Methodenartikel

Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa

16.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51546

⸱

30 december 2014

 ,  ,  , 
1School of Environmental and Life Science, University of Newcastle, 2Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

In dit artikel

Samenvatting

Proteomische analyse van elk celtype is sterk afhankelijk van zowel de zuiverheid als de pre-fractionering van het uitgangsmateriaal om het monster te de-complexificeren vóór vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (MS). Door gebruik te maken van back-flushingtechnieken kunnen pure spermatozoa worden verkregen van knaagdieren. Na vertering kunnen fosfopeptiden worden verrijkt met behulp van TiO2.

Samenvatting

Spermatozoa zijn uniek onder celtypen. Hoewel geproduceerd in de testis, zowel nucleaire gen transcriptie en translatie worden uitgeschakeld zodra de pre-cursor ronde cel begint te verlengen en te differentiëren in wat morfologisch erkend als een zaadcel. Echter, de zaadcel zeer onrijp, zonder mogelijkheid voor motiliteit of eieren herkenning. Beide gebeurtenissen zich voordoen zodra de spermatozoa doorvoer een secundaire orgel bekend als de bijbal. Tijdens de ~ 12 dagen passage dat het duurt voor een zaadcel om door de bijbal passeren, post-translationele modificaties van bestaande eiwitten spelen een centrale rol in de rijping van de cel. Een belangrijk facet van dergelijke is eiwitfosforylatie. Om fosforylering gebeurtenissen tijdens spermarijping karakteriseren moeten zowel zuivere zaadcel populaties en pre-fractionering van fosfopeptiden worden vastgesteld. Met terugspoeling technieken, een methode voor het isoleren van zuivere spermatozoa of hoge kwaliteit en opbrengst van de distale of caudale epididymides wordt geschetst. De stappen voor solubilisatie, spijsvertering en pre-fractionering van sperma fosfopeptiden via TiO2 affiniteitschromatografie toegelicht. Eenmaal geïsoleerd, kan fosfopeptiden worden geïnjecteerd in MS zowel proteïne fosforylatie gebeurtenissen van specifieke aminozuurresiduen de niveaus van fosforylatie plaatsvindt tijdens de spermarijping processen te identificeren en te kwantificeren.

Inleiding

Na voortgekomen uit de testis worden spermatozoa gedifferentieerde nog opmerkelijk, deze cellen onvolwassen 1,2. Als zodanig zijn ze missen complete functionaliteit, zoals de mogelijkheid om te zwemmen en binden aan een oöcyt 3. Hoewel verdere rijping van de zaadcel vereist, kan deze niet plaatsvinden via canonieke routes, aangezien in deze fase van hun mobiele differentiatieproces, ze niet in staat zijn gentranscriptie en andere eiwit biosynthese 4. Biologische bevoegdheid aan spermatozoa verleend zij de testis verlaten en een deel van het mannelijke voortplantingssysteem zogenaamde bijbal 5. De bijbal is een strak opgerolde, zeer gedifferentieerde buis die de efferente leidingen (van de testis) wordt aangesloten op de zaadleider en is aanwezig in alle mannelijke zoogdieren 6 is. Spermatozoa geleidelijk tijdens epididymaire afdaling hun bemesten potentieel te verwerven, met een beroep op de steeds veranderende luminale omgeving die crat 's avonds door de lokale epididymaire epitheelcellen 7. De diverse secretoire en re-absorberende activiteiten aanwezig in de epididymis milieu handeling aan het sperma zelf te wijzigen, zijn eiwitten, koolhydraten en lipiden 6 veranderen. Het belang van de epididymis, meer bepaald de aanvankelijke 'caput' gebied van deze structuur is geïllustreerd middels chirurgische ligatie technieken 8. Spermatozoa behouden binnen de testis door efferente duct ligatie worden volledig ontbreekt in welke hoedanigheid om de eicel te bevruchten 9-11.

Naast de epididymis milieu, signaaltransductieroutes in de spermatozoa werk post-translationeel de bestaande zaadcel complement wijzigen. Bijvoorbeeld spermatozoa van de vroege regio van de bijbal tonen verschillende patronen eiwit fosforylering vergeleken met die laatste regio 5,12. Dit is niet verrassend aangezien er grote verschillen in de capability van het sperma van deze regio's. Bijvoorbeeld, spermatozoa uit het begin, caput bijbal zijn immotilite. Daarentegen zal zaadcellen de cauda regio vooruit vertonen progressieve beweeglijkheid eenmaal geplaatst in isotoon medium. Aangezien epididymale zaadcellen in staat de-novo proteïne biosynthese, moeten alle intrinsieke routes reguleren spermafunctie worden door post-translationele modificaties (PTM). Daarom ligt het voor dat proteomics redeneren, en in het bijzonder het onderzoek van PTMs zoals fosforylering een speerpunt moeten zijn als we zijn om sperma celrijping begrijpen.

Een alternatieve methode om spermatozoa te verkrijgen van de epididymidies gebruik retro-terugspoelen 13-16. Hoewel deze techniek is zeker tijdrovend en draait grotere actie van de operator, de spermatozoa verkregen vaste tonen zuiverheid van meer dan 99,99%. In tegenstelling tot alle andere technieken, spermatozoa can afzonderlijk in een rusttoestand, waardoor het mogelijk om te bestuderen hoe spermamotiliteit geïnitieerd. Als monster voorbereiding is het belangrijkste aspect voor proteoomanalyses isolatie van spermatozoa is uitgegroeid tot één van de belangrijkste aspecten van het sperma-proteomics studies. Dit protocol geeft een uitleg over hoe spermatozoa worden geïsoleerd van de cauda epididymis. Hierna wordt de TiO 2 fosfopeptide verrijkingsprocedure geschetst, met een specifieke verwijzing over hoe peptiden te extraheren uit de zeer gedifferentieerde zaadcellen. De MS benadering kan worden aan veranderende fosfopeptiden onderscheiden wanneer men de caudale epididymis spermatozoa vergelijken op een toestand (immotile of niet capacitated) naar een andere (beweeglijke, capacitated, acrosome gereageerd, etc.) waardoor dit een krachtige aanpak om sperma te bestuderen functie.

Protocol

1. Voorbereiding van Cultuur Media en Schotels

  1. Maak 200 ml Biggers Whitten en Whitten (BWW) 17 werkende oplossing door het toevoegen van 5,54 g NaCl, 0,356 g KCl, 0,25 g CaCl2, 0,162 g H 2 KO 4 P, en 0,294 g magnesiumsulfaat 4-1 L van Milli-Q water . Dit is de voorraadoplossing en kunnen bij 4 ° C worden bewaard tot een maand.
  2. Uit de stockoplossing, voeg 420 mg NaHCO3 - 200 mg glucose, 6 mg natriumpyruvaat, 600 mg runderserumalbumine, 0,74 ml natrium lactaat, en 4,0 ml HEPES-buffer met 193 ml van de BWW voorraad. Dit is de werkoplossing en altijd vers op de dag gedaan en geëquilibreerd tot 37 ° C voor gebruik.
  3. Om de canule te nemen polyethyleen (PE) buis met een inwendige diameter van 0,4 mm en een uitwendige diameter van 1,1 mm en bezit laag vuur (typisch methanolvlam) zodat de buis begint te smelten. Trek onmiddellijk de slang outward te rekken en maken de buitendiameter smaller.
  4. Snijd een vernauwing van één einde waardoor gemakkelijker canulatie van de vas deferens produceren.
  5. Snijd het andere uiteinde van de canule tot ongeveer 15 cm. Plaats een 30 G naald in de stomp uiteinde, en bevestig een 3 ml spuit om het (volledig ingetrokken).
  6. Maak een zuig mondstuk door het snijden van een 20 cm lengte van de PE buis (4,2 mm inwendige diameter, 6,4 mm buitendiameter). Plaats een mondstuk in het ene uiteinde.
  7. Plaats de micro-capillaire glazen buis houder en de glazen micro-capillaire zelf (gewoonlijk 3 ui van een muis, 40 ui voor een rat).

2. Verwijdering van epididymides van Mouse

  1. Euthanaseren muizen volgens IACUC-goedgekeurde aan elke instelling procedures.
  2. Neem het dier en maak een kleine incisie in het scrotum naar de bijbal bloot. Trek de testis en epididymis uit de holte met behulp van een paar van horlogemaker's # 5 tang.
  3. Snijd het vas deferens dat ten minste 1-2 cm blijven aan de cauda epididymis. Bovendien, snijd de proximale efferente leidingen en weefsel aansluiten van de bijbal naar de testis en verwijder de hele mannelijke reproductieve spoor.
  4. Plaats het gehele mannelijke reproductieve spoor onder een dissectie microscoop met een vergroting bereik in de orde van 5-40X.

3. cannulating de bijbal

  1. Tape langs de canule om de microscoop, zodat 1-2 cm van de vernauwde (kegelvormige) uiteinde is vrij en zichtbaar door de lens.
  2. Neem een ​​paar horlogemakersgereedschappen # 5 tang en voorzichtig gesp weerszijden van de vas deferens en trek de vas deferens op de canule, zodat de canule gaat in de vas deferens.
  3. Neem een ​​lengte van niet-absorbeerbare zwart gevlochten behandeld zijde (maat 5-0) en legt een knoop rond de gecannuleerd zaadleider. Zorg ervoor dat de knoop is strak getrokken om de canule in de zaadleider te houden wanneer de luchtdruk frOM de injectiespuit wordt toegepast.

4. Retrograde of Backflushing van Caudale Epididymal Spermatozoa

  1. Met behulp van horlogemakers # 5 tang, pak het distale einde van de cauda epididymides en verwijder de tunicaalbuginea om één epididymis tubulus bloot.
  2. Met behulp van de tang, trek de tubuli te belichten en plagen elkaar teneinde een opening te creëren voor sperma vrijkomen.
  3. Druk voorzichtig op de 3 ml (muis) of 20 ml (rat) spuit zodat lucht uit de spuit in de zaadleider. Bij de juiste druk wordt spermatozoa beginnen uit de gebroken tubulus langzaam komen aan het distale uiteinde van de cauda epididymis. Op dit moment afzuigen op het mondstuk om spermatozoa te trekken in de glazen capillair. Opmerking: doorgaans in een muis, kan 2-3 gl spermatozoa verkregen worden afhankelijk van de leeftijd van het dier. Een rat wil, op de gemiddelde opbrengst 30-40 pi.

5. Wassenen lyseren van de spermatozoa in de voorbereiding voor Proteomics

  1. Verdrijf de spermatozoa van de glazen capillair in 1 ml oplossing van BWW-oplossing (37 ° C) door voorzichtig te blazen in het mondstuk of het aanbrengen van een spuit en uitlaatluchtgeleiding teneinde de spermatozoa terug duwen van de capillair.
  2. Zodra de zaadcellen worden verspreid, wassen 3x (300 x g, 5 min) met 1 ml BWW om verontreinigende eiwitten te verwijderen. Na de laatste wasbeurt, verwijder het supernatant. Opmerking: Op dit punt kan de zaadcellen voor later gebruik worden ingevroren.
  3. Oplosbaar eiwit met 4% CHAPS, 2 M thioureum en 50 mM Tris, pH 7,4 gedurende 1 uur met intermitterende vortexen.
  4. Na lyseren van de cellen gecentrifugeerd (10000 xg, 20 minuten), en neemt supernatant naar een nieuwe buis. Opmerking: Op dit punt kunnen eiwit kwantificering worden uitgevoerd.

6. disulfideband Vermindering en Alkylatie

  1. Voeg 10 mM DTT als een uiteindelijke concentratie aan seerde eiwitten, vortaf en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  2. Voeg 50 mM idodoacetamide een uiteindelijke concentratie lysaat, vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker.

7. Neerslag

  1. Methanol chloroform precipiteren het monster door het toevoegen van 1 volume van lysaat (400 pl als voorbeeld), voeg een volume (400 pl) methanol en 0,5 volume (200 pl) chloroform.
  2. Vortex het monster en draaien (10.000 xg, 2 min).
  3. Merk op dat twee fasen worden verkregen na centrifugeren. Gooi alles maar 2 mm van de bovenste laag (zorg dat u de interface van niet te storen).
  4. Voeg 1 volume (400 pl) methanol, invertsuiker buis voorzichtig 1-2x te mengen en opnieuw centrifugeren (10.000 x g, 15 min). Gooi supernatant te verspillen en de lucht drogen pellet voor 3-4 min.

8. trypsinedigestie

  1. Reconstitueren trypsine in 25 mM ammonium bicarbonaat bevattende 1 M ureum tot een verhouding van 50: 1 (W / W, eiwit: trypsine) en geïncubeerd overnight bij 37 ° C bij voorkeur bij 700 rpm op een thermomixer.
  2. Spin (10.000 xg, 15 min) om onverteerde materiaal pellet. Transfer supernatans naar nieuwe buis.

9. fosfopeptide Verrijking

  1. Voer zuivering en verrijking van fosfopeptiden uit het tryptische digest zoals eerder beschreven 18. Verdun tryptische peptiden 10-voudig DHB buffer [DHB buffer bestaat uit: 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic acid (DHB), 80% (v / v) ACN (acetonitril), 2% (v / v) TFA (trifluorazijnzuur acid)] en toepassing drogen TiO2 kralen (200 ug).
  2. Laat op een rotator bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  3. Was het monster met DHB buffer, draaien en verwijder supernatant. Was daarna het monster driemaal met wasbuffer [80% ACN (v / v), 2% TFA (v / v)] om de DHB verwijderen.
  4. Na het centrifugeren, direct elueren de fosfopeptiden via elutiebuffer door toevoeging van 25 pi 2,5% ammoniumhydroxide, pH ≥ 10.5 oplossing. Spin en verwijder het supernatant. Onmiddellijk neutraliseren ~ 0,3 pl mierenzuur.

Resultaten

De kwaliteit van de resultaten van een proteomische analyse sterk afhankelijk van het uitgangsmateriaal. Met de moderne MS, zijn lichte verontreinigingen in monster voorbereidingen gemakkelijk opgepikt. Daarom is het kritisch, bij zaadcel proteomics, een methode zeer zuivere spermatozoa geeft kiezen. Zoals geïllustreerd in figuur 1, wordt retrograde backflushing gebruikt zaadcellen opvragen via het cauda epididymis. Dit houdt cannulating de zaadleider met PE buis waarmee men langzaam toe te passen luchtdruk uit de spuit bevestigd. Figuur 1A toont de cauda epididymis samen met de zaadleider. Figuur 1B is een close-up shot van hoe de zaadleider wordt vastgebonden, waar de canule wordt ingebracht. Hierbij w, spermatozoa worden vrijgegeven op het uitgesneden einde van een buisje uit de caudale epididymides. Zoals getoond in figuur 2A, worden de spermatozoa geëxtraheerd uit de top gebieden van de caudeen epididymis en opgezogen in een glazen capillair in een rusttoestand (figuur 2B). Dit heeft meerdere voordelen boven traditionele "swim-up" methode, niet de minste daarvan is het vermogen om een ​​phoshoproteomic analyse van spermatozoa uitgevoerd vóór en na de activering van motiliteit. De zaadcellen kunnen dan worden uitgestoten in de media van zijn keuze. Figuur 2C (linkerkant) laat zien hoe het sperma direct kijken na uitzetting naar BWW media. Veel van de cellen samen samengeklonterd. Echter, na 10 min de bevoegdheid van de cellen aangetoond omdat ze te zwemmen om de homogeniteit in de oplossing (figuur 2C, rechterzijde cellen). Aangezien het terugspoelen techniek heeft weinig invloed op de zaadcellen, verkrijgen wij bijna 100% motiliteit en de cellen dispergeren snel in de media zonder externe provocatie. In een typisch backflushing experiment, sperma hersteld van de Zwitsers-muis bevattussen 1-5 x 10 6 cellen. Dit is sterk afhankelijk van de leeftijd van het dier en kan variëren van verschillende muizenstammen. In een Noorse rat, we meestal 200 x 10 6 spermatozoa te verkrijgen ± 20%. Figuur 2D geeft de zuiverheid van spermatozoa verkregen door de rat cauda epididymis.

Naast het monster zelf, een van de belangrijkste kwesties met betrekking tot monstervoorbereiding is het rendement van trypsine spijsvertering. Eiwit neerslag speelt een belangrijke rol, niet alleen in het verwijderen van ongewenste detergentia en zouten, die beide onverenigbaar met MS, maar ook eiwitten denatureren. We hebben de methanol-chloroform neerslag het beste te werken gevonden. Niet alleen is deze procedure gemeld lage overvloedige eiwitten beter dan anderen waaronder TCA precipitatie 19 neerslaan, maar heeft extra voordelen. Na TCA precipitatie, is het vaak noodzakelijk om de pH passen na schorsing van de TCA pellet die vrij kan blijvenzuur. Hoewel de neergeslagen pellet van TCA in hoge organische oplossingen kan worden gewassen om het zuur te verwijderen, dit draagt ​​bij aan proeven hanteren en irreproducibility van de resultaten. Als de zuur neutraliseren zal resulteren in slechte tryptische peptide opbrengsten. Methanol-chloroform neerslag is niet alleen snel, maar zal het monster niet verzuren. Figuur 3 illustreert het eiwit pellet meestal gezien van 100 ug van het monster tussen de onderste en bovenste interfase.

De isolatie van fosfopeptiden kan voorkomen in een aantal opzichten; echter reproduceerbaarheid afhankelijk van het monster is behandeld tot en met deze fase. Een van de meest voorkomende, ontwikkelen methoden TiO 2, oorspronkelijk ontwikkeld door de groep Martin Larsen 18,20,21. Hoewel beschreven als een werkwijze voor gebruik in microkolommen, kunnen we reproduceerbare gegevens te verkrijgen via batch chromatografie. Het succes van het proces is sterk afhankelijk van de elutiebuffer, moet die gek e de juiste samenstelling; anders fosfopeptiden geëlueerd niet helemaal.

De reproduceerbaarheid van het protocol en representatieve gegevens van TiO 2 verrijkte fosfopeptiden van cauda epididymis sperma in een onbeweeglijk (figuur 4 boven) en beweeglijk (figuur 4 onder) toestand van m / z 650-670 zichtbaar. We hebben aangetoond dat dit een zeer reproduceerbaar techniek ook bij gebruik van biologische herhalingen 17. De blauwe strepen verschijnen tijd peptiden elueren uit C18 nano-kolom als de concentratie acetonitril toeneemt. Het spreekt voor zich beweeglijke populatie (n = 3 getoond, n = 8 loopt gewoonlijk), is een peptide cluster, met een mono-isotopische massa rond de 651,5 Da bereik dat volledig afwezig in de niet-beweeglijke range. Tandem massaspectrometrie wordt vervolgens gebruikt om het peptide te identificeren.

546 / 51546fig1highres.jpg "/>
Figuur 1:. Canulatie van de cauda epididymis (A) Foto van de cauda epididymis. De canule zelf is vastgeplakt ongeveer 1-2 cm van de pre-getrokken end bloot. Dit wordt in de zaadleider ingevoegd met behulp van fijne # 5watchmakers tang. (B) De canule wordt op zijn plaats gehouden door koppelverkoop fijne zijde rond een segment met zowel de zaadleider en de canule. Uit de muis, ongeveer 2-3 ul caudale epididymale cellen en vloeistof worden verzameld in een concentratie van 1 x 10 6 / ul. Uit de rat (getoond) ongeveer 30-40 pl vloeistof verkregen bij soortgelijke concentraties.

figure-results-1
Figuur 2: Glas capillaire gebruikt om competente epididymaire spermatozoa te verzamelen. (A) Een buisje van de top van de cauda e pididymis is geïsoleerd en gebroken. De geschatte positie van waaruit dit gebeurt wordt getoond. (B) De bovenkant van het beeld toont een leeg glas capillair en de onderste toont één van een eerder teruggespoeld rat. Er is geen bloed besmetting en minimale verontreiniging epitheliale cellen. (C) Aangezien de spermatozoa nog onverdund in de epididymis fluïdum, zijn ze niet beginnen te activeren. Wanneer de spermatozoa in eerste instantie worden uitgestoten in een BWW oplossing, ze komen als een compacte "string" (Linkerkant). De bevoegdheid van de cel wordt eenvoudig ingesteld, want na 10 minuten het grootste deel van de zaadcellen zwemmen in oplossing zonder externe verstoring (aan de rechterkant). (D) Een foto van een monster van caudale epididymaal cellen onmiddellijk nadat ze zijn vertrokken om te zwemmen out toont de zuiverheid van de cellen.

g3highres.jpg "/>
Figuur 3:. Methanol-chloroform precipitatie eenmaal spermatozoa oplosbaar zijn, de oplosbare fractie methanol-chloroform geprecipiteerd denaturatie van de eiwitten en verwijdering van verontreinigende stoffen. De proteïne pellet wordt op het grensvlak tussen de methanol / water en chloroform fase. De bovenste laag wordt voorzichtig verwijderd om niet deze pellet te verstoren. Het is gebruikelijk ongeveer 2-3 mm van de bovenste fase verlaten zodat geen eiwit verloren.

figure-results-2
Figuur 4:. Typische TiO 2 verrijkte fosfopeptide profiel met de beschreven protocol werd caudaal epididymale spermatozoa geïsoleerd in beide immotile (top, N = 3) of beweeglijke toestanden (bottom, N = 3). Een peptide cluster met een mono-isotopische massa van ~ 651,5 Deen wordt aangetroffen in de beweeglijke populaties maar volledig afwezig in de onbeweeglijke die (pijl) zijn. Vergelijkingen van deze aard worden aangeduid als "label-free (MS-gebaseerde)". Het peptide massa en retentietijd worden vervolgens gebruikt om de verbinding van tandem-massaspectrometrie richten en identificeren eiwit waaruit het peptide is afgeleid.

Discussie

De kritische stappen voor een succesvolle en reproduceerbare proteoomanalyse van spermatozoa zijn: 1) de zuiverheid van het uitgangsmateriaal; 2) het verwijderen van ongewenste zouten en wasmiddelen; 3) denatureren eiwitten volle omvang zodat de trypsine om een ​​hoge opbrengst van eiwitten verteren en 4) het minimaliseren monsterbehandeling verlies van peptide verminderen.

Om met succes Backflushing de cauda epididymis, is het essentieel om het gebied waar de spermatozoa verlaat vinden. Bij zowel ratten en muizen, dit is op de top van het concave gebied, in het midden van het caudale deel van de bijbal (zie figuur 2A). Als men gaat verder in de richting van de zaadleider, terugspoelen is makkelijker en het slagingspercentage is over het algemeen hoger. Echter, dit gaat ten verlies van het aantal zaadcellen. Alternatief, als men probeert meer proximaal naar het corpus, dan de hoeveelheid druk vereist om de spermatozoa terug duwen door de epididymAl kanalen is vaak zo groot, dat schade aan de bijbal onvermijdelijk optreedt.

Backflushing van de bijbal wordt traditioneel uitgevoerd met behulp van water verzadigd minerale olie en een gebalanceerde zoutoplossing in de spuit zichzelf als een medium om de spermatozoa 22-25 verwijderen. Beide procedures zijn potentieel problematische van LC-MS. Ten eerste minerale wil de nano-C18 nano-kolommen die in principe wereldwijd gebruikt voor proteoomanalyse en zorg moet worden genomen, zodat er geen voorwaarts in de procedure plaatsvindt blokkeren. Wanneer dit gebeurt, is het onmogelijk worden en het monster in wezen verloren. Dit kan worden ondervangen door het gebruik van BWW of andere gebalanceerde zoutoplossingen in de spuit, maar hoewel dit succes, al snel onderkend dat veel van de spermatozoa worden beweeglijke zodra de BWW oplossing in contact kwam en gemengd met de caudale epididymis cellen. Om dit probleem te omzeilen we gewoon Backflush de spermatozoa met lucht. Niet alleen is de Qualheid van spermatozoa vergelijkbaar is met vloeistof gebaseerde methoden, maar de hoeveelheid is identiek.

Phosphoproteomics is misschien wel een van de weinige manieren om vast te stellen welke signaalwegen die zich in spermatozoa na de ejaculatie. Eén van de belangrijkste wegen onderzoeken we het proces capacitation. Spermatozoa moet ondergaan "capacitation" voordat het kan binden aan een ei. In de praktijk wordt dit in principe bereikt door incubatie spermatozoa voor een tijdsduur (muizen 40 min; rat 1,5 uur; menselijk 3-24 uur) in BWW oplossing serumalbumine. Eerder wij en anderen hebben aangetoond een rol voor verschillende kinasen betrokken capacitation. Van belang, schrapping van de PKA μ II produceren muizen waarvan de spermatozoa zwemmen spontaan in vitro, maar kan hyperactivation 26 niet te ondergaan. De laatste is een kenmerk van capacitation waarbij spermatozoa veranderen zwemmen patroon van een hoge snelheid, lage amplitude, een lagesnelheid, hoge amplitude verslaan frequentie. We hebben laten zien stroomafwaarts kinases betrokken bij dit proces zijn onder pp60-CSRC (SRC) 13,27 c-ja 28 en c-ABL 14. Interessant remming van SRC stopt capacitation-afhankelijke tyrosine fosforylatie 13. Dit kan echter worden overwonnen met okadazuur, suggereert dat SRC is niet direct betrokken bij de algemene begin van tyrosinefosforylering 29 maar kan een fosfatase 29 reguleren. Het probleem met het gebruik BWW als een medium om spermatozoa te dwingen uit de bijbal is dat eenmaal geactiveerd, muis spermatozoa slechts ongeveer 40 min naar capacitate. Omdat isolatie van spermatozoa 5 min / muis en vaak meerdere muizen bij een proef kan nemen, dan spermatozoa wordt in verschillende stadia van rijpheid het begin van het experiment. Om dit te overwinnen, kan luchtdruk worden gebruikt om de spermatozoa uit de caudale bijbal duwen in een glas canule. Niet alleen zijn de zaadcellen Inactive voornamelijk als ze worden gevonden in de caudale milieu, het maakt het mogelijk om niet-beweeglijke en beweeglijke phosphoproteomics vergelijken.

Steekproef hanteren voor phosphoproteomics moet worden tot een minimum beperkt bij het vergelijken van spermatozoa in twee verschillende functionele toestanden. Het gebruik van methanol chloroform boven andere traditionele methoden van eiwitprecipitatie 1) neemt de noodzaak van extra stappen wassen, 2) verwijdert nagenoeg alle sporen van zouten en vetten en 3) een bewezen vermogen lage abundantie proteïnen te precipiteren via TCA 19. Eiwitprecipitatie voor trypsine digestie wordt aanbevolen aangezien niet alleen werkt dit eiwit (dat trypsine digestie hulp) denatureren, maar verwijdert veel van de MS-incompatibele metabolieten in de cel aanwezig.

De vergelijking van sperma fosfopeptiden kan op een aantal manieren. Op basisniveau Een vergelijking van de geïdentificeerde fosfopeptiden in een monster, dat in een anderemonster in het proces dat bekend staat als "spectrale tellen" kan worden gedaan. Maar de kritiek is geweest op deze aanpak voornamelijk omdat vroege proteomics studies werden met behulp van lage herhalingen (Voor een nadere bespreking zie Lundren et al. 30). Een meer verfijnde aanpak is te kijken naar de intensiteit van de peptide ouder massa en vergelijk dit met de andere monsters (label-free vergelijking). In het in figuur 4 kan bijvoorbeeld een peptide afwezig in de uit onbeweeglijk (figuur 4 boven), maar in de beweeglijke (figuur 4 onder) spermatozoa van m / z 650-670 zichtbaar. Dit proces, aangeduid als MS-gebaseerde label vrij kwantificering is een label vrij strategie.

Een alternatieve strategie vaak gebruikt om de hoeveelheid runs nodig proteomische kwantificering verminderen is isotopen gebruiken. Aangezien de massa van een isotoop verschillend kan de massa spectrometer worden gebruikt om de intensiteit van de Elut vergelijkening peptiden. Anders dan de meeste andere celtypes, wat isotopische labeling kan niet worden toegepast op spermatozoa. Bijvoorbeeld, de toevoeging van stabiele isotopen (een zware isotoop wordt toegevoegd aan een monster, terwijl een lichtere versie wordt toegevoegd aan de andere) kan in weefselkweek. Wanneer de isotopen te opgenomen in het eiwit kan een proteomics analyse worden uitgevoerd door combineren van de twee monsters (multiplexing). Echter in het geval van spermatozoa, kan dit niet worden gedaan, louter op grond van het feit dat 1) isotopen vereist aantal passages (tot 8) in weefselkweek en 2) de zaadcellen geen nucleaire gentranscriptie en translatie en dus ze kunnen niet de isotopen in al hun eiwitten op te nemen toch. Een manier om dit is om radioactief gelabelde muizen te bestellen, maar deze zijn berucht duur. Een alternatieve benadering is om een ​​chemische tag. Dit werd gedaan wanneer niet capacitated muizen werden vergeleken met capacitated muizen. In dit geval, een D 0 en D 3 -label werd gebruikt om onderscheid te maken tussen een monster en een andere in de massaspectrometer 31. Andere benaderingen omvatten het gebruik van iTRAQ (isobare tag voor relatieve en absolute kwantificatie), waarbij lysinen chemisch gelabeld met verschillende massa isotopen; iCAT (isotoop gecodeerd affiniteitsmerker) waarbij cysteinen zijn gelabeld met verschillende massa isotopen en zware en lichte water etikettering.

In elk geval echter één ding moet in gedachten worden gehouden. De MS rapporteert alleen wat in een monster aanwezig is, en dit is een weerspiegeling van alles wat er is gebeurd met dat monster tot op dat punt. Minimaliseren monsterbehandeling terwijl maximale opbrengst bij elke stap is noodzakelijk om een ​​succesvolle proteoomanalyse.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de NHMRC bedanken voor de carrière-ontwikkelingsprijs en de subsidie-ondersteuning APP1066336 die dit werk ondersteunde.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinoneAldrich195464
2-D Quantitation KitVWR (GE Healthcare)80-6483-56
Albumine uit bovijn serumSigmaA7030
Ammoniak oplossing 25%Merck1.05432
Ammonium bicarbonaatSigmaA6141
CalciumchlorideSigmaC5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propaansulfonaatResearch Organics1300C
ChloroformBDH10077.6B
DinatriumwaterstoffosfaatMerck1.06580
Dithiothreitol (DTT)SigmaD9779
MierenzuurSigmaO6440
GlucoseSigmaG6152
Glutamine-LSigmaG7513
Hepes (vrije zuur)SigmaH3375
Iodoazijnzuur vrije zuurSigmaI4386
MelkzuurSigmaL1750
MagnesiumchlorideRes. Org.0090M
MethanolMerck10158.6B
Percoll (steriel)VWR (GE Healthcare)GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail HaltThermoFisher Scientific (Pierce)PIE78420
KaliumchlorideSigmaP9333
KaliumwaterstoffosfaatMedical StoreCH 600
NatriumbicarbonaatSigmaS3817
NatriumchlorideSigmaS7653
NatriumdiwaterstoffosfaatMerck1.06346
NatriumwaterstoffosfaatBDH10247.4V
NatriumpyruvaatSigmaS8636
Tris, ultra pure gradeAmresco (Astral)AM0497
Trypsine Gold, mass spec gradePromegaV5280
UreaSigmaU5128
ZinkchlorideSigmaZ0173
0,4 mm Polyethyleen buisGoodfellowET317100
30 G naaldTerumoNN2038R
3 ml SyringeTerumoSS035
4,2 mm Polyethyleen buisGoodfellowET317640
Gevlochten zijde (5-0)DynekCSS0100
TrichloroazijnzuurSigma299537
TiO2 kralen (van gedemonteerde kolom)Titansphere6HT68003
Eppendorf buisjeEppendorf22431081
C7B30SigmaC0856

Referenties

  1. Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
  2. Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
  3. Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
  4. Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
  5. Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).
  6. Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
  7. Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. The Epididymis. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).
  8. Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
  9. Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
  10. Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
  11. Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
  12. Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
  13. Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
  14. Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
  15. Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).
  16. Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
  17. Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. The culture of mouse embryos in vitro. , Freeman. (1971).
  18. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
  19. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
  20. Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
  21. Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
  22. Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
  23. Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).
  24. Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
  25. Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
  26. Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
  27. Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
  28. Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
  29. Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
  30. Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
  31. Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van spermatozoönepididymale spermacellenTiO2-chromatografieproteïnefosforyleringmassaspectrometrietrypsineverteringbackflushingspermatonrijpingproteomische analyse
Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.