Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

39.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51751

⸱

8 september 2014

 ,  , 
1CNRS, UMR-5203, Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, 2Inserm, U661, Montpellier, 3Universités de Montpellier

In dit artikel

Samenvatting

Dopaminerge neuronen spelen een essentiële regulerende rol in de hersenen. Hun verlies wordt geassocieerd met de ziekte van Parkinson. In deze video laten we zien hoe je primaire culturen van centrale dopaminerge neuronen kunt genereren vanuit embryonaal muizen mesencephalon. Dergelijke culturen zijn nuttig om de extreme kwetsbaarheid van deze neuronen voor verschillende stressfactoren te bestuderen.

Samenvatting

Dopaminerge neuronen van minder dan 1% van het totale aantal neuronen in de hersenen. Deze lage hoeveelheid neuronen regelt belangrijke hersenfuncties zoals motorische controle, motivatie, en het werkgeheugen. Nigrostriatale dopaminerge neuronen selectief degenereren bij de ziekte van Parkinson (PD). Deze progressieve neuronale verlies wordt ondubbelzinnig verband met de motoren symptomen van de pathologie (bradykinesia, rust tremor, en spierstijfheid). De belangrijkste agent die verantwoordelijk is van dopaminerge neuronen degeneratie is nog onbekend. Echter, deze neuronen lijken uiterst kwetsbaar in diverse omstandigheden. Primaire kweken vormen een van de meest relevante modellen eigenschappen en kenmerken van dopaminerge neuronen te onderzoeken. Deze culturen kunnen om te stoppen of te vertragen neuronale degeneratie aan verschillende stress-agenten die PD pathologie nabootsen en neuroprotectieve verbindingen worden ingediend. De talrijke transgene muismodellen van PD die gener zijn geweesteerde in het laatste decennium van de belangstelling van onderzoekers voor dopaminerge neuronen culturen verder toegenomen. Hier, de video protocol staat de delicate dissectie van embryonale muizenhersenen. Precieze excisie van ventrale mesencephalon cruciaal is voor neuronale kweken voldoende rijk aan dopaminerge cellen te verkrijgen latere studies laten. Dit protocol kan worden gerealiseerd met embryonale transgene muizen en is geschikt voor immunofluorescentie kleuring, kwantitatieve PCR, tweede messenger kwantificering of neuronale dood / overleving assessment.

Inleiding

Dopamine, een van de belangrijkste neurotransmitters 1,2, wordt vooral vrij door dopaminerge (DA) neuronen. De meeste DA neuronen bevinden zich in het ventrale gedeelte van het mesencephalon 2-6. Schematisch kunnen middenhersenen DA neuronen worden onderverdeeld in drie anatomisch en functioneel verschillende projectiesystemen: mesostriatal, mesolimbic en mesocorticale paden 2,5. De nigrostriatale route is betrokken bij motorische gedrag, de mesolimbic wegen spelen een belangrijke rol bij versterking, motivatie en leren, dat de dopaminergische paden projecteert de prefrontale cortex worden betrokken bij cognitie 2.

DA neuronen betrokken zijn bij verschillende menselijke neurologische aandoeningen zoals schizofrenie, aandacht tekort, hyperactiviteit stoornis en de ziekte van Parkinson (PD) 2,4. PD wordt gekenmerkt door een progressieve en selectieve degeneratie van DA neuronen verbinden substantia nigrapars compacta (SNc) het striatum. Het verlies van de nigro-striatale DA neuronen leidt tot ernstige depletie van dopamine in het striatum die verantwoordelijk van de motorische symptomen van PD (bradykinesie, rust tremor, rigiditeit en) 7. De eerste oorzaak van de idiopathische PD is niet vastgesteld en de huidige behandelingen zijn alleen symptomatisch, gericht op het herstellen van dopamine-niveau in het striatum. De meest voorgeschreven geneesmiddel L-Dopa (Levodopa), de natuurlijke voorloper van dopamine. Hoewel de toediening van Levodopa compenseert het verlies van dopamine voor een bepaalde tijd, motorische complicaties optreden na langdurige behandelingen (dyskinesie en on / off toestanden) 8,9.

Onderzoek naar dopaminerge neuronen en PD is in constante progressie en intense inspanningen worden gedaan om behandelingen op basis van stamceltransplantatie, gentherapie, of neuroprotectieve agenten 10,11 ontwikkelen. Echter, een groot probleem nog niet opgehelderd: wat is de oorzaak van de extreme vulnerabiliteit van DA neuronen? Een deel van het antwoord is te vinden in de activiteit van de DA neuronen. Een verlaging van de elektrische activiteit en de prikkelbaarheid van DA neuronen lijkt hun neiging te degenereren 12 vergroten. Toch is de complexiteit van de PD pathogenese vereist verdere studies aan de bij DA mechanismen neuronen degeneratie 13-15 identificeren.

Primaire culturen zijn vooral relevant voor DA neuron eigenschappen 16-19 te bestuderen en deze neuronen aan verschillende spanningen uitdaging voor de evaluatie van neuroprotectieve agenten 20-24. Rat kweekmodellen worden meestal gebruikt als de ontleding van rat embryo mesencephalon is eenvoudiger in vergelijking met de muis en grotere hoeveelheden neuronen kan worden verkregen in de rat. Echter, generatie van transgene muismodellen van de ziekte 25 aanzienlijk het belang van de neurowetenschapper community voor primaire culturen van de muis 26-29 toegenomen. Hoewel culturen prepared van pasgeboren dieren kunnen worden gebruikt, is het beter om te bereiden uit embryo op post-mitotische fase (E13.5 voor mesencephalon neuronen), wanneer neuronen hun vermogen om onderscheid te hebben behouden. Het volgende protocol toont geïsoleerd mesencephalon neuronen in primaire kweek van muizenembryo's (E13.5), die het meest moeilijk te bereiden. Name, bieden we een protocol met behulp van serum-vrij kweekmedium voor een betere reproduceerbaarheid. De twee meest kritische stappen in de cultuur voorbereiding (dissectie en mechanische dissociatie) zal zorgvuldig worden uitgewerkt in de bijbehorende video.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De muizen die in dit werk werden verzorgd en behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie Raad (86/609 / EU) voor het gebruik van proefdieren.

1 Voorbereiding van Verplicht Solutions

  1. Voorraadoplossingen
    1. 10x Poly-L-Ornithine (PLO) Oplossing: Weeg 10 mg van de PLO bromide (moleculair gewicht = 30,000-70,000) en los op in 70 ml steriel water. Filtreer de oplossing met 0,2 urn spuitfilter, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
    2. 30% Glucose Oplossing: Weeg 30 g D (+) - glucose en lossen in steriel water tot een totaal volume van 100 ml. Filter, hoeveelheid, en bewaar bij 4 ° C.
    3. 5x Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) / Nutrient Mixture F-12 Ham: afgewogen 6 g DMEM / Ham F-12 poeder en lossen in steriel water tot een totaal volume van 100 ml. Filter, hoeveelheid, en bewaar bij 4 ° C.
    4. 7,5% natriumbicarbonaat (NaHCO3) Solution: Weeg 7,5 g NaHCO3 en lossen in steriel water tot een totaal volume van 100 ml. Filter, hoeveelheid, en bewaar bij 4 ° C.
    5. 1 M HEPES oplossing: Weeg 23,8 g HEPES en opgelost in steriel water tot een totaal volume van 100 ml. Filter, hoeveelheid, en bewaar bij 4 ° C.
    6. 70% (v / v) ethanol: Verdun 70 ml absolute ethanol met 30 ml steriel water.
  2. Fosfaat gebufferde zoutoplossing met glucose en antibiotica (PBS-GAB): voeg 10 ml 30% glucose-oplossing en 5 ml penicilline-streptomycine oplossing tot 500 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing. Bewaren bij 4 ° C.
  3. Geïnactiveerd foetaal runderserum (IFB): Ontdooi runderserum overnacht bij 4 ° C en inactiveren bij 56 ° C gedurende 30 minuten. Aliquot in 50 ml en bewaar bij -20 ° C.
  4. Cultuur Medium: In steriel water, meng achtereenvolgens 40 ml 5x DMEM / Ham F12-, 1 ml 1 M HEPES, 2 ml van 200 mM L-glutamine, 2 ml penicilline-streptomycine, 4 ml 30% glucose eennd 3 ml 7,5% NaHCO3 tot een eindvolume van 180 ml. Filteren en maken gebruik van dezelfde dag.
  5. Hormoon Mix
    1. Bereid 180 ml kweekmedium. Los 200 mg van apo-transferrine in dit medium.
    2. Weeg 50 mg insuline en los op in 2 ml 0,1 M HCl. Voeg langzaam 8 ml steriel water onder zacht mengen. Verdun deze oplossing in het kweekmedium.
    3. Weeg 19,3 mg Putrescine dihydrochloride en los op in 10 ml steriel water. Voeg 10 ml oplossing van het hormoon mix.
    4. Bereid een 3 mM natrium-seleniet opgelost in steriel water en 2 mM progesteron opgelost in absolute ethanol. Voeg 20 ul van elke oplossing op het hormoon mix.
    5. Filter het hormoon mix, aliquot in 10 ml en bewaar bij -20 ° C.

2 Voorbereiding van Cultuur Platen en Instrumenten

  1. FBS Coating van de cultuur platen: De dag voor de dissectie, bereiden 180 ml kweekmedium. Voeg 10 mlIFB 90 ml kweekmedium. Voeg 300 ul / putje cultuurmedium / 10% ifbs in poly-D-lysine vooraf beklede platen met 24 putjes. Incubeer overnacht bij 37 ° C. Bewaar de resterende media (met en zonder IFB) bij 4 ° C.
  2. Steriliseren van de instrumenten en pasteurpipetten. Verzamel de in Materials tabel vermeld, evenals een klasse II laminaire stroming kap en een CO 2 incubator apparatuur.

3 Dissectie van Muis Middenhersenen

  1. Offeren een E13.5 zwangere muis (volgens de institutionele richtlijnen). Reinig de buik van de muis met 70% ethanol en opent de buik muur. Verzamel de baarmoederhoorns, opent ze met behulp van fijne schaar, ontleden elk embryo uit de baarmoeder horens, en verwijder de vliezen. Plaats de embryo's in een 100 mm petrischaal met steriele PBS-GAB en was ze door overschrijving in 3 opeenvolgende identieke baden met behulp van een tang. Voor dissectie, leg de embryo's door 3 in een 60 mm steriele petrischaal.
  2. Move de laatste petrischaal onder de stereomicroscoop. Niet onthoofden de embryo's. Met behulp Vannas schaar, accijnzen de hersenen.
    1. Verwijder en gooi de voorgrond en achterhersenen regio's zorgvuldig. Om de rostrale zijde, gesneden dicht bij de thalamus regio, aan de caudale zijde gesneden op de landengte regio, verwijder de superieure colliculus.
    2. Zodra de ventrale middenhersenen is geïsoleerd, zorgvuldig hersenvliezen met behulp van ultra fijne pincet te verwijderen. Verzamel de uitgesneden segmenten zonder de hersenvliezen, in een steriele 13 ml buis gevuld met PBS-GAB.
  3. Het reinigen van de buis met de mesencephala grondig met 70% ethanol en breng het onder de motorkap.

4. Cel Dissociatie

  1. Was mesencephala 3x met steriel PBS-GAB. Laat hersenen fragmenten te vestigen tussen elke wasbeurt en niet te verstoren het weefsel. Na de laatste wasbeurt, verwijder voorzichtig zoveel oplossing mogelijk en incubeer hersenen segmenten in 3 ml trypsine / EDTA gedurende 15 minuten bij 37 ° C in eenCO 2 incubator.
  2. Fire-polish het Pasteur pipetten om de overleving van de neuronen als het einde van een niet-gepolijst glas pipet maximaliseren is scherp en kunnen de cellen beschadigen tijdens de stappen dissociatie. Een geringe reductie van de extremiteit diameter (tot 0,5 mm) van het Pasteur pipet, terwijl brand-polijsten.
  3. Verwijder voorzichtig zoveel trypsine / EDTA-oplossing mogelijk en voeg 10 ml kweekmedium / 10% ifbs. Was de hersenen segmenten 3x met kweekmedium / 10% ifbs.
  4. Met behulp van de brand gepolijst Pasteur pipet, beginnen dissociatie van mesencephala in 6 ml kweekmedium / 10% ifbs. Vermaal 10x (vermijd luchtbellen), laat de brokken te vestigen, verzamel dan het medium in een nieuwe steriele 13 ml buis.
  5. Voeg 6 ml kweekmedium, herhaalt u de vorige stap een keer en het verzamelen van het medium met gescheiden cellen in dezelfde 13 ml tube.
  6. Centrifugeer cellen bij 160 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in kweekmedium aangevuld met10% hormoonmengsel.

5 Cell Plating

  1. Tellen cellen in suspensie in een Malassez cel en het volume drager celconcentratie van 600.000 cellen / ml. Ongeveer 1.700.000 cellen kan worden verkregen van de ene muis mesencephalon.
  2. Verwijder FBS-bevattend medium coating van 24-well platen en voeg in elk putje 1 ml celsuspensie (600.000 cellen / putje, 2-4% van de TH + cellen).
  3. Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 / 95% lucht. En geen wijziging noodzakelijk. Dopaminerge neuronen zijn volwassen na ongeveer 5-7 dagen in vitro (consequente uitdrukking van de dopamine transporter). Houd cellen in kweek tot 15 dagen zonder medium vervangen.

6 Immuunfluorescentie Protocol

  1. Reiniging van de Coverslips
    1. De dag voor de dissectie, voeg 10 ml van 1 M HCl in een petrischaal. Leg aan het oppervlak van de vloeistof 12-15 dekglaasjes en wacht 15 minuten.
    2. Zinken de coverglijden in de vloeistof en wacht 15 minuten.
    3. Verwijder HCl en was 3x met water.
    4. Snel Was de dekglaasjes met zuivere ethanol keer, voeg dan pure ethanol om de schaal en wacht 30 minuten.
    5. Onder de motorkap, verwijder gereinigd dekglaasjes van ethanol en voeg 1 dekglaasje per putje van een 12-well celkweek plaat met een gesteriliseerde pincet.
    6. Wassen dekglaasjes tweemaal met steriel water (1 ml / putje). Daarna was ze een keer met steriel PBS.
  2. Coating van de dekglaasjes
    1. Verwijder de PBS en voeg 500 ul / putje van 2x PLO (verdund in PBS). Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C in de CO2 incubator.
    2. Verwijder de PLO-oplossing en was 3x met steriele PBS.
    3. Verwijder PBS en voeg 500 ul / putje van 20% IFB / 1 g / ml laminine. Incubeer overnacht bij 37 ° C in de CO2 incubator.
  3. Plating de Cellen voor Immuunfluorescentie
    1. Verwijder coating medium van 12-well platen.
    2. Voeg 900,000 cellen / putje in 2 ml volume en groeien de cellen bij 37 ° C in de incubator. Cellen kunnen in kweek tot 15 dagen zonder medium vervangen worden gehouden.
  4. Immunostaining
    1. Verwijder medium van 12-well platen en wassen met 500 ul / putje DMEM voorverwarmd tot 37 ° C.
    2. Voeg 500 ul / putje van DMEM voorverwarmd tot 37 ° C, voeg vervolgens voorzichtig 160 ul / putje van 8% paraformaldehyde (PFA, 2% eindconcentratie) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
    3. Verwijder PFA en was 3x met PBS / 0,1 M glycine gedurende 10 minuten.
    4. Verwijder PBS, voeg 300 ul / putje van PBS / 0,05% Triton X-100/20% geit serum en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
    5. Verwijder medium, voeg 300 ul / putje primair antilichaam verdund in PBS / 0,05% Triton X-100/1% geit serum en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Primaire antilichamen die gebruikt kunnen worden voor de detectie van dopaminerge neuronen en karakterisering van de cultuur in de tabel Materials. Houd1 goed zonder primaire antilichaam te beoordelen voor de achtergrond van de verschillende secundaire antilichamen.
    6. Verwijder medium en 3x wassen met PBS / 0,2% gelatine gedurende 10 minuten.
    7. Verwijder medium, voeg 300 ul / putje tweede antilichaam verdund in PBS / 0,05% Triton X-100/1% geit serum en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Secundaire antilichamen die zijn aangegeven in de tabel Materials.
    8. Verwijder medium en 3x wassen met PBS / 0,2% gelatine gedurende 10 minuten.
    9. Verwijder medium en was 3x met PBS.
    10. Monteer de dekglaasjes op glasplaatjes cel naar beneden in een druppel Vectashield. Houd de slides bij kamertemperatuur gedurende de nacht het fixeermiddel laten drogen en bewaar ze bij 4 ° C.
    11. Verwerven van beelden met behulp van een confocale microscoop of een fase-contrast microscoop uitgerust voor epifluorescentie. Representatieve beelden werden verkregen met een Leica SP2 UV confocale microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een geïllustreerde stroomschema van het mesencephalon kweek stappen is weergegeven in figuur 1. Kort na het verzamelen E13.5 embryo van een zwangere Zwitserse muis wordt ventrale mesencephalon ontleed uit het gehele embryo. De geïsoleerde hersenen fragmenten worden achtereenvolgens aan enzymatische vertering en mechanische dissociatie ingediend. Gedissocieerde cellen gepelleteerd door centrifugeren, opnieuw gesuspendeerd in kweekmedium en uitgeplaat in pre-gecoate 12 of 24-well platen. Cellen worden geh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol geeft de procedures en reagentia die nodig zijn om een ​​primaire kweek van mesencefale neuronen Uitgaande van de embryonale muis en immunofluorescentie procedure dopaminerge neuronen detecteren. Kritische stappen van de procedure zijn de dissectie van de embryo's en de mechanische dissociatie van de verzamelde hersenen fragmenten. Hoge kwaliteit dissectie instrumenten helpt om de dissectie techniek onder de knie. DA neuronen vormen een klein deel van mesencephalon. Dienovereenkomstig verzamelt het rech...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Ondersteund door subsidies van CNRS en INSERM. PM erkent ondersteuning van de Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC erkent ondersteuning van de Fondation de France.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fetal Bovine SerumLonza14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose met L-glutamineLonzaBE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), fenol roodLife Technologies25300-054
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Life Technologies15140122
L-Glutamine, 200 mM oplossingLife Technologies25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-Aldrich D0547Poeder
Laminine - 1 mg/ml in Tris gebufferd NaClSigma-Aldrich L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromideSigma-Aldrich P3655
Insulin uit varkensbuikspeekselklierSigma-Aldrich I5523
apo-Transferrine humaanSigma-Aldrich T1147
Putrescine dihydrochlorideSigma-Aldrich P5780
ProgesteronSigma-Aldrich P8783
NatriumselenietSigma-Aldrich S5261
HEPESSigma-Aldrich H4034 
GlycineSigma-Aldrich G7126Staloplossing 1 M in water
GelatineSigma-Aldrich G9391Staloplossing 2% (w/v) in water
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldehyde 16% in waterElectron Microscopy SciencesRT 15710-S
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-Glucose, monohydraatMerck Millipore4074-2
Zoutzuur - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) TitripurMerck Millipore109057
Steriele water - Aqua B. BraunBraun
Ethanol absoluut NORMAPUR analytisch reagensVWR20821.321
Steriele petrischalenVWR82050-566
Pasteur pipetten gewoon glas - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Tellingkamer MalassezVWR631-0975
Serum Acrodisc Spuitfilter met Supor-membraan, sterieel, GF/0.2 µm, 37 mmPALL Life science4525
Chirurgische schaar - Recht, scherp-scherp, 14,5 cm langFine Science Tools14002-14Om de buikwand te openen
Schaar - Recht, puntig, delicaat, 10 cm langMORIA4877AOm de baarmoederwand te openen
Pincet - Gebogen, gebruikelijk, gekartelde kaken 1 mmMORIA2183Om embryo's te manipuleren
Vannas Schaar - Gebogen, puntig, 7 mm bladenMORIAMC50Om het mesencephalon te verwijderen
Ultra Fijn Pincet - Gebogen, delicaat, 13 cm langMORIA9987Om hersenvliezen te verwijderen
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell PlatesBD Bioscience356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, platte bodem met dekselBD Bioscience353043
SuperFrost Microscoopglaasjes, Geslepen randen 90ºMENZEL-GLÄSERAG00008032E
Precisie dekglasdikte No. 1.5H circulair 18 mm ØMARIENFELD117580
Polyklonaal Konijn Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) AntilichaamChemicon MilliporeAB56221/200
Monoklonaal Muis Anti-Glutamaat Decarboxylase (GAD67) Antilichaam, klon 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Monoklonaal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antilichaam, klon DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
Monoklonaal Muis Anti-5-HT Antilichaam1/8.000 - Vriendelijk geschenk van Yves Charnay (Zwitserland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Geitenserum, Nieuw-Zeelandse oorsprongLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Geit Anti-Konijn IgG (H+L) AntilichaamLife TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 Geit Anti-Muis IgG (H+L) AntilichaamLife TechnologiesA-110011/1.000
Alexa Fluor 594 Geit Anti-Rat IgG (H+L) AntilichaamLife TechnologiesA-110071/1.000
VECTASHIELD HardSet Mounting MediumVector LaboratoriesH-1400
StereomicroscoopCarl Zeiss microscopyStemi-2000C
Bunsenbrander FIREBOYVWR451-0136

Referenties

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson's disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Embryonaal muizenbreindissectie van het mesencephalonenzymatische dissociatiemechanische dissociatieimmunofluorescentiekleuringtyrosinehydroxylasecell platingkweekmedium
Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.