindconcentratie aangezien dit in de verhouding 1:1 wordt toegevoegd om het volume reeds in de put.
3. Onmiddellijk na de toevoeging van het virus, voeg 50 ul infectie media die gewenste behandelingen en controles als verdund in stap 2.2. Opmerking: Voor het analyseren van de remming voordat vroeg stadium uitdrukking, verbinding (s) kan direct worden toegevoegd aan de verdunde virusinoculum (stap 2.1.2) of aan gastheercellen vóór infectie (vóór stap 2.1.3).
4. Incubeer 6-24 uur in een 37 & #176, C incubator + 5% _CO2.

3. Fix Cells

1. Fix cellen door het toevoegen van 100 pi 8% paraformaldehyde om besmetting media reeds in elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min beschermd tegen licht. Opmerking: Het wordt aanbevolen om 2x PFA (8%) rechtstreeks aan infectie media aan aerosolization van besmettelijke vaccinia die kan optreden voorkomen als een hoge-titer media rechtstreeks wordt omgekeerd in afval schaal voorafgaand aan de fixatie.
2. Verwijder fixatief door het omkeren plaat in het afval gerecht.
3. Voeg 100 ul van PBS kamertemperatuur.
4. Seal plaat met optisch heldere zelfklevende folie. Opmerking: Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C als niet onmiddellijk lezen. Zorg ervoor dat u verzegelde platen op kamertemperatuur komen vóór het lezen om condensvorming te voorkomen vervormen spectrofotometer metingen.

4. Kwantificeren Virus Growth

1. Meet eindpunt fluorescentie bij 515:530 voor Venus, 587:610 voor mCherry en 415:457 fof TagBFP (Opwinding: Emissie golflengte in nm). Vier metingen moeten worden gemiddeld per putje met behulp van geoptimaliseerde gain-instellingen voor elk kanaal. Opmerking: de juiste emissie golflengte kan verschillen, afhankelijk van het specifieke model en filter kenmerken van uw bord lezer. Dit kan empirisch worden bepaald door het uitvoeren van een emissiegolflengte scan tot het punt waar het grootste verschil tussen TRPV en PLV voor elk kanaal te bepalen.
2. Normaliseren van de ruwe data om een ​​vergelijking tussen experimenten te vergemakkelijken.
   1. Voor elk kanaal, bepalen het gemiddelde van repliceren TRPV en PLV putten.
   2. Trek de gemiddelde PLV-geïnfecteerde achtergrond metingen van de gemiddelde TRPV-geïnfecteerde experimentele metingen voor elke behandeling.
   3. Normaliseren van de gegevens die door elke achtergrond afgetrokken waarde te delen door het enige voertuig waarde ook.
   4. Zodra een experiment is meerdere keren, een one-way variantie-analyse (one-way ANOVA) testen en meerdere c herhaaldERGELIJKING post-test kan worden uitgevoerd om te bepalen of een van de behandelingen geeft een statistisch significant verschil met het enige voertuig behandeling voor elk kanaal.

. 5 Alternative Protocol: Kinetic plaatanalyses

1. Voer alle stappen door toevoeging van behandelingen (stap 2.3).
2. Seal plaat met zelfklevende folie en plaats in plaataflezer kamer evenwicht gebracht tot 37 ° C. Opmerking: Speciale zorg moet worden genomen om platen constant te houden bij 37 ° C tot onnodige cel stress en condensatie te voorkomen. Voor kinetische testen, is het bijzonder belangrijk om een gebufferd medium (natriumbicarbonaat en HEPES) om juiste pH te handhaven zonder toevoeging van 5% _CO2.
3. Set plaataflezer krijgen handmatig verzadiging van latere tijdstippen te voorkomen. Opmerking: Accurate winst optimalisatie kan worden verkregen door het uitvoeren van een eindpunt assays onder vergelijkbare omstandigheden.
4. Acquire per uur lezingen voor 8-24 hpi en normaliseren met behulp van simiLAR-procedure zoals in eindpuntassay (stap 4.2).
5. Individuele tijdstippen worden geanalyseerd op statistische significantie met vergelijkbare werkwijzen als eerder beschreven eindpunt assay.

Resultaten

Als voorbeeld van de typische gebruik van deze virussen, werd de drievoudige fluorescentie-reporter virus gebruikt voor het vergelijken van de plaats van remming van een aantal goed gedefinieerde pokkenvirus remmers.

HeLa-cellen werden uitgeplaat in weefselkweek behandelde zwarte wanden duidelijke platte bodem 96-well platen en overnacht geïncubeerd. Confluente monolagen werden geïnfecteerd bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 met behulp van drievoudige reporter virus (TRPV,

Discussie

Hier hebben we het praktisch gebruik van een multi-stage vaccinia reporter virus (TRPV), die reproduceerbaar, real-time feedback maatregelen virus replicatie biedt beschreven. Door het gebruik van goed gedefinieerde pokkenvirus remmers, waren we in staat aan te tonen dat TRPV reageert op een wijze die in overeenstemming met de begrepen werkingsmechanisme voor elke remmer. Terwijl de TRPV virus biedt de meest uitgebreide informatie over virus fase progressie tweetraps (iRev, LREV) en eentraps (ES, IV, LV) virussen kunnen...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070