Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

12.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51669

⸱

6 augustus 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

Samenvatting

We ontwikkeld en gevalideerd een fluorescerende markering methodologie voor klonale volgen van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te bestuderen in vivo hematopoiesis behulp van de muizen beenmergtransplantatie experimenteel model. Genetische combinatorische markering met behulp van lentivirale vectoren die coderen voor fluorescerende eiwitten (KP's) geactiveerd lot van de cel in kaart brengen door middel van geavanceerde microscopie beeldvorming. Vectoren die coderen voor vijf verschillende KP's: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato en mCherry werden gebruikt om gelijktijdig transduce HSPCs, het creëren van een divers palet van kleur gemarkeerd cellen. Beeldvorming met behulp van confocale / twee-foton hybride microscopie maakt gelijktijdig hoge resolutie beoordeling van unieke gemarkeerde cellen en hun nakomelingen in combinatie met structurele componenten van de weefsels. Volumetrische analyse over grote gebieden bekend dat spectraal gecodeerde HSPC-afgeleide cellen niet-invasieve wijze verschillende intacte weefsels, waaronder het beenmerg kan worden gedetecteerd (BM), Voor langere perioden na de transplantatie. Levende onderzoeken gecombineerd video-rate multiphoton enconfocale time-lapse imaging in 4D tonen de mogelijkheid van dynamische cellulaire en klonale volgen op een kwantitatieve wijze.

Inleiding

De productie van bloedcellen, aangeduid hematopoiese wordt onderhouden door een kleine populatie van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs). Deze cellen verblijven in het beenmerg (BM) in een complex micro-omgeving niche bestaande uit osteoblasten, stromacellen, vetweefsel en vasculaire structuren, alle betrokken bij de controle van zelfvernieuwing en differentiatie 1,2. Al intact BM traditioneel ontoegankelijk voor directe waarneming is geweest, de interacties tussen HSPC en hun micro-omgeving grotendeels uncharacterized in vivo. Eerder hebben we een methodologie om de 3D-architectuur van intacte BM te visualiseren met behulp van confocale fluorescentie en reflectie microscopie 3. We kenmerk uitbreiding van EGFP gemarkeerde HSPCs in de BM, maar het gebruik van slechts een enkele FP uitgesloten analyse van regeneratie op klonale niveau. Zeer recent hebben we geprofiteerd van de Lentiviral Gene Ontology (lego) vectoren die constitutief flfluorescerende eiwitten (KP) om efficiënt cellen 4,5 markeren. Co-transductie van HSPC met 3 of 5 vectoren genereert een divers palet van combinatorische kleuren, waardoor het bijhouden van meerdere afzonderlijke HSPC klonen.

Gemarkeerd HSPC combinatie met nieuwe imaging technologie toegestaan ​​om individuele HSPC homing en innesteling te traceren in de BM van bestraalde muizen. LEGO vectoren werden gebruikt om HSPC markeren met 3 of 5 verschillende KP's (van Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato en mCherry) en volg hun innesteling na verloop van tijd in de BM door confocale en 2-foton microscopie, waardoor duidelijke visualisatie van bot en andere matrix structuren, en de verhouding van HSPC klonen componenten van hun micromilieu. HSPC werden gezuiverd zoals het geslacht negatieve cellen van C57BL / 6 muizen BM, getransduceerd met vectoren LEGO en reinfused staartader injectie in myelo-geablateerd congenic muizen. Door het monitoren van grote hoeveelheden van het borstbeen BM weefsel gevisualiseerd we endosteale innesteling plaatsvindt in het begin vanBM regeneratie. Cell clusters met verschillende kleur spectra bleek aanvankelijk dicht bij het bot en vorderde gecentreerd over de tijd. Interessant, na meer dan 3 weken merg bestond macroscopische klonale clusters suggereert verspreiding van hematopoiese afgeleid van individuele HSPCs aansluitend in het merg, dan ruime verspreiding van HSPCs via de bloedbaan. Er was minder kleurendiversiteit op late tijdstippen, suggereert moeilijkheden transduceren langdurige herbevolking cellen met meerdere vectoren.

Bovendien HSPCs gevormd clusters in de milt, een orgaan verantwoordelijk voor hematopoiesis in muizen. -HPSC afgeleide individuele cellen kunnen worden opgelost in de thymus, lymfeklieren, milt, lever, long, hart, huid, spier, vetweefsel en nieren van. De 3D-beelden kan kwalitatief en kwantitatief worden beoordeeld om de verdeling van cellen met minimale verstoringen van de weefsels waarderen. Tot slot, we illustrerend de haalbaarheid van live-dynamische studies in 4D door het combineren van resonante scannen multifoton en confocale time-lapse imaging. Deze methode maakt het niet-invasief hoge resolutie, multidimensionale cel-lot traceren van spectraal duidelijk celpopulaties in intacte 3D architectuur, die een krachtig hulpmiddel in de studie van weefselregeneratie en pathologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle muizen werden gehuisvest en behandeld in overeenstemming met de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health, en ingeschreven in een NHLBI Animal Care en gebruik Comite-goedgekeurde protocol. Vrouwelijke B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) en C57BL / 6 muizen, 6-12 weken oud, werden gebruikt als donor en ontvanger respectievelijk.

Een lijst van materialen, reagentia en apparatuur wordt gegeven in tabel 1.

1 lego transductie van Muis HSPCs en beenmergtransplantatie

Voeren procedures hieronder in een gecertificeerde bioveiligheid niveau 2 (BSL-2) kast (weefselkweek kap) beschreven.

  1. Productie van LEGO vectoren die coderen voor 5 fps
    1. Gebruik de lentivirale "Gene Ontology '(lego) vector plasmiden, die elk coderen voor een ander FP van een sterke constitutieve SFFV promotor, waaronder Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato), en de Lego-C2 (mCherry) welwillend ter beschikking gesteld door Dr Boris Fehse (Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Duitsland); nu ook verkrijgbaar bij Addgene 5-7.
    2. Lego vectoren, zaad 5 x 10 6 293T-cellen in 10 cm schalen (gebruik 12 schotels voor elke vector) 24 uur voor transfectie in 8 ml I10 medium (IMDM aangevuld met 10% FCS en glutamine / penicilline / streptomycine) produceren.
    3. Transfecteren de cellen met calciumfosfaat met behulp van licht gewijzigde CAPHOS kit aanbevelingen:
      1. Voor elke plaat mix 15 ug LEGO vector, 12 pg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug Vorig-TAT, en 1 ug pMD2.G-VSV-G plasmiden in aanwezigheid van 50 pi 2,5 M CaCl2, en voeg water toe tot opbrengst 500 ul totaal volume.
      2. Precipiteer DNA plasmiden met 500 ul 2x HeBS (HEPES-gebufferde zoutoplossing) en incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur voorafgaand aan het toevoegen aan elke plaat van 293T cellen.
      3. Incubeer cellen voor6 uur in een 37 ° C 5% CO2 incubator; verwijder media en voeg verse voedingsbodems 6 uur na transfectie.
    4. Verzamel kweeksupernatanten met lentivirale deeltjes van elke plaat, dagelijks gedurende 3 dagen. Elke collectie dag na bovenstaande toe te voegen verse I10 media om elke plaat.
      1. Filteren door 0,22 pm poriën, zwembad en concentreer supematanten door ultracentrifugatie op een SW28 rotor gedurende 2 uur bij 71.900 xg en 4 ° C.
      2. Resuspendeer de bovenstaande vloeistoffen in 1 ml StemSpan media. Aliquot de lentivirale voorraden in 200 ul en bewaar bij -80 ° C.
  2. Titratie van Lentiviral Deeltjes
    Bepaal de titer van LEGO vector deeltjes verzameld bovenstaande vloeistoffen via kwantificering van transducerende eenheden / ml met behulp van NIH3T3 cellen. Titers mogelijk berekening van het volume van elke vector supernatant die volstaat om de gewenste relatieve multipliciteit van infectie (MOI) voor experimentele doelwitcellen.
    1. Plate 5 x 10 4 NIH3T3 cellen per putje (12-well plaat) in 2 ml I10 media een dag voor de titratie.
    2. Bereid 5-voudige seriële verdunningen van supernatanten vector in I10 media gesupplementeerd met protamine sulfaat (4 mg / ml is 1000x).
    3. Verwijder de media uit de cellen, en te vervangen door 500 ul van supernatant verdunningen die het equivalent van 2, 0,8, 0,32 en 0,128 pi geconcentreerd virus.
    4. Bepaal het aantal (nr) aanwezige cellen per putje bij de transductie, tellen een controlewell.
    5. 6 uur na transductie, voeg 2 ml I10 media en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
    6. Oogst de cellen van elk putje met trypsine-EDTA, en bepaalt het percentage fluorescerende cellen (% FP) via flowcytometrie.
    7. Bereken de titer als volgt, de gemiddelde verkregen voor elk putje (verdunning) titers resulterend in een FP% tussen 1 en 50%: Titer (vector deeltjes / ml) = nrx% FP / Volume van vector supernatant (ml). Het gemiddelde van de verkregen voor elke verdunning als de% FP is tussen 1 en 50% titers.
  3. Mouse Cell Collection, zuivering, transductie en Transplantatie (schematisch getoond in Figuur 1A aangepast van Malide et al. 4).
    1. Sacrifice donormuizen door een erkende procedure. Oogst beenmerg van voorste en achterste ledematen: ontleden opperarmbeenderen, dijbenen en scheenbenen, grondig verwijderen van alle spieren, ligamenten en overtollige weefsel uit beenderen, dwars door het einde van elk bot zo dicht mogelijk bij het gewricht, en spoel het beenmerg van het bot met een 27-0 G naald op een spuit met I10 media.
    2. Pellet de gehele beenmergcellen voor 10 min bij 500 xg, 4 ° C en lyseren rode cellen tweemaal met 50 ml ACK buffer. Resuspendeer cellen in 10 ml I10 media.
    3. Zuiver lineage negatieve (Lin) progenitorcellen met de MACS lijn depletie kit volgens een gemodificeerde kit protocol:
      1. Gebruik 30 pl anti-biotine microbolletjes in plaats van 10 gl / 10 7 cellen; Voer de wasstappen met I2 medium (IMDM aangevuld met 2% FCS) in plaats van buffer.
      2. Steek een wasstap tussen de incubatie met biotine-Antibody Cocktail en de incubatie met anti-biotine microbolletjes; en equilibreren van de kolom met I10 plaats van buffer.
    4. Culture Lin cellen gedurende 48 uur bij een begin dichtheid van 5 x 10 5 cellen / ml in StemSpan medium aangevuld met 10 ng / ml murine IL-3, 100 ng / ml murine IL-11, 100 ng / ml humaan Flt-3 ligand, en 50 ng / ml muis stamcelfactor.
    5. Transfer 1 tot 4 x 10 5 cellen 12-putjesplaten bekleed met RetroNectin en transduceren LEGO supernatanten, elk bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 6-7 tot 50% expressie efficiëntie van elke FP bereiken, in aanwezigheid van StemSpan media en cytokines hierboven beschreven en 4 ug / ml protaminesulfaat.
    6. Transduceren cellenwaarbij elke LEGO vector afzonderlijk beschreven in stap 1.3.5 en meng cellen na transductie (Mix genoemd) of co-transduceren cellen met 5 LEGO vector bovenstaande vloeistoffen gelijktijdig (genoemd Co). Verwijder cellen 24 uur later, eenmaal wassen met StemSpan media zonder cytokines, en mengen ze in StemSpan media zonder cytokines voor transplantatie, of overbrengen naar vers medium met cytokinen, en cultuur voor een extra 96 ​​uur voor confocale microscopie en flowcytometrie.
      1. Voer beenmergtransplantatie door het inbrengen getransduceerde Lin- HSPCs via staartader injectie in 11 Gy enkele dosis voorgevulde bestraalde ontvangers (6-18 uur vóór transplantatie) ontvangers, in een volume van 100 ui op een celdosis per muis overeenkomend met 1 -4 x 10 5 Lin- cellen oorspronkelijk plated voor transductie. In elk experiment transplantatie een cohort van dieren met dezelfde populatie van getransduceerde donor BM cellen.
      2. Voor in vitro karakterisering van getransduceerde HSPC's, de cultuur van de cellen voor een extra 4-5 dagen in StemSpan aangevuld met cytokines en analyseren door flowcytometrie voor transductie efficiëntie, en met behulp van microscopie voor diversiteit kleur.
        1. Offer individuele muizen en weefsels en organen ophalen voor beeldvorming op verschillende tijdstippen tot 120 dagen na transplantatie.
          1. Spray met ethanol de vacht van de muis en incisie van de huid aan de buikzijde vermijden haar verspreiding.
          2. Ontleden en accijns volgens standaard procedures de milt, popliteale lymfeknopen, long, hart, huid, vetweefsel, skeletspier, nier, lever, en de onderlinge toegang tot schedeldak.
          3. U kunt ook gebruik maken van calvaria of het opzetten van een bot venster voor live-imaging herhaaldelijk in de tijd 2,8,9 of afbeelding oppervlakkige organen zoals de huid en de lymfeklieren in het levende dier.
        2. Plaats individuele organen in 35 mm aantal 0 afdekglas kweekschaaltjes in 50-10056, l PBS voor beeldvorming die intact zonder snijden, fixatie of verder verwerkt zoals beschreven in stap 2.5.
        3. Voor volumetrische beeldvorming, houden de organen in in koud PBS tot gebruik. Voor time-lapse imaging gaat onmiddellijk beeldvorming organen in DMEM, 10% FBS bevattende 20 mM HEPES bij 37 ° C

2 confocale en twee-foton microscopie en beeldanalyse

  1. Voeren microscopie beeldvorming met behulp van een Leica SP5 vijf kanalen confocale en multi-systeem uitgerust met een multi-line Argon, diode 561 nm, 594 nm HeNe en HeNe 633 nm zichtbaar lasers. Gebruik in 2-foton-modus, een gepulste femtoseconde Ti: saffier (Ti-Sa) laser, afstembare voor excitatie van 680 tot 1.080 nm met dispersie correctie. Gebruik in experimenten met rood-verschoven KP (tdTomato en mCherry), een optische parametrische oscillator (OPO) laser met de uitgang golflengte reiken tot 1,030-1,300 nm, achtereenvolgens of gelijktijdig met thij Ti-Sa laser.
  2. Afbeelding verschillende weefsels met behulp van een HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 NA water dompelen doelstelling (WD = 2,5 mm), een HC-PLAPO-CS 20X / 0,70 NA droge doelstelling (WD = 0,6 mm), of HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA water immersie objectief (WD = 0,6 mm).
  3. Verkrijgen confocale fluorescentie spectra verzamelen lambda stacks (xyλ) uitgestraalde licht in 5 nm-bandbreedtes van het zichtbare spectrum van BM-cellen getransduceerd met een vector FP LEGO en controle, niet-getransplanteerde BM.
    1. Werkwijze beelden met de Leica LAS-AF v2.4.1 software referentie spectra van alle 5 KP en van autofluorescentie (figuur 2A) creëren. De individuele FP spectra en het verschil in helderheid fluorescentie (uitgedrukt als% van EGFP) van Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) en mCherry (47%) op 5 opeenvolgende imaging kanalen als volgt: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), en mCherry (594 / 618-670 nm) ( Figuur 2B).
    2. Valideren accurate KP scheiding, zoals cellen getransduceerd met elke individuele FP's zijn alleen zichtbaar in het overeenkomstige kanaal en afwezig zijn van de rest (figuur 2C). Daarnaast is deze gedefinieerd meerdere kanalen creëert een unieke 5-kanalen "kleurendruk" die na kleuranalyse en klonale volgen maakt en heeft het voordeel dat opnametijden opzichte spectrale beeldvorming.
  4. Afzonderlijke fluorescentie-emissie, in 2-foton modus met hoogefficiënte custom dichroitische spiegels en laat met vier kanalen niet descanned detector (NDD) als volgt: een dichroïsche spiegel 568 nm gevolgd door een dichroïsche spiegel bij 465 nm, gevolgd door een 452/45 nm emissie filter voor SHG of autofluorescentie en Cerulean, een 525/40 nm emissie filter voor EGFP of Venus, en een 648 nm dichroïde spiegel en 620/60 nm emissie-filter voor tdTomato of mCherry.
    1. Reveal structurele informatie door twee-foton microscopie iNtrinsic contrast beeldvorming (zoals hierboven beschreven) weefsel autofluorescentie van elastine, NADH, (geëxciteerd bij 780 nm) en tweede harmonische gegenereerde signaal (SHG) van bot en fibrillair collageen (geëxciteerd bij 920 nm of 860 nm in een back-verstrooide verzameld richting) 10,11.
  5. Voor 3D volume rendering, verzamel serie xyz afbeeldingen (typisch 1 x 1 x 4 micrometer 3 voxel) langs de z-as 5 urn intervallen over een bereik van diepten (150-300 urn) hele beenmerg en andere weefsels, over grote gebieden met de tegel functie van de software automatisch gestikte volumes omvattende een hele borstbeen fossae, ongeveer 2,5 x 1,2 mm2 (xy) en 300 urn (z) (figuren 2D-2E) en Film 1 genereren.
    1. Afbeelding calvarial direct merg door de schedel zonder snijden 2, 8.
    2. Sectie borstbeen langs het sagittale vlak (tweedeling) en vervolgensdwars op de voeg tussen afbeelding 2 sternaal gracht en door het snijvlak 3,4,12 (overzicht in Figuur 1B aangepast van Takaku cs 3).
  6. Voor 4D time-lapse imaging plaatst vers uitgesneden popliteale lymfeknopen, milt, longen of calvarial botsamples uncut op 35 mm getal 0 dekglaasje kweekschalen in 50-100 pi DMEM, 10% FBS bevattende 20 mM HEPES bij 37 ° C en het gebruik van 2-photon Ti-Sa excitatie (860 nm) in combinatie met confocale excitatie (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) en Leica resonantie scanner (8000 Hz / sec), het nemen van z-stacks (~ 80 pm) bij 20 sec intervallen gedurende 1 uur.
    1. Voor gelijktijdige driekleurige 2P imaging gebruik Ti-Sa afgestemd op 860 nm gelijktijdig met het OPO laser (afgestemd op 1130 nm voor tdTomato, of 1.140 nm mCherry) (Film 2).
  7. Reconstructie en analyse van 3D-volumes en 4D tijd sequenties
    1. Gebruik Imaris x64 softwzijn versie 7.6, of alternatieve software pakketten om betegelde stapels ruwe beelden zetten in volume rendered (3D) data van fluorescerende cellen in beenmerg en andere weefsels en exporteren als 3D-rotatie-films, zoals eerder beschreven 3,4 (Film 1) stap voor stap voorbeeld:
      1. In Imaris, Open afbeelding van de z-stack; Selecteer "overtreffen" om het 3D volume visualisatie weergegeven.
      2. Gebruik "navigeert" om het volume te draaien 360 °.
      3. Selecteer "Animation" om een ​​animatie te maken; Gebruik keyframes aan geselecteerde uitzicht, zoom, rotaties van het volume toe te voegen; Bekijk een voorbeeld van de film, als nodig bewerken en sla het bestand op in een gewenste filmformaat (ex: avi, mov).
    2. Voor kwantitatieve bepaling van de 3D-cel kloon en frequentie posities, afmetingen en distributie verder bewerken z-stacks met de Imaris XT modules MATLAB toepassingen uitvoeren afstand meas integrerenurements (met een afstand transformatie algoritme) en clusters analyse, zoals eerder beschreven 3,4. Transformeer de sequenties van het beeld stacks na verloop van tijd in-volume gerenderde vier-dimensionale (4D) films met Imaris x64 software, en gebruik spot en oppervlakte-analyse voor semiautomated bijhouden van cel beweeglijkheid in drie dimensies met behulp autoregressieve beweging algoritmen.
    3. Voeren multispectrale analyse van cellen als volgt: haal de multi-color label plekken door het toevoegen van alle 5 kanalen via kanaal rekenkunde van Imaris XT in een nieuw kanaal; bepalen alle spots (cellen) de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in elk van de 5 component kanalen. De waarden in Excel software exporteren naar grafieken weergeven van de unieke "kleurendruk" dwz de relatieve% van elke FP in individuele cel (figuur 2E grafiek) plotten. Corrigeer de voor weefsel drift data, en bereken cel snelheid en verplaatsing in de tijd, spoor lengtes, paden en afstanden; export waarden in Excel software om grafieken te plotten. Assembleren samengestelde figuren met Adobe Photoshop CSS 5 software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Whole-mount 3D confocale / 2-foton microscopie reconstructies van het borstbeen beenmerg tijdsverloop bleek de innesteling en uitbreiding van getransplanteerde co-opnamen van 5 bps in een patroon met opvallende kenmerken: klonen bleek duidelijk afgebakend, homogeen gemarkeerd met breed palet aan kleuren in eerste instantie en vooruitgang tijd preferentieel bevatten cellen van voornamelijk een kleur. Confocale microscopie opstart en representatieve voorbeelden van beeldvorming 5fps gemarkeerde HSPC in het borstbeen beenm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We beschrijven hier de details van een krachtige methodologie onlangs bedacht voor klonale cell tracking, het combineren van de grote diversiteit gegenereerd door combinatorische markering met-5FP coderen LEGO vectoren en beeldvorming met tandem confocale en 2-foton microscopie om volumetrische en dynamische beeldvorming te realiseren in levende weefsels. Dit breidde het gebruik van FP-gebaseerde kleur markering door het opnemen van confocale spectrale identiteit in 5 "verschillende" 8-bit kanalen. Dus de rela...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Heart, Lung, Blood Institute van de National Institutes of Health. We danken Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Duitsland) voor het verstrekken van de vijf LeGO vector plasmides; Christian A. Combs en Neal S. Young (NHLBI, NIH) voor discussies, ondersteuning en aanmoediging gedurende dit onderzoek, en Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) voor hulp bij staartvene-injecties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Productie van virussen
LeGO-Cer2Addgene27338Expressie van Cerulean
LeGO-G2Addgene25917Expressie van eGFP
LeGO-V2Addgene27340Expressie van Venus
LeGO-T2Addgene27342Expressie van tdTomato
LeGO-C2Addgene27339Expressie van mCherry
Calciumm Phosphate Transfectie KitSigmaCAPHOS-1KT
WeefselkweekschaalBD Falcon353003
IMDMGibco, Life Technology12440-053
Fetaal bovien serum inactief door verhittingSigmaF4135-500ML
Pen Strep GlutamineGibco, Life Technology10378-016
CentrifugebuizenBeckman Coulter326823
SW28 UltracentrifugeBeckman CoulterL60
Millex Spuit aangedreven filter unit (0.22 µm)MilliporeSLGS033SS
Muiscelcollectie, zuivering, transductie en transplantatie
ACK lyse bufferQuality Biologicals Inc.118-156-101
Lineage Cel Depletie Kit (muis)Miltenyi Biotec Inc. USA130-090-858
LS kolommen + buizenMiltenyi Biotec Inc. USA130-041-306
Pre-Separation Filters (30 µm)Miltenyi Biotec Inc. USA130-041-407
StemSpan SFEM serumvrij medium voor de kweek en expansie van hematopoëtische cellen (500 ml)StemCell Technologies Inc 9650
Murine IL-11 CFR & D Systems Inc418-ML-025/CF100 µg/ml is 1.000x
Recombinant murine SCFRDI Division of Fitzgerald Industries Intl RDI-2503100 µg/ml is 2.000x
Recombinant murine IL-3R & D Systems Inc403-ML-05020 µg/ml is 2.000x
FLT-3 LigandMiltenyi Biotec Inc. USA130-096-480100 µg/ml is 1.000x
12-well platen, CostarCorning Inc.3527
RetronectinTakara Bio IncT100A/BResuspenderen bij 50 µg/ml
Protamine SulfaatSigmaP-40204 µg/ml is 1.000x
Confocal en twee-foton microscopie
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro, Mediatech Inc.25-060-CI
Glazen bodem kweekschaal P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
Glazen bodem kweekschaal P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Kamerdeksel met vierkamerdeksel #1 Borosilicaat dekselglas; 4-kamerThermo Scientific155383
Dekglasjes 22 mm No 2Thomas Scientific6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS vijf kanalen confocale en multi-foton microscoopLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph laserbereik 680-1.080 nmCoherent
Chameleon Compact OPO laserbereik 1.030-1.350 nmCoherent
HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water duikobjectief (WD=2,5 mm)Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA droge objectief (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersie objectief (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
Imaris software versie 7.6Bitplane

Referenties

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
  7. Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
  8. Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
  9. Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
  10. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
  11. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  12. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

Tags

Hematopo tische stam progenitorcellenfluorescent eiwitmarkeringconfocale microscopietweefotonmicroscopiebeenmergtransplantatielentivirale vectortransductieclonale trackinganalysemulticolor imaging4D time lapsespectrale ontmenging
In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.