Transplantatie van Pulmonary Valve een muis model van Heterotope Heart Transplantation

Samenvatting

Om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen neotissue vorming en stenose ontwikkeling in tissue engineered hartkleppen begrijpen, een muizenmodel van heterotopische hartklep transplantatie werd ontwikkeld. Een pulmonale hartklep werd getransplanteerd naar ontvanger via de heterotopische harttransplantatie techniek.

Samenvatting

Tissue engineered hartkleppen, vooral ontceld kleppen, beginnen aan kracht winnen in klinisch gebruik van reconstructieve chirurgie met gemengde resultaten. Echter, de cellulaire en moleculaire mechanismen van de neotissue ontwikkeling, klep verdikking en stenose ontwikkeling niet uitgebreid onderzocht. Om de bovenstaande vragen te beantwoorden, ontwikkelden we een muizen heterotopic hartklep transplantatie model. Een hartklep werd geoogst van een afsluiter donor muis en getransplanteerd naar een hart donor muis. Het hart met een nieuwe klep werd heterotoop getransplanteerd naar een ontvanger muis. De getransplanteerde hart toonde zijn eigen hartslag, onafhankelijk van de hartslag van de ontvanger. De doorbloeding werd gekwantificeerd met behulp van een hoge frequentie ultrasoon systeem met een gepulste golf Doppler. De stroming door de geïmplanteerde pulmonaalklep toonde aanvoer met minimale oprispingen en de piekstroom was dicht bij 100 mm / sec. Dit muizenmodel van hartklep transplantatie is highly veelzijdig, zodat het kan worden gewijzigd en aangepast aan verschillende hemodynamische omgevingen en / of kan worden gebruikt met verschillende transgene muizen neotissue ontwikkeling bij een tissue engineered hartklep.

Inleiding

Aangeboren cardiovasculaire defecten zijn een van de belangrijkste oorzaken van kindersterfte in de westerse wereld ^1,2. Onder hen, pulmonaalklep stenose en bicuspide aortaklep gebreken zijn een vaak voorkomende vorm ^3. Hartklepvervanging operatie is een routine keuze van reconstructieve chirurgie; echter complicaties zoals stenose en verkalking van de hartklep en levenslange afhankelijkheid van anticoagulantia zijn een belangrijke bron van chronische ziekte en dood ^4-7. Bovendien is het gebrek aan groeipotentieel vereist herziening operaties, die verder verhoogt de mortaliteit van deze jonge patiënten ^4,8,9.

In een poging om een functionele vervanging hartklep met groeipotentieel, Shinoka et al.. Gezaaide autologe cellen zich ontwikkelen op een biologisch afbreekbare synthetische hartklep ^8. De kunststof klep getransformeerd naar een native hartklep achtige structuur met groei potentiometerAl. Voorlopige grote dierlijke studies aangetoond dat de haalbaarheid van het gebruik van deze methode om een functionele hartklep ¹⁰ te creëren. Echter, op lange termijn implantatie studies aangetoond slechte duurzaamheid gevolg van de geleidelijke verdikking van de klep neotissue resulteert in vernauwing van de hartklep. Werken vanuit Sodian et al.. Gebruikt de Shinoka methodologie, maar uiteindelijk vervangen de PGA matrix met een biologisch afbreekbare elastomeer, die de biomechanische eigenschappen van het weefsel gemanipuleerde afsluiter gaf de bouw van een meer fysiologisch profiel ^9,11,12. In de in vivo studie, ondanks het succes van implantatie, een confluente endotheelcellen bekleding was niet gevormd die het succes van de steiger ¹² lange termijn kunnen beperken.

Om rationeel ontwerpen van een verbeterde tweede generatie synthetische hartklep, een muizenmodel van hartklep transplantatie werd opgericht om de cellulaire en moleculaire mechanismen underlyin onderzoekeng neotissue vorming, klep verdikking en stenose ontwikkeling. Muizen-modellen bieden een breed scala aan moleculaire reagentia, waaronder transgenics, die niet direct beschikbaar in andere soorten ⁷ zijn. In deze hartklep transplantatie model, werd een ex vivo syngeen pulmonale hartklepvervanging eerst uitgevoerd; en dan het hart met de geïmplanteerde hartklep werd heterotoop geïmplanteerd in een syngene gastheer met een microchirurgische techniek. Dit model maakt hartklep vervanging zonder de noodzaak van cardiopulmonale bypass.

In dit artikel een gedetailleerde uitleg van een hartklep oogst, donorhart voorbereidingen, hartklep transplantatie, en heterotopische harttransplantatie wordt beschreven. De resultaten lieten een continue hartslag van het donorhart, die onafhankelijk van de ontvanger hartslag was. De bloedstroom door het geïmplanteerde pulmonale klep werd gemeten met een hoogfrequente ultrasone systeem met pulserende golf doenppler.

Protocol

Opmerking: Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Nationwide Children's Hospital Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Pulmonale hartklep Oogst van een hartklep Donor Mouse

1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor de operatie: 1x fijne schaar, 3x micro tang, 2x micro vasculaire klemmen, 1x klem toepassen tang, 1x micro naaldhouder, 1x lente schaar, 1x oprolmechanisme.
2. Een 6-8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muis als pulmonaire hartklep donor. Verwijder de muis uit de kooi en wegen, dan euthanize met een ketamine / xylazine cocktail (ketamine, 200 mg / kg en xylazine, 20 mg / kg, IP) overdosis.
3. Knip de borst en plaats de muis in een dorsale recumbence positie op een pad. Maak dan de thoracotomie. Expose het hart, maak een kleine snee in de rechterboezem, en perfuseren de linker ventrikel met ijskoude zoutoplossing.
4. Botweg ontleden de longslagader (PA) van de oplopende eenorta. Knip de pulmonaalklep (PV), samen met 2 mm manchet van longslagader. Gooi de rest van het hart.
5. Bewaar de PV koude heparine en zoutoplossing (100 eenheden / ml). Opmerking: De PV kan de oplossing gedurende twee uur vóór de transplantatie om het donorhart.

2. Donorhart Voorbereiding

1. Een 6-8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muis als donor hart. Verwijder de muis uit de kooi en wegen, dan euthanize met een ketamine / xylazine cocktail (ketamine, 200 mg / kg en xylazine, 20 mg / kg, IP) overdosis. Dit is een terminal procedure.
2. Knip de borst en plaats de muis in een dorsale recumbence positie op een pad. Maak dan de thoracotomie. Botweg scheiden het hart, vena cava inferior (IVC), vena cava superior (SVC), stijgende aorta, PA, en pulmonale ader. Perfuse het IVC met ijskoud steriele zoutoplossing.
3. Ligeren de IVC, SVC, en pulmonale ader met 6-0 zijden hechtdraad en snijd superieur aan deligaturen.
4. Snijd de aorta en de PA met 2 mm manchet.
5. Knip de PV en gooi het weg.

3. Heart Valve Transplantation op een donorhart

1. Onmiddellijk na stap 2.5, plaatst u de hartklep van stap 1.5 in het donorhart en oriënteren van de hartklep.
2. Zet de PV met een steek aan de rechterzijde van de klep met 10-0 monofilament-hechtingen op conische naalden en gaan continu hechten met 5-6 steken vanaf de andere zijde van de PV.
3. Na het afronden van de voorkant, draai het hart horizontaal en beginnen aan de achterkant van de PV te hechten op het donorhart.
4. Bewaar het hart in een koude steriele heparine / zoutoplossing. Opmerking: Het donorhart kan de oplossing gedurende twee uur vóór implantatie de ontvanger muis.

4. Heterotope Heart Transplantation op een ontvanger Muis

1. Een 6-8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muizen werd gebruikt als een reciwie de goederen overgaan. Verwijder de muis uit de kooi en wegen, vervolgens verdoofd met ketamine / xylazine cocktail (ketamine, 100 mg / kg en xylazine 10 mg / kg). Ketoprofen (5 mg / kg) als preanesthesia analgeticum.
2. Na het controleren van het niveau van sedatie door staart knijpen, clip de buik-en borsthaar. Smeer de ogen met steriele oogzalf, en plaats de muis in een dorsale recumbence positie op een pad. Ontsmet de buik met betadine en alcohol pads. Dek de muis met een steriel laken en alleen de incisie gebied bloot.
3. Maak een middellijn laparotomie incisie van onder de xyphoid de suprapubische regio, en steek een zelf behoud oprolmechanisme. Wikkel de darmen in een zoutoplossing bevochtigd gaas. Botweg de infrarenale aorta en vena cava definiëren.
4. Plaats twee 6-0 zijden hechtingen proximaal en distaal rond de aorta en IVC bloedsomloop beperken.
5. Plaats het donorhart aan de rechterzijde van de abdominale aorta en dek deze af met steriel gauZE. Hydrateren met een zoutoplossing.
6. Een aortotomy in de abdominale aorta met een 30 G naald en breiden de opening met een schaar om de grootte van de donor aorta.
7. Voer een end-to side anastomose met behulp van steriele 10-0 monofilament hechtingen op taps toelopende naalden. Zet de donor aorta met een steek aan de proximale uiteinde van de opening in de abdominale aorta en gaan continu hechten met 4-5 steken uit het distale einde van de abdominale aorta.
8. Flip het hart aan de linkerkant, dek het af met een zoutoplossing toegediend gaas, en beginnen om continu te hechten met 4-5 steken uit het distale einde van de abdominale aorta.
9. Wordt venotomie in de IVC met een 30 G naald en breiden de opening om de grootte van de donor longslagader.
10. Voer een einde aan zijkant anastomose met behulp van steriele 10-0 monofilament hechtingen op taps toelopende naalden. Zet de donor PA met een steek aan het proximale uiteinde van de opening in de IVC en gaan continu hechten met 4-5 steken uithet distale uiteinde van de inferior vena cava. Deze keer, omdat de aorta in de weg, zorg ervoor dat het hechten van de linker wand van de PA van de donor is aan de binnenkant van het IVC.
11. Spoel de IVC lumen met heparine en zoutoplossing (100 eenheden / ml). Sluit de rechterwand van de donor en de ontvanger PA IVC door voortdurend hechten zij aan het distale einde.
12. Verwijder de distale ligatuur en de controle van de bloeding door het toepassen van een actueel absorbeerbare steriele hemostaat middel. Wanneer de bloeding stopt helemaal, verwijder de proximale hechting en de controle van de bloeding op dezelfde manier.
13. De terugkeer van de darmen en sluit de buikspieren en huid in twee lagen met een 6-0 zwart polyamide monofilament hechtdraad.
14. Injecteer 0,5 ml zoutoplossing subcutaan en plaats de muis in een herstel kooi op een opwarming pad totdat de muis is volledig mobiel. Na herstel, de terugkeer van de muis om een ​​nieuwe kooi met papier beddengoed. Geef pijnstillers (Ibuprofen, 30 mg / kg, drinkwater) voor 48 uur. Doenniet een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld terug.

Resultaten

Figuur 1 toont het schema van de hartklep transplantatie model met behulp heterotopische harttransplantatie. De hartklep werd geoogst van een donorhart en geïmplanteerd op een hart van een tweede donor muis. Dan het hart met de nieuwe hartklep werd geïmplanteerd om de buik van een ontvanger muis. Figuur 2 toont een illustratie van de geïmplanteerde hart op de buik ruimte (A), direct na harttransplantatie (B), en 5 minuten na transplantatie. Na verwijder...

Discussie

Het sterftecijfer van deze procedure is bijna 20%, die voornamelijk veroorzaakt door bloeding op de PV transplantatie plaats en anastomose aan de aorta donor naar de ontvanger abdominale aorta. In de meeste gevallen, het sterftecijfer aanzienlijk afneemt 48 uur na de operatie. De overleving muizen vertoonden sterke hartslag en bloedstroom door het geïmplanteerde PV. Het hele proces duurt vier uur voor een ervaren micro chirurg. Het zal ongeveer 250 muizen te nemen om de techniek onder de knie. Het heterotope harttranspl...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DPBS	Gibco	14190-144
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weken
Ketamine Hydrochloride Injectie	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine steriele oplossing	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparine Natrium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Zoutoplossing (steriele 0,9% natriumchloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0,9% natriumchloride-injectie	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum oogzalf	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Jodium-prep pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol-prep pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Wattenstaafjes met katoen	Fisher Sientific	23-400-118
Fijne schaar	FST	14028-10
Micro-Adson pincet	FST	11018-12
Klemapplicerend pincet	FST	00072-14
S&T vasculaire klem	FST	00396-01
Verenschaar	FST	15008-08
Colibri retractoren	FST	17000-04
Dumont #5 pincet	FST	11251-20
Dumont #7 - fijn pincet	FST	11274-20
Dumont #5/45 pincet	FST	11251-35
Tish naaldhouder/pincet	Micrins	MI1540
Zwarte polyamide monofilament naad, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	Voor het naaien van de transplantaat
Zwarte polyamide monofilament naad, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	Voor sluiting van spieren en huid
Niet-geweven sponzen	McKesson Corp.	94442000
Absorbeerbare hemostaat	Ethicon	1961
1 ml spuit	BD	309659
3 ml spuit	BD	309657
10 ml spuit	BD	309604
18 G 1 1/2 inch, naald	BD	305190
25 G 1 inch, naald	BD	305125
30 G 1 inch, naald	BD	305106
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Verwarmingspad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500
VEVO2100 hoge frequentie ultrasone	VisualSonics	http://www.visualsonics.com/vevo2100	Het catalogusnummer en de prijs kunnen worden verkregen van de verkoopvertegenwoordigers.
Ultrasone transmissiegel	Parker Laboratories, INC.	01-02
Table Top Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip, INC.	901806
Isofluraan	Baxter	1001936060