De Focus Formation Assay verschaft een eenvoudige methode om de transformerende potentieel van een kandidaat oncogen beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Focus Formation: A-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een Gene bepalen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Maligne transformatie van cellen wordt meestal geassocieerd met verhoogde proliferatie, verlies van contactremming, verwerving van verankeringsonafhankelijk groeipotentieel en het vermogen om tumoren te vormen in experimentele dieren1. In NIH 3T3 cellen is bekend dat de Ras signaaltransductieroute veel van deze gebeurtenissen triggert, wat bekend staat als Ras transformatie. De introductie van een overgeëxprimeerd gen in NIH 3T3 cellen kan morfologische transformatie en verlies van contactremming bevorderen, wat kan helpen om het oncogene potentieel van dat gen van belang te bepalen. Een test die een eenvoudige methode biedt om één aspect van het transformerende potentieel van een oncogene te beoordelen, is de Focus Formation Assay (FFA)2. Wanneer NIH 3T3 cellen normaal in cultuur delen, doen ze dat totdat ze een confluent enkellaags monolaag bereiken. Echter, in aanwezigheid van een overgeëxprimeerd oncogene, kunnen deze cellen beginnen te groeien in dichte, meerlagige foci1 die kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door kristallen violet of Hema 3 kleuring. In dit artikel beschrijven we het FFA protocol met retrovirale transductie van het gen van belang in NIH 3T3 cellen, en hoe de aantallen foci door middel van kleuring te kwantificeren. Retrovirale transductie biedt een efficiëntere methode van genlevering dan transfectie, en het gebruik van een ecotrope muisretrovirus biedt een bioveiligheidscontrole bij het werken met potentiële humane oncogenen.
Inleiding
Tumorcellen kunnen worden onderscheiden van hun normale tegenhangers diverse wijzigingen van patronen van genexpressie te epigenomics morfologische en proliferatieve veranderingen. Onder de laatste, verminderde afhankelijkheid van serum, verlies van contact (dichtheid) remming, de verwerving van verankering-onafhankelijke proliferatie en, uiteindelijk, het vermogen om tumoren te vormen wanneer geïnjecteerd in dieren zijn nuttig meetbare maligne transformatie 3. Verschillende in vitro en in vivo assays zijn ontwikkeld voor cellulaire transformatie. In vitro assays gericht op het identificeren en meten van veranderingen in cultuur ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Het maken van de virale vectoren
De coderende sequenties voor het gen van belang, evenals de positieve en negatieve controles, worden in pBABEpuro ingevoegd traditionele kloneringsmethoden (PCR amplificatie, restrictie digestie en ligatie). Er zijn vier restrictieplaatsen van de vector waarin het DNA kan worden ingebracht: BamHI, SnaBI, EcoRI en Sali.
- Bereid transfectie-grade plasmide-DNA van competente cellen met behulp van de QIAGEN plasmide midi kit.
- Meet DNA-concentratie met behulp van een NanoDrop2000 spectrofotometer.
2. Retrovirus Production
De Pl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
MXD3 is een basis helix-loop-helix leucine zipper (bHLHZ) transcriptiefactor die lid is van de MYC / MAX / MAD netwerk. Het is een atypisch lid van de familie MAD 13-15, en er is gemeld betrokken bij carcinogenese 16,17. Vergeleken met pBABEpuro (negatieve controle) en MYC (positieve controle), NIH 3T3 gerechten waar MXD3 werd overexpressie significant minder foci (figuur 1A). De gegevens in Figuur 1B werden verzameld op verschillende experimenten significantie te .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De FFA biedt een snelle en eenvoudige methode om maligne transformatie in vitro evalueren. Het is vatbaar voor screening van een relatief groot aantal kandidaat-genen, en zijn bescheiden technische eisen maken het kosten-effectief is. Verder kunnen twee of meer genen co-expressie (soms aangeduid als een "samenwerking" assay) om de tumorigene potentieel van de combinatie te evalueren. De voordelen van deze bepaling afhankelijk zijn eenvoudige techniek, het gemak van kwantificering en de relatief korte .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH directeur Nieuwe Innovator Award Program (ED). AA werd mede ondersteund door undergraduate awards van het National Cancer Institute en de National Science Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | kloneringsvector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cellijn voor virale productie |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cellijn voor focusvormingstest |
| 10 ml BD Luer-Lok tip spuit | BD Biosciences | 309604 | reagens voor virale productie |
| 0.45 μm Puradisc Spuitfilter | Whatman | 6750-2504 | reagens voor virale productie |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | reagens voor celtransfectie |
| Polybrene Infectie / Transfectiereagens | EMD Millipore | TR-1003-G | reagens voor celtransfectie |
| Kristalviolet | Fisher Scientific | C581-25 | reagens voor celkleuring |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmide-zuivering |
| BD Falcon weefselkweekschalen | BD Biosciences | 353003 | celkweekbenodigdheden |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | celkweekmedium |
| 0.05% Trypsine-EDTA | Gibco | 25300-054 | celkweekbenodigdheden |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | celkweekmedium |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | celkweekmedium |
Referenties
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
