Dit protocol beschrijft een procedure voor seriële bemonstering van femur beenmerg (BM) zonder dat muizen hiervoor worden geofferd. Deze procedure vergemakkelijkt longitudinale studies van de samenstelling van beenmerg van muizen in de loop van de tijd en biedt seriële toegang tot cellen binnen het beenmerg voor ex vivo en transplantatiestudies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Femorale beenmergaspiratie in levende muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Seriematige bemonstering van de cellulaire samenstelling van beenmerg (BM) is een routineprocedure die van cruciaal belang is voor klinische hematologie. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde stap-voor-stap technische procedure voor een analoog proces bij levende muizen dat serielle karakterisering van cellen in het beenmerg mogelijk maakt. Deze procedure vergemakkelijkt studies die gericht zijn op het detecteren van de aanwezigheid van exogene toegediende cellen in het beenmerg van muizen, zoals bijvoorbeeld in xenotransplantatiestudies. Bovendien maakt deze procedure het mogelijk om cellen die verrijkt zijn in het beenmerg, zoals hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) te verzamelen en karakteriseren zonder dat de muizen worden geofferd. Aangezien de cellulaire samenstelling van perifeer bloed niet noodzakelijkerwijs representatief is voor de verhoudingen en typen van stam- en voorlopercellen die in het beenmerg aanwezig zijn, zijn procedures die toegang bieden tot dit compartiment zonder dat de muizen geëuthanaseerd hoeven te worden, zeer nuttig. Het gebruik van aspiratie van het femur-beenmerg wordt hier geïllustreerd voor cytologische analyse van beenmergcellen, flowcytometrische karakterisering van het hematopoëtische stam/voorlopercellen compartiment, en cultivatie van gesorteerd HSPC's verkregen door aspiratie van het femur-beenmerg, vergeleken met conventionele beenmergwinning.
Inleiding
Alle bloedcellen zijn afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC's). Procedures die toegang bieden tot het beenmerg (BM), de plaats waar de overgrote meerderheid van HSC's zich in muizen en mensen bevindt, zonder dat dieren geofferd hoeven te worden, bieden een middel om de bron van hematopoëse serieel te monitoren. Het algemene doel van de hier beschreven procedure is om een gedetailleerd protocol te bieden voor het bemonsteren van BM-cellen uit het dijbeen van levende muizen, wat materiaal levert dat representatief is voor de cellen die door conventionele oogst van BM-cellen door het offeren van de muizen zouden worden verkregen. Het voordeel van deze procedure boven conventionele oogst van BM-cellen is dat deze procedure het offeren van muizen niet vereist en daarom een longitudinaal onderzoek van het beenmergcompartiment van muizen in de loop van de tijd mogelijk maakt.
Hoewel deze murine beenmerg aspiratieprocedure in een aantal studies is gebruikt en eerder is beschreven (zie Sundberg et al. voor een historische review1), zijn formele stap-voor-stap procedures die deze techniek illustreren niet eerder gepubliceerd. Dit protocol maakt routinematige serieuze bemonstering van het BM mogelijk voor doeleinden zoals het beoordelen van aanplant in het BM van cellen die exogeen in de muis zijn geïntroduceerd (zoals bijvoorbeeld in xenograftstudies2,3), analyse van chimerisme in het BM ter vergelijking met dat van het perifere bloed (waar de resultaten niet noodzakelijk congruent zijn), het monitoren van de abundantie van specifieke celtypen die normaal verrijkt zijn in het beenmerg, zoals hematopoëtische stam- en voorlopercellen, en het verkrijgen van BM-cellen voor ex vivo cultuur en/of transplantatie. Bovendien kan evaluatie van beenmerginhoud zeer nuttig zijn in muismodellen van hematologische ziekten, aangezien aspiratie nuttig is bij het beoordelen van de belasting van hematologische ziekten op tijdstippen waarop de ziekte mogelijk niet in het perifere bloed is evident3-5. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om de respons van hematologische ziekten in het beenmerg op geneesmiddelen die in therapeutische studies worden toegediend, te evalueren. Dus, de hier beschreven procedure is ideaal voor onderzoekers die toegang willen krijgen tot hematopoëtische beenmergcellen van muizen voor cytologische analyse, flowcytometrische analyse, in vitro cultivering en/of in vivo transplantatiestudies zonder dat het offeren of schaden van de muizen vereist is.
Het protocol voor het bemonsteren van BM dat hier wordt beschreven, is vrij vergelijkbaar met de techniek die wordt gebruikt voor intra-femorale injectie van materiaal direct in de beenmergholte3,6. Het belangrijkste verschil is dat dit protocol de procedure voor het verwijderen van cellen uit het beenmerg beschrijft, in tegenstelling tot het direct inbrengen van materiaal in de beenmergholte, zoals bij intrafemorale injectie wordt gedaan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUCs) het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Aspiratie van beenmerg (BM) cellen uit het dijbeen
- Verdoven van de muis die femorale beenmergaspiratie zal ondergaan met isofluraan (1-4%) toegediend met een precisie vaporizer. Diepte van de anesthesie moet worden gecontroleerd elke 5-10 min gedurende de procedure met de opmerking dat er geen verandering in de ademhalingsfrequentie in verband met chirurgische manipulatie en / of het oor, neus en staart knijpen. Anesthesie wordt geïnduceerd met isofluraan en ook gedurende de gehele procedure met isofluraan. Een preventieve pre-procedurele dosis buprenorfine in een dosis van 0,05-0,1 mg / kg subcutaan elke 6-12 uur kan worden gebruikt om pijn geassocieerd met de procedure als een bijvoeglijk voorkomenunct de Carprofen.
- Breng oogzalf om de ogen van de muis na inductie van anesthesie drogen cornea voorkomen.
- De vacht wordt zorgvuldig geknipt van een huidgebied ongeveer 150% groter dan het gebied van de beoogde aspiratie plaats. Losse haren wordt verwijderd met een vochtige gaasje. Houd de muis op een circulerende warm water pad of andere veilige thermostatisch oppervlak om onderkoeling tijdens de procedure te voorkomen.
- Ontsmet de hele been met het dijbeen die aspiratie zal ondergaan met drie sets van afwisselend scrubs (afwisselend met ofwel een povidonjood (Betadine) of chloorhexidine (Nolvasan) scrub en 70% isopropylalcohol of 70% ethanol gedrenkt gaas sponzen).
- Bevochtig een 0,5 ml tuberculinespuit (volume: 0.5 cc; gauge: 27,5 G) met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor opzuigen van de BM. Vul de spuit met 200-500 pi PBS en onmiddellijk verdrijven de PBS. Herhaal deze procedure 2-3 tIMES.
- Houd de tibia gebogen uit het dijbeen door op de tibia of de ringvinger of de vijfde vinger. Controleer of een geschikte verdoving vlak is bereikt. De spuit wordt gehouden met behulp van de duim en de wijsvinger. Hierdoor kan de condyli worden blootgesteld en vergemakkelijkt het inbrengen van de naald.
- Na het bevochtigen van de injectiespuit en steek de naald door de patellapees, zodat de naald stevig tussen de twee knobbels van het femur wordt ingediend. Door met de diafyse nabij de epifyse van het dijbeen met de duim en de wijsvinger, wordt de naald in de schacht van de femur ingebracht gemakkelijk.
- Draai de naald naar buiten en naar boven zodat deze evenwijdig met de as van het dijbeen is. Deze actie vergemakkelijkt het terugvinden van de inhoud beenmerg uit het dijbeen as.
- Draai de naald met de klok mee en tegen de klok in terwijl u het langzaam in de femorale mergholte. Controleer de juiste plaatsing van de naald door zachtjes bewegen van de SYringe lateraal.
- Trek de naald zuiger terug, het creëren van negatieve druk, terwijl het verplaatsen van de naald heen en weer in de BM holte. Opmerking: Het volume van BM aangezogen wordt ongeveer 5 pl die typisch overeenkomt met 0,4-0,8 x 10 6 mononucleaire cellen. Succesvolle aspiratie wordt visueel worden bevestigd door het verschijnen van bloed in de top van de naald in de basis van de injectiespuit. Indien geen bloed wordt gezien in de injectiespuit is het waarschijnlijk dat een kleine bot of weefsel fragment zit vast in de naald. Dit blijkt uit de naald verwijderd worden door het bewegen van de zuiger op en neer in PBS (dit is een reden waarom de spuit moet worden ingevuld met PBS voor het opzuigen van de BM). Als het weefsel niet kan worden verdreven uit de spuit, gebruik een nieuwe naald en spuit (weer nat de spuit met 200-500 pi PBS).
- Zodra BM succes wordt opgezogen uit het dijbeen, verwijder de naald en spuit uit het dijbeen en de muis.
- Verplaats aangezogen BM een microfugebuis prefilled met 500 ui PBS. Voor de meeste toepassingen de BM cellen moeten vervolgens op ijs bewaard totdat zij worden verwerkt indien mogelijk.
- Na afronding van de procedure, beheren pijnstillende met carprofen 5 mg / kg subcutaan. Verwijder vervolgens de muis uit de narcose en plaats op een verwarmde pad tot volledig hersteld. LET OP: Er mag geen complicaties of ongerief na de aspiratie procedure indien goed uitgevoerd zijn.
- Alvorens terug te keren muizen om de woonwijk, zodat ze in staat zijn om ambulate en bereiken voedsel en water. Let op de muizen voor tekenen van angst of een infectie na de procedure in de komende 24 uur. Symptomen zijn: constante bloeden, bloedarmoede, lusteloosheid. Als een van deze effecten optreedt na de procedure, moet het dier (en) worden gedood. Opmerking: BM aspiratie / bemonstering worden herhaald, maar de herhaalde procedure worden uitgevoerd aan de tegenoverliggende dijbeen herhaalde trauma aan hetzelfde been verhinderen. Er is weinig informatie beschikbaar over de frequency dat BM aspiratie kan worden uitgevoerd. Femorale beenmerg aspiratie wordt algemeen herhaald niet vaker dan om de 2 weken.
2. Beoordeling van Cellulaire Content in Aspirated BM cellen
- Pellet cellen afkomstig uit BM aspiratie en in een microcentrifugebuis door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C of kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ui van ACK rode bloedcellen lysis buffer ("ammonium-chloride-kalium" lysisbuffer).
- Incubeer de cellen in erytrocyten lysis buffer gedurende 10 minuten en voeg 1 ml PBS en spin neer het mengsel opnieuw bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C of kamertemperatuur. Opmerking: De rode bloedcellen gelyseerd pellet bestaat nu uit BM mononucleaire cellen. Deze kunnen worden gesuspendeerd voor FACS kleuring, celtelling, transplantatie, Cytospin analyse en / of enig ander gebruik (zoals BM cellen geoogst uit muizen opgeofferd worden gebruikt).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Femorale BM aspiratie van een live C57/B6 muis werd gebruikt om BM mononucleaire cellen gevolgd door conventionele BM oogst van dezelfde muis na offer te verkrijgen. BM verkregen door de twee werkwijzen mononucleaire cellen werden vervolgens geanalyseerd door (1) cytologische analyse van BM-cellen, (2) het bepalen van de relatieve frequentie van hematopoëtische stam / progenitorcellen (HSPCs), en (3) ex vivo kweken gesorteerde HSPCs. In het laatste experiment, afstammings-negatieve SCA1 + c-KIT werden + (STL) c...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Serial BM aspiratie is een routine procedure kritisch naar klinisch onderzoek van hematologische aandoeningen bij de mens. De mogelijkheid om een analoge seriële bemonstering van BM verrichten muizen voor karakterisatie van de cellulaire samenstelling en bestanddelen van BM gedurende langdurige experimenten is ook zeer waardevol. Deze procedure is bruikbaar voor karakterisering van HSPC's zonder dat de muis, maar ook om de aanwezigheid van andere celtypen in de BM in gevallen waarin de inhoud van het perifere bloe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
O.A.-W. wordt ondersteund door een NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), een U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research (W81XWH-12-1-0041), het Josie Roberston Investigator Program en een Damon Runyon Clinical Investigator Award met ondersteuning van de Evan’s Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 en filter steriel met 0.22 μm vacuümfilter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Voor methocellulose cultuur |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dosis (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Referenties
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
