Methodenartikel

Transgene knaagdieren Assay voor het kwantificeren van Male Germ Cell Mutant Frequency

18.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51576

⸱

6 augustus 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada, Environmental Health Centre

In dit artikel

Samenvatting

De novo mutaties in de mannelijke kiemcellen kunnen bijdragen aan nadelige gezondheidsuitkomsten in volgende generaties. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van een transgenisch knaagdiermodel voor het kwantificeren van mutaties in mannelijke geslachtscellen die worden veroorzaakt door omgevingsfactoren.

Samenvatting

De novo mutaties ontstaan meestal in de mannelijke geslachtslijn en kunnen bijdragen aan nadelige gezondheidsuitkomsten in volgende generaties. Traditionele methoden voor het beoordelen van de inductie van geslachtscelmutaties vereisen het gebruik van grote aantallen dieren, waardoor ze onpraktisch zijn. Daarom wordt mutageniciteit van geslachtscellen zelden beoordeeld tijdens chemische tests en risicobeoordeling. Hier beschrijven we een in vivo mutatietest voor mannelijke geslachtscellen met behulp van een transgeen knaagdiermodel dat is gebaseerd op een recent goedgekeurde testrichtlijn van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OECD). Deze methode maakt gebruik van een in vitro positieve selectietest om in vivo mutaties te meten die worden geïnduceerd in een transgeen λgt10-vector met een reportergen direct in de geslachtscellen van blootgestelde mannetjes. We beschrijven verder hoe de detectie van mutaties in het transgeen dat van geslachtscellen wordt teruggewonnen, kan worden gebruikt om de fase-specifieke gevoeligheid van de verschillende spermatogene celtypen voor blootstelling aan mutageen te karakteriseren door drie experimentele parameters te controleren: de duur van de blootstelling (administratietijd), de tijd tussen blootstelling en monsterverzameling (bemonsteringstijd) en de celpopulatie die voor analyse wordt verzameld. Omdat een groot aantal geslachtscellen van een enkele man kan worden getest, heeft deze methode een superieure gevoeligheid vergeleken met traditionele methoden, vereist minder dieren en daarom veel minder tijd en middelen.

Inleiding

Sporadische DNA-mutaties in de kiembaan kan leiden tot verminderde reproductief succes en, indien geërfd, kunnen genetische ziekte of een verhoogde aanleg voor kanker in de nakomelingen 1-3 veroorzaken. Substantieel bewijs aantoont dat een groot deel van de novo mutaties overgenomen van de vaderlijke kiembaan 4, en het aantal mutaties in het nageslacht positief gecorreleerd met paternale leeftijd de conceptie 5. Het hogere aandeel van mannelijke mutaties wordt verondersteld een gevolg van de verschillen in leeftijd gedurende gametogenese tussen de seksen, het groter aantal spermatogenese celdelingen vergelijking met het aantal oogenic celdelingen in de vrouwelijke kiemlijn 2, en een geleidelijke afname in DNA repareren efficiency met de leeftijd bij mannen. Al deze factoren dragen bij tot een verhoogde kans op replicatie fouten in de mannelijke kiemlijn 6. Echter, de impact van de vaderlijke blootstelling aan Environmental factoren op de frequentie van de novo mutaties blijft onzeker. Desalniettemin is een groot aantal milieu-agenten staan ​​bekend om kiemcel mutaties bij knaagdieren 7 opwekken, en er is steeds meer bewijs dat sommige van deze middelen kunnen ook invloed hebben op de menselijke kiembaan 8. Ondanks deze zorgen, worden chemicaliën routinematig getest op hun vermogen om mutaties in somatische cellen voor onderzoeksdoeleinden induceren en algemeen wordt aangenomen dat somatische proeven volstaan ​​om de kiemlijn beschermen. Daarom zijn chemische stoffen zelden onderzocht op hun vermogen om kiemcel mutaties veroorzaken.

Een reden mutageniteit tests zijn grotendeels weggelaten uit de regelgeving besluitvormingsproces is een gebrek aan praktische methodieken. Traditionele knaagdieren gebaseerde methoden, zoals de dominante letale 9 en specifieke locus 10 testen, schatten kiemcel mutatie tarieven door te scoren mutante fenotype in embryo's of nakomelingen vanblootgesteld ouders. Deze testen vereisen het gebruik van een groot aantal dieren, tijd en middelen om statistisch significante resultaten te verkrijgen.

Hoewel verschillende moderne methoden voor het kwantificeren van kiemcel mutatie onlangs naar voren zijn gekomen, veel last hebben tekortkomingen in termen van hun functionaliteit, efficiency en biologische relevantie. Bijvoorbeeld, herhaal lengte mutaties op uitgebreid eenvoudige tandem repeat (ESTR) loci kan worden gekwantificeerd in mannelijke geslachtscellen met behulp van een enkel molecuul PCR benadering 15. Echter, het uitvoeren van deze werkwijze technisch moeilijk en omslachtig, en in tegenstelling puntmutaties, biologische en gezondheidsbelang van veranderingen in de herhaallengte van de zeer instabiele ESTR loci onduidelijk 16. Moderne whole genome sequencing technologieën kan een schat aan biologisch zinvolle gegevens te verstrekken wanneer toegepast op het probleem van erfelijke mutaties 4,17, maar de hoge kosten, hoge foutenpercentages, geassocieerd validatie vereistom mutaties te bevestigen, en bioinformatica uitdagingen nog steeds beperken de routinematige toepassing van deze optie in een regelgevend testcapaciteit 18.

Hierin beschrijven we een praktische methode voor het kwantificeren geïnduceerde mutaties direct in de geslachtscellen van transgene mannelijke muizen. Dit protocol wordt beschreven voor de transgene MutaMouse model, die meerdere aaneengeschakelde kopieën van een recombinant Agt10 faag vector die een Escherichia coli lacZ-gen geïntegreerd in beide kopieën van chromosoom 3 19 (figuur 1) heeft.

Dit protocol is ook op andere transgene knaagdier (TGR) modellen gebaseerd op dezelfde principes (BigBlue muis en rat, of lacZ plasmide muis, etc.) Of iets andere reportergenen (gpt delta muis en rat relevant TGR modellen beoordeeld in Lambert et al. 20). Deze methode is gebaseerd op de TGR mutation assay in een onlangs beschrevenen de herziene OESO-richtsnoer 21 en gaan we dieper in op de speciale overwegingen nodig zijn voor de beoordeling van de mutaties te ontvangen in de mannelijke kiembaan vanwege de unieke kenmerken van de spermatogenese. In het kort, de bepaling omvat het blootstellen transgene mannelijke muizen met een mutagene stof, gevolgd door een bemonsteringstijdstip waarbij pre-mutatie laesies is bevestigd in stabiele mutaties. Op de gekozen sample tijd, zijn muizen gedood en kiemcellen worden verzameld van zowel de cauda epididymis of de testes. Zoals hieronder wordt besproken, kunnen mutagene effecten in verschillende fasen van de spermatogenese worden bepaald door het selecteren van de tijd tussen blootstelling en monstername. Transgene inserts, die meerdere kopieën van de λ faag genoom per cel worden geïsoleerd uit kiemcellen genomisch DNA en verpakt in lege capsiden faag λ λ creëren infectieuze faagdeeltjes die vervolgens worden gebruikt om een E. infecteren coli gastheer. De geïnfecteerde bacteriën worden gekweekt op selectieve media die cellen die een vector met een gemuteerde kopie van lacZ uit cellen die wildtype lacZ kunnen onderscheiden. Het mutagene effect van blootstelling op de mannelijke kiemlijn wordt bepaald door de frequentie van mutant transgenen tussen controle en behandelde muizen (figuur 2 beoordeeld in Lambert et al. 20) te vergelijken. Een groot aantal kiemcellen kan worden bepaald uit een enkele muis, waardoor deze test superieure gevoeligheid ten opzichte van traditionele methoden en vermindert het aantal benodigde dieren. Omdat geen speciale uitrusting of opleiding nodig, deze test een praktische en efficiënte oplossing voor kiemcellen mutatie testen in de meeste moderne toxicologie / moleculaire biologie laboratoria.

Een essentiële voorwaarde voor de effectieve toepassing van de TGR kiemcel mutatie test is een goed begrip van de spermatogene cyclus (Figuur 3). De tijd voor de muis kiemcellen om van stem cellen in de testes te spermatogonia, spermatocyten, spermatiden, en ten slotte naar sperma rijpen in de bijbal (dwz. spermatogenese) is ongeveer 49 dagen. Mutatie kan op verschillende fasen van deze cyclus en is vaak verbindingsspecifieke. Twee belangrijke functies die van bijzonder belang zijn voor mutagenese in mannelijke geslachtscellen zijn de beëindiging van de DNA-synthese tijdens de vroege meiose, en het progressief verlies van DNA-herstel capaciteit 6 tijdens de late post-meiose, twee processen die nodig zijn voor de inductie en de fixatie van meeste mutaties.

Vanwege deze unieke kenmerken van de spermatogenese, zijn er drie kritische experimentele variabelen voor het gedrag van de TGR kiemcel mutatieassay: (1) de te onderzoeken verbinding administratie tijd; (2) de bemonsteringstijd; en (3) de keuze van de kiem celpopulatie te verzamelen voor analyse (Figuur 3 en Tabel 1). Administratie is de experimental variabele die bepaalt hoe lang doelcellen blootgesteld aan de testverbindingen. De duur van de toediening tijd kan ook worden gebruikt blootstelling aan specifieke celtypen of fasen van spermatogenese richten. Bijvoorbeeld kan een enkele dag toediening worden gebruikt om de effecten van een acute blootstelling aan een specifiek celtype te bepalen. Evenzo kan blootstelling worden gericht op een volledige spermatogenese fase, bijvoorbeeld doelwit alleen meiose verdelen spermatocyten of mitotisch delende spermatogonia met een 2 weken toedieningstijd en een geschikte bemonsteringstijd. Chronische en sub-chronische toediening keer worden gebruikt om de effecten van de blootstelling op lange termijn te beoordelen, om voldoende farmacokinetische verdeling van de teststof te zorgen, of toestaan ​​voldoende accumulatie van mutaties van zwakke mutagene agentia (bijvoorbeeld de 28 dagelijks bestuur aanbevolen tijd in de OESO-test richtlijn).

Sampling is de kritische variabele bepalen waaropfase van spermatogenese de doelwitcellen waren ten tijde van de belichting. De bemonsteringstijd bepaalt hoeveel tijd, en dus hoe veel verder langs de spermatogene cyclus, cellen passeren na blootstelling. Bijvoorbeeld om effecten in stamcel spermatogonia te onderzoeken, een bemonsteringstijd> 49 dagen is nodig als het verzamelen van volledig gerijpt sperma, of> 42 dagen, indien het verzamelen van onrijpe kiemcellen van de testes, om ervoor te zorgen dat alle verzamelde cellen genoeg tijd hebben gehad om ontwikkelen van blootgestelde stamcellen. Het is belangrijk op te merken dat een bemonsteringstijd van ten minste 70 dagen de voorkeur een echte stamcel effect aantonen voldoende tijd voor farmacokinetische verdeling van de toxische, voor het elimineren van cellen die blootgesteld bij latere fasen van spermatogenese zou zijn, en die rekening een periode van tijdelijke steriliteit kunnen optreden ~ 6 weken na blootstelling aan sterk mutagene verbindingen 22. Evenzo zou een bemonsteringstijd van 21 dagen zorgen ervoor dat sperma collected van de cauda epididymis slechts zou hebben afgerond meiose op de laatste dag van de blootstelling.

Kiemcellen kan worden verzameld als rijp sperma van de cauda epididymis, of als een mengsel van verschillende celtypes spermatogenese van de testes. Oudere sperma blijven de cauda voor ~ 3 dagen, waardoor kan worden vastgesteld met nauwkeurigheden het celtype of fase spermatogenese waarvan het sperma afkomstig van een bepaalde proefopzet. Zo analyse van cauda sperma vergunningen zeer gerichte onderzoeken van fase-specifieke mutatie-effecten. Anderzijds, celsuspensies vanuit het testes een mengsel bevatten van verschillende soorten kiemcellen in verschillende ontwikkelingsfasen, en biedt dus slechtere resolutie van de spermatogenese fase waarin mutaties ontstaan. Daarnaast celsuspensies hersteld van de testes hebben de neiging om een ​​oververtegenwoordiging van spermatiden, gevolgd door spermatocyten, en ver bevatteny paar spermatogonia en stamcellen (deze verhoudingen zijn vertegenwoordigd door afgestudeerd witte balken in figuur 3). Bovendien kunnen suspensies bereid uit de testes ook verscheidene somatische cellen. Aldus, omdat veel celtypen aanwezig zijn, mutatie-effecten kan worden beïnvloed door een verscheidenheid van niet-doelwitcellen. Echter, het verzamelen van monsters van testes biedt een voordelige optie voor het gelijktijdig screenen van meerdere kiemcellen soorten en eenvoudige integratie van kiemcellen analyse naar de standaard OECD test protocol voor somatische mutatie.

Nogmaals, afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker, toedieningstijd, bemonsteringstijd en de verzamelde celpopulatie kan worden aangepast om de effecten van blootstelling in verschillende celtypes en in verschillende fasen van spermatogenese ondervragen. Door het zorgvuldig selecteren van deze variabelen, kunnen experimenten worden ontwikkeld voor gerichte mechanistische studies, of voor meer algemene regelgeving testening doeleinden.

Om vaardigheid te bereiken in de test, raden wij het gebruik van een acute orale toediening van 100 mg / kg N-ethyl-N-nitrosoureum (ENU), gevolgd door een 70 daagse bemonsteringstijd als positieve controle. Analyse van cauda sperma gericht aldus spermatogoniastamcellen (figuur 3), die typisch vertonen een 4-5 voudige toename mutant frequentie (MF) dan controles na dit sterk mutagene dosis ENU. Opgemerkt zij dat deze dosis bekend induceren steriliteit 6 weken na blootstelling, het kan dus een besturingskaart dosis voor kortere bemonsteringstijden zijn. Deze dosis zal ook een detecteerbare toename MF meeste somatische weefsels 20. De representatieve onderstaande resultaten werden verkregen na een acute blootstelling 70 regime met drie doses ENU tot en met 100 mg / kg.

Protocol

Alle protocollen met betrekking tot de veehouderij, het onderhoud en de behandeling werden goedgekeurd door Health Canada's dierverzorging commissie.

1 Animal blootstellingen

  1. Willekeurig te verdelen transgene mannelijke muizen (8-12 weken oud) aan groepen en behandelingsgroepen (min = 5 per groep) .Treat muizen met teststof en relevante bedienen door de juiste belichting route voor de geselecteerde administratie tijd. Kies de juiste sampling tijd volgens de spermatogene celtype van belang (figuur 3).
  2. Na de bemonsteringstijd, euthanaseren muizen door cervicale dislocatie onder isofluorane verdoving (of een andere adequate methode). Trek voorzichtig de testes van een incisie in de buik of het scrotum en accijnzen de cauda epididymis. (Figuur 4, om te bekijken een gedetailleerde video van bijbal collectie zien Duselis et al. 24). Als alternatief, het verzamelen van de testes als het analyseren seminiferouss cellen. Bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C voor later gebruik.

2 Isolatie en de spijsvertering van Cauda Sperma

  1. Ontdooi cauda epididymis op ijs. Transfer ontdooid cauda naar een petrischaal en grondig gehakt met een scalpel of scheermesje.
  2. Voeg 700 ul van kamertemperatuur D-PBS op de petrischaal. Met behulp van een breed-boring 1.000 ul pipet tip, laat sperma van de cauda door het tekenen en het vrijgeven van de schorsing tot het D-PBS troebel met sperma (ongeveer 10 keer). OPMERKING: wide-bore pipetpunt bereiden gesneden 2-3 mm van het uiteinde van een plastic pipet tip.
  3. Filter suspensie door een roestvrijstalen zeef in een schoon 1,5 ml buis. Was de petrischaal met een additionele 700 pl D-PBS en overbrengen in dezelfde buis van 1,5 ml door het filter. Verwijder gaas, leg buis op ijs.
  4. Herhaal de stappen 2,1-2,3 voor overige monsters.
  5. Spin samplesat 11.000 xg gedurende 3 minuten. Voorzichtig decanteren supernatant. Vermijd de pellet te verstoren.
  6. Voeg 1,0 ml koud 1x zoutoplossing natriumcitraat (SSC). Vortex tot pellet wordt volledig opnieuw opgeschort. Dit zal soms verschillende rondes van vortexen.
  7. Voeg 15 ul van 10% SDS. Zet / schud krachtig gedurende 30 seconden aan niet-zaadcellen verstoren. Ook zachtjes schudden resulteren in onjuiste verstoring en de pellet niet goed zich in de volgende stap.
  8. Spin bij 11.000 xg gedurende 2 minuten. Een los, "pluizig" pellet indicatief is onvolledig verstoring van somatische cellen door onvoldoende schudden in stap 2.7. Als dit gebeurt, gewoon het monster weer te schudden, en respin tot een strakke korrel wordt gevormd. Voorzichtig decanteren supernatant. Vermijd de pellet te verstoren. Nogmaals kort draaien en verwijder de resterende supernatant met 200 ul pipet.
  9. Voeg 940 ul 0,2 x koude SSC en vortex tot pellet wordt geresuspendeerd. Deze pellet kan heel moeilijk om opnieuw op te schorten en kan verschillende rondes van vortexen nemen. Soms klonten sperm zijn onvermijdelijk.
  10. Voeg 120 ul β-mercaptoethanol, 100 pl 10% SDS, 20 pl 0,5 M EDTA, pH 8, en 20 ul proteinase K (60 mg / ml, vers bereid). Meng goed en verteren 's nachts met rotatie bij 37 ° C. Ga verder met fenol / chloroform extractie.

3 Phenol / chloroform extractie van DNA uit Cauda Sperma

Opmerking Omdat nucleair DNA in late fase spermatiden en rijpe sperma gecomplexeerd met protamines, en is zeer gecondenseerd vergeleken met het DNA van somatische cellen conventionele nucleïnezuur isolatiemethoden genereert geen DNA voldoende opbrengst en zuiverheid van de mutatie assay werken efficiënt. Multiple fenol-chloroform extractie na agressieve digestie moeten los en zuiveren sperma DNA (gebaseerd op methoden uit 15).

  1. Transfer zaadcel verteren een 15 ml polypropyleen buis.
  2. Voeg 2 ml fenol: chloroform mengsel (1: 1). Draai buis bij 22 rpm3 min.
  3. Centrifugeer bij 1600 xg gedurende 10 minuten en overbrengen waterige bovenlaag samen met de fuzzy interfacelaag een verse 15 ml buis.
  4. Herhaal stap 3.1.2 en 3.1.3 3x, maar veranderen de rouleringstijden 3 min, 4 min en 6 min, respectievelijk. Op de laatste herhaling, vermijd het overbrengen van een van de "vage" grenslaag.
  5. Na het 4e extractie, voeg 70 pl 3 M NaAc, pH 5,2 per 1 ml waterig extract en 2 ml chloroform: isoamylalcohol (24: 1). Draai buis bij 22 rpm gedurende 12 minuten.
  6. Centrifugeer bij 1600 xg gedurende 10 minuten en overbrengen waterige toplaag een verse 15 ml buis.
  7. Neerslaan van DNA door toevoeging van 2 volumes absolute ethanol en voorzichtig draaien van de buis op zijn kant met zachte wiegen.
  8. Verzamel DNA door wachtrij op de punt van een dichtgelaste weiland pipet. Spoel DNA door zwenken de pipet tip in 70% ethanol en drogen gedurende 5 minuten.
  9. Na extractie, te ontbinden DNA neerslag in 40-100 pi Tris-EDTA buffer, pH 8 Bewaar bij 4 ° C. Laat het DNA te lossen bij 4 ° C gedurende ten minste twee dagen alvorens lacZ mutatie assay. Als oplosbaarheid problemen ondervindt, kan DNA verder worden opgelost bij 65 ° C gedurende 15 min vóór gebruik. Bepaal de concentratie van het DNA met een spectrophotometre bij A260 en dat de concentratie van het opgeloste DNA tussen 200-2.000 ng / ul.

4 Isolatie en de spijsvertering van de kiemcellen van testes

  1. Indien bevroren, ontdooien testis op ijs (ongeveer 1 uur). Transfer testis een geslepen glazen plaat.
  2. Houd een uiteinde van de testis met een pincet. Aan het andere uiteinde van de testis, doorboren een gat in de epitheliale capsule met een tang of een paar dissectie schaar (figuur 5A). Knijp de testes door de punctie en de epitheliale capsule (figuur 5B) weggooien.
  3. Eendd 500 gl kamertemperatuur D-PBS op de gedecapsuleerde testes.
  4. Angle a tissue roller (siliconenrubber stevig is bevestigd op een vrij draaibare 5 mm diameter roestvrij stalen buis of soortgelijk apparaat) zodat een uiteinde in contact met de plaat onder een hoek van circa 5-10 ° (figuur 5C). Zonder druk, beweeg de roller heen en weer over de buisjes tot ze worden afgevlakt en de D-PBS troebel met vrijgegeven cellen (ongeveer 5-10x).
  5. Voeg nog eens 500 ul van D-PBS via buisjes en zachtjes rollen over de tubuli een paar extra keren.
  6. Breng de celsuspensie aan een 1,5 ml microcentrifugebuis met een minimale hoeveelheid vrijstaande tubules overgedragen (Figuur 5D).
  7. Herhaal stap 4,5-4,6 meer cellen te verzamelen indien nodig.
  8. Laat 1 - 2 min voor ongeluk verzameld tubuli om naar de bodem van de buis. Breng de D-PBS om een ​​fresh 1.5 ml buisje achterlating vaste tubuli (ongeveer 100 pl D-PBS). Een kleine hoeveelheid van deze suspensie kan onder een microscoop (fasecontrast) worden gecontroleerd om de samenstelling van de celpopulatie beoordelen.
  9. Draai de cellen af ​​bij 11.000 xg gedurende 30 sec. Zorgvuldig Schenk de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren. De celpellet kan bij -80 ° C worden bevroren bij dit punt als nodig.
  10. Ontdooi cellen indien nodig. Transfer naar een 15 ml polypropyleen buis en resuspendeer cellen in 5 ml lysisbuffer (10 mM Tris pH 7,6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mg / ml proteinase K, 1% SDS). Digest overnachting in incubator met rotatie bij 37 ° C.
  11. Ga verder met fenol / chloroform extractie.

5 fenol / chloroform extractie van DNA uit seminiferous kiemcellen

OPMERKING: Een minder agressieve extractie wordt gebruikt om testes kiemcel DNA te isoleren, omdat deze celtypen nog niet gevorderd door nucleaire condensatie.

  1. Voeg 5 ml fenol: chloroform mengsel (1: 1) tot 's nachts testes cel spijsvertering. Draai buis bij 22 rpm gedurende 20 minuten.
  2. Centrifugeer bij 1600 xg gedurende 10 minuten en overbrengen waterige toplaag, waardoor in "fuzzy" interfacelaag een verse 15 ml buis.
  3. Voeg 100 ul van 5 M NaCl per 5 ml waterige extract (meestal 5 ml wordt hersteld)
  4. Voeg 5 ml chloroform: isoamylalcohol (24: 1). Draai buis bij 22 rpm gedurende 12 minuten.
  5. Centrifugeer bij 1600 xg gedurende 10 minuten en overbrengen waterige toplaag een verse 15 ml buis.
  6. Neerslag DNA door toevoeging van 2 volumina absolute ethanol en voorzichtig draaien en keren buizen.
  7. Verzamel DNA door wachtrij op de punt van een afgesloten weiland pipet. Spoel DNA door zwenken de pipet tip in 70% ethanol en drogen gedurende 5 minuten.
  8. Los DNA in 40-100 ul Tris-EDTA-buffer, pH 8 Bewaar bij 4 ° C. Laat DNA te lossen bij 4 ° C gedurende ten minste tweedagen alvorens tot lacZ- mutation assay (zie stap 3.9). Als oplosbaarheid problemen ondervindt, kan DNA verder worden opgelost bij 65 ° C gedurende 15 min vóór gebruik. Bepaal de concentratie van het DNA met een spectrophotometre bij A 260 en ervoor zorgen dat de concentratie ligt tussen de 200 en 2.000 ng / ul.

6 LacZ mutatie Assay

Bacteriële of schimmelinfectie kan verstoren verpakkingsefficiëntie, alsmede plaque groei en scoren. Het is derhalve kritisch voor de lacZ test uitvoeren met het juiste aseptische maatregelen om verontreiniging van de verpakking reactie talrijke cultuur en groeimedia voorkomen.

  1. Day Before Assay: Bereid Bottom Agar en Overnight Cultuur
    1. Acht platen (4 platen te scoren mutanten, 4 platen om titer te tellen) met 8 ml bodem agar elkaar nodig per monster (dwz., 64 ml per monster). De bodem agar is bij beidede mutant en de titer tellen platen. Bereid voldoende bodem agar voor het aantal monsters worden verwerkt. Aseptisch giet in 90 mm petrischalen (8 ml per gerecht) en laat agar stollen. OPMERKING: Bottom agarplaten kunnen worden bereid 1 week op voorhand.
    2. In een 50 ml tube 10 ml LB-bouillon, 100 pl 20% maltose oplossing, 25 ul ampicilline (20 mg / ml) en 20 ul kanamycine (5 mg / ml). Te enten met E. coli (lacZ - / galE -) 25 en groei overnacht bij 37 ° C onder schudden bij 240 rpm.
  2. Dag 1: Sub-cultuur Cellen
    1. Subcultuur cellen door het bereiden van een 1: 100 verdunning van de kweek gedurende de nacht in vers LB (geen antibiotica). Een volume van 8 ml subcultuur nodig per monster. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 240 rpm gedurende 3,5 uur tot OD 600 = 1.
    2. Wanneer OD 600 = 1, delen celsuspensie gelijkmatig in 50 ml en centrifugeer bij 1300 xg bij 15 ° C gedurende 10min. Verwijder de supernatant en resuspendeer cellen in de helft van het oorspronkelijke volume (dwz. 4 ml per monster) van LB bevattende 10 mM MgSO4. Leg cellen opzij totdat het nodig is [stap 6.2.4.3].
  3. Dag 1: Verpakking DNA in Lambda faagpartikels
    1. Warming-up een waterbad tot 30 ° C.
    2. Met een wide-bore 10 ul pipetpunt, overdracht 4 ui DNA een 1,5 ml buis. OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd een dag of meer van tevoren te voorbereidingstijd te verminderen.
    3. Warmen de eerste buis (rood) van een faag packaging extract kit (1 tube per 2 monsters). Kort draaien om extract te verzamelen aan de onderkant van de buis.
    4. Transfer 4.8 gl packaging extract van de eerste buis aan het DNA monster en meng door zachtjes roeren met de pipetpunt. Kort spin down monsters in tubes. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 30 ° C waterbad.
    5. Warmen de tweede (blauwe) packaging extract buis (1 tube voor ~ 15 monsters). Kort draaien om extract onderaan verzamelenvan de buis.
    6. Transfer 4.8 gl packaging extract van de tweede tube aan het DNA monster en meng door voorzichtig roeren. Kort spin down monsters in tubes. Incubeer gedurende nog eens 1,5 uur bij 30 ° C waterbad.
    7. Resuspendeer verpakt faagdeeltjes in 500 ui SM-buffer en meng door rotatie gedurende 30 minuten bij 20 rpm.
    8. Na het draaien van, kort vortex monsters en centrifugeer bij 11.000 xg gedurende 30 sec om monsters te verzamelen aan de onderkant van de buizen. Faagpartikels zijn klaar voor infectie [stap 6.2.4].
  4. Dag 1: Bereid Top Agar
    1. Maak afzonderlijke top agar voor de titer platen en mutante selectie platen. Elk monster vereist 4 titer platen, en 4 mutant platen. Elke plaat vereist 8 ml topagar. Voeg de selectieve agens fenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) de mutant selectie topagar alleen. Bereid zowel top agars vooraf (dag van assay) en handhaven op 50 ° C voor het toevoegen MgSO4 zowel top agars en PGal naar selectie agar mutant.
  5. Dag 1: Het besmetten van cellen met verpakte Phage en Plating
    1. Label twee 50 ml tubes per monster: 1 "mutant" buis per monster en 1 "titer" buis per monster
    2. Label 8 agarplaten per monster: 4 "mutant" platen per monster en 4 "titer" platen per monster
    3. Aliquot van 2 ml geresuspendeerd cellen [van stap 6.2.1.2] aan elke buis.
    4. Voeg 500 ul van verpakte faagdeeltjes [van stap 6.2.2.8] om "mutant" 50 ml buisje (bevattende cellen). Meng en laat faagdeeltjes cellen infecteren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
    5. Na 30 min kort vortex geïnfecteerde cellen en breng 15 pl van geïnfecteerde cellen naar de juiste 50 ml "titer" tube (bevattende cellen).
    6. Om plaat titer monster, voeg 30 ml warm (50 ° C) "titer" top-agar (NIET met P-Gal) op "titer" 50 ml tube. Onmiddellijk distribute agar / cel mengsel onder de 4 "titer" platen (~ 8 ml per plaat). Werk snel, zodat de top agar niet afkoelen in de pipetten, en probeer niet om luchtbellen te introduceren.
    7. Bord van de "mutant" monsters naast. Zorgen voor P-Gal wordt toegevoegd aan "mutant selectie" top agar. Voeg 30 ml warm "mutant selectie" agar (met P-Gal) op "mutant" 50 ml tube. Onmiddellijk distribueren agar / cel mengsel onder de 4 "mutant" platen (~ 8 ml per plaat).
    8. Laat platen stollen (~ 15 min) dan keren en incubeer bij 37 ° C overnacht.
  6. Dag 2: Tellen Plaques
    1. Na overnacht incubatie tel het aantal plaques van de mutante en titer platen. Voor grote aantallen plaques, tellen slechts een gedeelte van de plaat schatting van het totale aantal (bv. Vaak ¼ van de titer plaat moet tussen 100-200 plaques). Een minimum van 100 plaques moet worden geteld per plaat als counting een gedeelte van de plaat.
    2. Bereken het aantal plaquevormende eenheden (PVE) per pi cellen. Dit wordt gedaan door het aantal plaques op de "titer" platen door het volume van cellen uitgeplaat (15 pi).
    3. Met het aantal PVE / ul schatten het totale aantal PVE in het totale volume van geïnfecteerde cellen op de "mutant" platen (PVE / gl * [2 cellen ml + 0,5 ml verpakt faagdeeltjes - 15 gl voor titer platen] ).
    4. Schat de MF door het totaal aantal mutante plaques geteld op de 4 "mutant" platen door het geschatte aantal PVE in het totale volume van geïnfecteerde cellen bepaald uit de "titer" platen.
  7. Wanneer de spontane lacZ MF in de orde van 3 x 10 -5 bij de controlegroep, zoals voor MutaMouse kiemcellen, de OECD richtlijn beveelt minste 125.000 tot 300.000 niet-mutant PVE per dier schermed voor mutatie om een ​​betrouwbare basis signaal te krijgen. Andere transgene modellen lager spontaan MF, waarbij een groter aantal PVE zou nodig hebben. Een statistische power test kan worden uitgevoerd om het minimum aantal van de PVE en dieren nodig zijn om de gewenste resolutie te verkrijgen bepalen. Gegevens uit meerdere herhalingen mogen worden samengevoegd tot dit minimum PFU eis te voldoen, op voorwaarde dat zij niet produceren significant verschillend mutant frequenties.

7 Statistieken

De experimentele eenheid voor de analyse is de muis. Gegevens verkregen uit deze assay algemeen niet normaal verdeeld. Als zodanig, selecteert de statistische methode voor analyse op basis van de verdeling kenmerk van de data.

OPMERKING: Standaard parametrische analyse (. Bijvoorbeeld ANOVA) worden gebruikt indien adequate gegevens transformatie wordt toegepast op de variantie van de reactie gelijk over het bereik van observatie. Poisson of binomiale regressie analyses zijn vaak meer geschikt. Parametrische analyse kan eveneens worden toegepast. We routinematig Poisson regressie met behulp van de gegeneraliseerde lineaire model procedure (dwz., Proc Genmod) in SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC) zoals beschreven door Lemieux et al 26.

Resultaten

Met een gemiddelde plaque telling van 200.000 plaques per dier, zien we doorgaans een gemiddelde achtergrond MF heeft van ongeveer 2,8 x 10 -5 bij mannelijke kiemcellen met een standaardafwijking van 1,7 x 10 -5 in onze controlegroepen (gebaseerd op de data van acht onafhankelijke experimenten). Met deze plaquette telling, achtergrondniveau en variantie, dosis groepen met n = 5 dieren elkaar voldoende zijn om een ​​2-voudige toename van MF met vermogen> 0,8 detecteren.

Resultaten worden typisch gerapporteerd in tabellen of grafische formaten. Tabel 2 en Figuur 6 tonen representatieve resultaten van cauda sperma MutaMouse mannen (n = 5 per groep) blootgesteld aan een acute orale dosis van 0, 25, 50 en 100 mg / kg N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) gevolgd door 70 dagen bemonsteringstijd. Deze periode van 70 dagen maakt de meting van mutatie gebeurtenissen die zich in het sperma dat spermatogoniale stamcellen op het moment van blootstelling waren (Figuur 3). Typische plaque dichtheden van mutant en titer platen worden getoond in Figuur 7. Zoals weergegeven in tabel 2 en figuur 6, acute ENU blootstelling induceerde een significante dosis-afhankelijke toename in de MF spermatogoniamitose stamcellen. De lage dosis wekte een duidelijke 2,6 voudige toename in de controles, waarbij een basislijn MF had van 2,6 x 10 -5. Maximale inductie plaatsvond in de hoge dosis, die een 4,4-voudige toename in controles opgewekt.

Een voorbeeld van deze test uitgevoerd op seminiferous kiemcellen u naar Douglas e.a.. 27, waarbij MF werd vastgesteld tubulus kiemcellen op verschillende tijdsintervallen na een 5 daagse herhaalde intraperitoneale injectie van 50 mg / kg ENU. In deze studie, mutant frequenties in seminiferi cellen verhoogd tot 15 dagen na de behandeling en bleef daarna constant.

Expozeker regime Verzamelde weefsel Verzamelde celtype (doelcel) Fase doelcel begin blootstelling Fasen gepasseerd tijdens de blootstelling
Acute + 70 Cauda Mature sperma Stamcel Stamcel
14 + 21 Cauda Mature sperma Spermatogonia Spermatide
14 + 35 Cauda Mature sperma Stamcel Spermatocyt
28 + 3 Cauda Mature sperma Spermatocyt Spermatocyt
Spermatide
Mature sperma
Buisjes Stamcel Stamcel Stamcel
Spermatogonia Spermatogonia Spermatogonia
Spermatocyt Spermatocyt
Spermatide Spermatide
28 + 49 Cauda Mature sperma Stam cel Stamcel
Buisjes Stamcel
Spermatogonia
Spermatocyt
Spermatide 		Stamcel Stamcel

Tabel 1: Cel soorten en fasen van de spermatogenese die het doelwit zijn van de transgene knaagdieren mutatieassay door diverse experimentele ontwerpen.

Dosisgroep Animal # Mutant PFU Totaal PFU MF (x10 -5) Gem MF (x 10 -5) Voudige verandering p-waarde
Controle 1 5 180245 2.8 2.6 1.0 -
2 4 137835 2.9
3 11 385672 2.9
4 2 431396 0.5
5 6 152413 3.9
25 mg / kg 6 17 162353 10.5 6.9 2.6 0.0002
7 14 150094 9.3
8 4 154401 2.6
9 9 154401 5.8
10 12 196978 6.1
50 mg / kg 11 17 155727 10.9 9.3 3.6 <0,0001
12 11 135847 8.1
13 25 193499 12.9
14 12 133859 9.0
15 14 252807 5.5
100 mg / kg 16 26 170968 15.2 11.5 4.4 <0,0001
17 28 234584 11.9
18 10 145289 6.9
19 35 292236 12.0
20 22 190848 11.5

Tabel 2 De lacZ mutatiefrequentie in cauda sperma transgene mannelijke mijs acuut blootgesteld aan ENU toen ze spermatogoniale stamcellen (administratie tijd = 1 dag, sampling tijd = 70 dagen). PFU = plaque vormende eenheid, MF = mutant frequentie.

figure-results-1
Figuur 1 een schematische weergave van de Agt10 faag construct.

figure-results-2
Figuur 2 Een overzicht van de transgene knaagdieren kiemcel mutatieassay.

figure-results-3
Figuur 3 een schematisch diagram van spermatogenese bij de muis en de celtypes en phases die zijn doelwit van de transgene knaagdieren mutatieassay door diverse experimentele ontwerpen. OPMERKING: De afgestudeerde witte balken geven het relatieve aandeel van de soorten cellen aanwezig in cel suspensies bereid uit de testes (dwz spermatiden> spermatocyten> spermatogonia> stamcellen). Gelieve klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Het verzamelen van de muis cauda epididymis. A) Maak een insnijding in de buik naar het scrotum. B) Identificeer de epididymis vet pad. C) Trek het vet pad te trekken uit de testes en de bijbal. D) Zoek en accijnzen de cauda epididymis.

figure-results-5
Figuur 5 Voorbereiding van de schorsing van de kiemcellen van de testes. A) wordt een incisie gemaakt in de epitheliale capsule van de testis, het blootstellen van de testes. B) De testes zijn geperst uit de capsule. C) Een weefsel roller wordt zachtjes gepasseerd de buisjes op een 5-10 ° hoek Laat de kiemcellen in ons systeem. D) Het virus celsuspensie wordt verzameld voor verdere verwerking.

figure-results-6
Figuur 6 Grafische weergave lacZ mutatiefrequentie in MutaMouse sperma acuut blootgesteld stamcellen ENU (n = 5). Elkdriehoekje is de MF van een dier. * p <0,05, zoals bepaald door Poisson regressie.

figure-results-7
Figuur 7 Vertegenwoordiger agarplaten uit de transgene knaagdieren mutation assay met plaques gevormd op een grasveld van E. coli gastheer bacteriën. A) De "mutant" platen zal weinig plaques (aangegeven met pijlen), vooral in de controlegroep dosisgroepen, die af en toe nul plaques op sommige platen. B) de "titer" platen kunnen honderden plaques.

Discussie

In vergelijking met traditionele methoden, de TGR kiemcel mutatieassay biedt een snellere, zuiniger en meer gevoelige middel van het kwantificeren geïnduceerd in vivo kiemcel mutaties. Afgaande transgen MF direct in sperma, in tegenstelling tot nageslacht, het aantal dieren, de tijd en middelen die de kiemlijn mutageniteit van een enkele verbinding beoordelen aanzienlijk verminderd. Qua gevoeligheid, konden we een aanzienlijke 2,6-voudige toename in spermatogonia stamcellen MF na blootstelling aan 25 mg / kg ENU maar 5 dieren per dosisgroep detecteren. In tegenstelling, de specifieke locus test kon geen significante verandering in de MF op deze zelfde dosis met> 3.000 muizen in de blootgestelde groep en> 500.000 controle muizen 28 te detecteren.

Naast de geschiktheid voor zowel mechanistische en van onderzoeken, deze methode biedt een mogelijkheid voor vergelijkende studies tussen somatische en germinale Mutatiop de tarieven. Recente gegevens wijzen erop dat voor sommige agenten kiemcellen mutaties kunnen worden geïnduceerd bij een lagere concentratie dan nodig is voor somatische mutatie. Bijvoorbeeld, langdurige blootstelling aan N-hydroxymethylacrylamide, een metaboliet van het eten carcinogeen acrylamide 12, verhoogt de frequentie van dominante letale mutaties kiemcellen in muizen zonder de micronucleus frequentie in rode bloedcellen, een traditionele maat somatische cellen cytogenetische schade 13. Bovendien, de blootstelling van muizen aan zowel mainstream en sidestream tabaksrook oorzaken verhoogde mutatie frequenties tandem repeat loci DNA in het sperma bij doses die niet in het bloed verhogen micronucleus- frequentie 14. Deze bevindingen betwisten de veronderstelling dat somatische genotoxiciteitsonderzoeken is altijd beschermend van de kiembaan, en versterken de vraag naar een meer efficiënte en kosteneffectieve manier om kiemcel mutatie frequentie te kwantificeren. Echter, het bewijs voor preferentiële mutagene stoffen in geslachtscellen is nog zwak, Grotendeels te wijten aan het gebrek aan beschikbare gegevens voor het vergelijken van het aantal mutaties in somatische en kiemcellen weefsels. De TGR mutatieassay laat parallel testen en vergelijken van geïnduceerde mutatie tarieven in meerdere weefsels met behulp van hetzelfde transgen. Zo vergelijkende mutatie testen met behulp van de TGR test zou helpen vullen lacunes in de gegevens rond de mogelijkheid van preferentiële kiemceleffecten.

Gelijktijdige beoordeling van somatische en kiemcellen mutatie die wettelijk voorgeschreven proeven zou ook de efficiëntie te verbeteren door vermindering van het aantal dieren dat nodig is. De OESO-richtlijn voor somatische mutatie beveelt een 28 dagen administratie tijd, gevolgd door een driedaagse sampling tijd (28 + 3). Analyse van cauda sperma kunnen lage sensitiviteit op dit tijdstip aanbieden, aangezien doelcellen vooral blootgesteld gedurende de spermatocyte en spermatid fasen van spermatogenese (figuur 3). De cellen in deze fasen niet synthetiseren van DNA en geleidelijk verliezen hun capaciteit voor herstel van DNA 6 </ Sup>. Bovendien zou bemonstering cauda sperma op dit tijdstip niet mutaties optreden in spermatogonia en stamcellen detecteren. Zo is voor de integratie in de 28 + 3 design, de OECD richtlijn beveelt verzamelen kiemcellen van de testes. Deze gemengde populatie bevat cellen afgeleid van DNA-synthese en reparatie bedreven celtypen, waaronder stamcellen, en zijn blootgesteld door de meeste spermatogenetische fasen. Vanwege de gemengde aard van deze cellen, testes celanalysesysteem ofwel geen fase-specifieke informatie. Verder is er bezorgdheid dat de aanwezigheid van non-target cellen de waargenomen MF kunnen beïnvloeden (bijvoorbeeld vals positieve in geslachtscellen mutagene stof oproepen als gevolg van verontreiniging van gemuteerde somatische cellen, of verdunning van een gemuteerd kiemcel signaal van DNA-reparatie-deficiënte geslachtscellen) . Op dit moment is er onvoldoende gegevens om te concluderen of de resultaten van testes cellen bij 28 + 3 bieden dezelfde sensitiviteit en specificiteit van eens cauda sperma op latere tijdstippen. Ons laboratorium is momenteel te vergelijken geïnduceerde magnetische velden in de testes cellen en cauda sperma verzameld na diverse bemonsteringstijden om dit punt aan te pakken. We merken op dat de OESO-richtlijn stelt een alternatieve bemonstering tijd van 28 dagen voor langzaam delende weefsels zoals de lever, die ook geschikt is voor kiemcellen analyse kan zijn. Toch beschikbare gegevens nog steeds onvoldoende en we zijn momenteel niet in staat om een ​​enkele experimentele opzet te bevelen voor de gelijktijdige analyse van somatische cellen en kiemcellen met behulp van de TGR mutation assay die wettelijk voorgeschreven proeven.

Een kenmerk van deze test die moet worden opgemerkt is dat mutatie gebeurtenissen worden beoordeeld op niet-transgene muizen. Er is voldoende bewijs dat het transgen reageert op milieu mutagene op dezelfde wijze als endogene genen 20. Bovendien, omdat de precieze oorsprong van onafhankelijke mutationele gebeurtenissen zijn moeilijk telossen, worden de resultaten meestal vermeld als een mutant frequentie (in tegenstelling tot een mutatiefrequentie). De werkelijke mutatiefrequentie kan worden opgelost als resultaat gecorrigeerd voor klonale expansie (dwz. De delen en vermenigvuldigen van een gemuteerde cel die kan bijdragen aan de waargenomen frequentie van transgene mutanten) door DNA sequentiebepaling. Sequencing van de gemuteerde transgenen kunnen worden uitgevoerd om het lacZ mutaties karakteriseren en identificeren van mutanten die kunnen worden afgeleid van klonale expansie gebeurtenissen, hoewel dit aanzienlijk bij tot de tijd en kosten van de analyse. Naast het lacZ gen theλgt10 transgene vector herbergt alternatief temperatuurafhankelijke mutatie-reportergen: een variant van de λ cII gen dat korter (294 bp tov het 3021 bp lacZ, figuur 1) en gemakkelijker sequentie 29. Sequencing maakt ook de analyse van de geïnduceerde mutatie spectrum, die inzicht geven in de mutatiointerne mechanisme van de verbinding in kwestie. Een extreem voorbeeld van klonale expansie het optreden van een "jackpot" mutatie (dwz., Transgen mutaties in een zeer vroeg stadium van ontwikkeling een orgaan dat bijdraagt ​​tot een drastisch verhoogde MF, soms honderden tot duizenden malen groter dan de achtergrond). Dieren of weefsels met een "jackpot" mutatie moet worden verwijderd uit de analyse.

De test die we hebben beschreven is breed toepasbaar op andere TGR modellen zoals de BigBlue muis en rat en de lacZ plasmide muis, die haven soortgelijke mutatie reportervectoren (besproken in 20). De overgrote meerderheid van de kiemcel tot dusver verrichte onderzoek dat gelijkaardige methoden gebruiken, hebben zich gericht vrijwel uitsluitend op goed gekarakteriseerd mutagene agentia, zoals ENU en straling (beoordeeld in 30). De verwachting is dat met de recente vrijlating van de OESO-richtlijnen voor de TGR assay, zal deze test wordensteeds populairder voor chemische screening en regelgeving evalueren. Incorporatie van de TGR kiemcel mutatie proef tot een regelgevend testen batterij zal de bestaande leemte op te vullen door het toelaat een efficiënte beoordeling van de mutatie-inductie in kiemcellen 11. Bovendien kan deze bepaling worden gebruikt MF meten vrijwel elk weefsel, die een geschikt middel voor het vergelijken van de relatieve gevoeligheden van somatische cellen en zaadcellen bij de inductie van mutaties door milieufactoren agentia op identieke genetische eindpunten.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Canadese Regelgeving voor Biotechnologie (CRSB) en de Chemicaliënbeheerplan (CMP) initiatieven.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MutaMouseCovance-
E. coli (lacZ-/galE-)Covance-Zie referentie 25 in manuscript
ChloroformCaledon3001-2-40
Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS)Gibco14190-250
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 0,5 M, pH 8Sigma-Aldrich03690 FLUKA
IsoamylalcoholCaledon2/10/7900
Lennon LB bouillonbasisInvitrogen12780-029
Roestvrijstalen gaasfilterSigma-AldrichS3770
Transpack verpakkingsextractAgilent Technologies200220
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Ethylalcohol, anhydrisch (EtOH)Commercial Alcohols-
AmpicillineGibco11593-027Bereid 20 mg/ml in dH2O
KanamycineGibco11815-024Bereid 5 mg/ml in dH2O
FenolInvitrogen15509-097Verzadig in 0,1 M Tris-HCl volgens de aanwijzingen van de fabrikant
Fenyl-β-D-galactopyranosid (P-Gal)Sigma-AldrichP6501Los op 3 g per 10 ml dimethylformamide
Proteinase KInvitrogen25530-031Bereid 60 mg/ml oplossing dH2O net voor gebruik, 20 µl per monster
Natriumacetaat (NaAc)Fisher ScientificBP333-500Bereid 3 M oplossing, pH 5,2
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Sigma-AldrichL4390Bereid 10% oplossing in dH2O
1 M MgSO424,6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclaveer, bewaar bij kamertemperatuur tot 1 jaar
LB-bouillon5,0 g LB-basis, 6,4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclaveer en koel
Sout natriumcitraat (SSC)150 mM NaCl, 15 mM trinatriumcitraat, pH 7,0 
SM-buffer5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 5,0 ml gelatine (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclaveer, bewaar bij kamertemperatuur tot 1 jaar
TE-buffer10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8

Referenties

  1. Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
  2. Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
  3. Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
  4. Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
  5. Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
  6. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
  7. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
  8. Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
  9. Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
  10. Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
  11. Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
  12. Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
  13. Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
  14. Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
  15. Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
  16. Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
  17. Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
  18. Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
  19. Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
  20. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  21. OECD. OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
  22. Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
  23. Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
  24. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184(2007).
  25. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254(1992).
  26. Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
  27. Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
  28. Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
  29. Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  30. Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kiemcelmutatiemannelijke kiemcellenspermatogene celtypenin vitro positieve selectielambda faagverpakkingmeting van mutantfrequentieblootstelling aan chemische mutagenenOECD testrichtlijngenetische toxicologie
Transgene knaagdieren Assay voor het kwantificeren van Male Germ Cell Mutant Frequency
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.