Een high-throughput assay in vitro fenotype Salmonella of andere bacteriële vereniging, invasie en replicatie in fagocytische cellen met hoge doorvoer capaciteit ontwikkeld. De methode werd gebruikt om Salmonella-gen knock-out mutantstammen evalueren op hun betrokkenheid in gastheer-pathogeen interacties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High-throughput Assay om Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, en replicatie in macrofagen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Salmonella species zijn zoönotische pathogenen en de belangrijkste oorzaken van door voedsel overgedragen ziekten bij mens en vee 1. Inzicht in de onderliggende mechanismen Salmonella -host interacties zijn belangrijk om de moleculaire pathogenese van Salmonella infectie helderen. De Gentamicine bescherming test om Salmonella vereniging, invasie en replicatie fenotype in fagocytcellen werd aangepast om high-throughput screening om de rollen van deletiemutanten van Salmonella enterica serotype Typhimurium in gastheer interacties met behulp van RAW 264,7 muizenmacrofagen definiëren. Hoofde van dit Protocol, de variantie in de metingen is aanzienlijk korter dan het standaard protocol, omdat de wild-type en mutante stammen multiple kunnen worden getest in dezelfde kweekschaal en tegelijkertijd. Het gebruik van multichannel pipetten verhoogt de doorvoer en verhoogt precisie. Bovendien, bezorgdheid over het gebruik van minder host cellen per putje in 96-putjes schaal waren gericht. Hier werd het protocol van de in vitro gemodificeerd Salmonella invasie assay met fagocytische cellen met succes toegepast om 38 afzonderlijke Salmonella deletiemutanten voor associatie, invasie en intracellulaire replicatie fenotype. De in vitro fenotypes worden, waarvan sommige later bevestigd om in vivo fenotypes in een diermodel. Aldus, de gemodificeerde, gestandaardiseerde test Salmonella vereniging invasie en replicatie in macrofagen met een hoge verwerkingscapaciteit kunnen breder worden gebruikt om bacteriële gastheer interacties te bestuderen fenotype.
Inleiding
Nontyphoidal Salmonella belangrijke oorzaken van enterische ziekte in alle vertebraten. Salmonellose bij de mens behoort tot de top bacteriële voedsel overgedragen ziekten 1. Karakterisering van de moleculaire mechanismen die de interacties van Salmonella onderbouwen met hun dierlijke gastheren wordt vooral bereikt door de studie van Salmonella enterica serotype Typhimurium (STM) in weefselkweek en diermodellen van infectie. Verkrijgen van inzicht in STM-gastheer interacties zal ons helpen begrijpen hoe Salmonella overleven en te groeien in gastheercellen. De eerste uitdaging in het bestuderen van deze interacties is om zoveel mogelijk deelnemende factoren identificeren van zowel de gastheer en pathogeen, maar deze pogingen zijn grotendeels geblokkeerd door de grote problemen van het omgaan met twee onafhankelijke complexe biologische systemen tegelijk, namelijk talrijke en Salmonella, onder fysiologische omstandigheden. Daarnaast is de grote repertOire van Salmonella en gastheer genen potentieel coderen factoren betrokken bij gastheer interacties vereisen high-throughput biologische platform om deze uitdaging aan te pakken.
Gemodificeerd gestandaardiseerde test Salmonella vereniging invasie en replicatie in macrofagen met hoge verwerkingscapaciteit fenotype werd ontwikkeld om een groot aantal genen waarschijnlijk betrokken zijn in Salmonella -host interacties onderzocht. De Gentamicine bescherming assay werd ontwikkeld in 1973 2 en voor het eerst grondig beschreven door Elsinghorst in 1994 3,4. Het is nu uitgegroeid tot een standaard tool voor het bestuderen van vele intracellulaire bacteriële pathogenen ex vivo, waaronder Salmonella 5,6. Geïnternaliseerde bacteriën voorkomen worden gedood door sommige antibiotica, zoals Gentamicine, dat eukaryote cellen 3 niet kan doordringen. Door gebruik te maken van dit verschijnsel, de gentamicine bescherming assay meet de overleving en groei van intracellulaire bacterial pathogenen. Drie gebeurtenissen tijdens de infectie, dat wil zeggen samen met eukaryote cellen, invasie en replicatie kan worden geëvalueerd voor intracellulaire bacteriële pathogenen op basis van het tijdsinterval tussen infectie Gentamicine behandeling en verdere incubatie (Figuur 1). Eukaryote cel lijnen zorgen voor een fysiologische omgeving, dat is minder complex dan relevante diermodellen voor gastheer-pathogeen interactie studies.
De Gentamicine bescherming test is een geschikt platform om STM-gastheer interacties te bestuderen, maar de standaard test in een 24-well cultuur schotel heeft een lage doorvoercapaciteit. Computationele analyse van in vivo datasets geïdentificeerd 149 Salmonella genproducten die worden voorspeld om te interageren met ongeveer 300 gastheer genproducten (ongepubliceerde gegevens). De standaard Gentamicine bescherming assay niet de capaciteit van aantal mutanten efficiënt fenotype.
In addition, kan het Gentamicin bescherming test theoretisch detecteren de invasie van zelfs een enkele bacterie. Vanwege deze inherente gevoeligheid, de ruwe gegevens zijn gevoelig voor technische variaties bij herhaald op verschillende tijdstippen. De interne controles en relatieve data presentatie na normalisatie zijn essentieel voor een zinvolle interpretatie van de resultaten. Gezien deze overwegingen werd een gemodificeerde, gestandaardiseerde Gentamicin bescherming test ontwikkeld om het testen van de capaciteit te verbeteren en verhogen de precisie.
Het volgende protocol is gedetailleerd en geïllustreerd om de gewijzigde Gentamicine bescherming assay met 96 putjes en het murine macrofaag cellijn RAW264.7 voeren. Vergeleken met het standaard protocol in 24-putjes, het gemodificeerde protocol heeft de volgende voordelen: 1) met 96 putjes kunnen tot 10 verschillende mutante stammen worden fenotype inclusief interne positieve en negatieve controles met voldoende statistische power;2) De variantie van de resultaten wordt aanzienlijk verminderd, omdat de mutante stammen worden getest in dezelfde kweekschaal en tegelijkertijd; 3) Het gebruik van meerkanaalspipetten verhoogt de doorvoersnelheid terwijl het verminderen van de vermoeidheid. Tenslotte, in vergelijking met 24-putjes werden zorgen van minder ontvangende cellen per putje in 96-putjes schaal aangepakt door protocol optimalisatie en standaardisatie.
Samengevat, de gemodificeerde, gestandaardiseerde assay in vitro fenotype Salmonella of andere bacteriële vereniging, invasie en replicatie in fagocytische cellen verhoogt de precisie en bereikt high-throughput capaciteit en het verminderen vermoeidheid.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 muizen macrofaag RAW264.7 Cell Culture
- Kweek lage passage nummer murine macrofaag cellen, RAW264.7 (ATCC ® nummer, TIB-71) in een T-75 celkweek kolf ontlucht filterdeksel in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 10% foetaal bovine serum (FBS) , 0,5% NaHCO3 en 1% 100x niet-essentiële aminozuren (NEAA) bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Zodra cellen bereikt een 60-80% samenvloeiing in de kolf in een cel schraper om cellen te oogsten, en tel de cellen in een hemacytometer en bereken de celconcentratie.
- Resuspendeer de cellen en verdun de celconcentratie in 2,5 x 10 5 / ml in vers DMEM celkweekmedium. Gebruik meerkanaalspipetten 200 ul DMEM celkweekmedium bevattende 5 x 10 4 cellen in elke well van 96-well celkweekplaten plaat.
- Plate vier putten van elk Salmonella stam. Opgezet drie afzonderlijke platen voor een setvan fagocytcellen invasie assay, en markeer ze met een "vereniging", "invasie" en "replicatie", respectievelijk.
- Plaats de platen in 5% CO2 incubator bij 37 ° C ON om de macrofaagcellen te hechten aan de bodem van de putjes.
2 Bereiding van Salmonella wild-type en mutanten
- Op dezelfde dag van de voorbereiding van de macrofaag RAW264.7 cellen, kies enkele kolonies van wild-type (WT) Salmonella enterica serotype Typhimurium 14028s, DinvA mutant, DphoP mutant, en de gewenste test mutante stammen, en de cultuur hen in Luria-Bertani ( LB) bouillon aangevuld met antibiotica waar nodig. Gebruik elk stel van fagocyten invasie assays getest tot 10 mutante stammen (DinvA mutant en DphoP mutant defectief in invasie en intracellulaire replicatie, respectievelijk).
- Groeien de bacteriën gedurende 14 uur bij 37 ° C met sHaking bij 220 rpm in elk van LB bouillon 5 ml losjes afgedekte 14 ml polypropyleen buis met ronde bodem. LB-bouillon die geschikte antibiotica, in ons geval de meeste van mutante stammen zijn resistent tegen kanamycine, 50 ug / ml
- De volgende dag, subcultuur elk ON kweken van Salmonella stammen in plain 5 ml van LB bouillon in een verhouding van 01:50 nog eens 4 uur onder schudden bij 220 rpm.
- Lees OD 600-waarden van elk bacteriecultuur op een spectrofotometer, en elke gelezen moet liggen 0,6-1,2 naar Salmonella pathogeniteit eiland-1 type III secretie systeem (SPI-1 TTSS) genexpressie voor de invasie te optimaliseren.
- Gebruik de formule 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml te schatten de bacteriële concentratie, verdun bacteriën tot een concentratie van 5 x 10 6 CFU / ml in vers DMEM celkweekmedium.
3 invasie assay in 96-putjes plaat
- Verwijder drie 96-well cell cultuur platen van de CO 2 incubator en was elk putje een keer met 200 ul 1x PBS buffer.
- Na wassen en volledige verwijdering van PBS, voeg 200 ul bacteriën in DMEM medium (zie hierboven) in elk putje. Dit resulteert in 1 x 10 6 Salmonella cellen in elk putje en multipliciteit van infectie (MOI) van 20: 1.
- Centrifugeer de platen bij 1000 xg in een afgesloten drager voor 10 min, vervang platen (tijdstip nul) in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 30 minuten. Voor elke stam, opgericht ten minste vier duplo.
- Na 30 minuten, verwijder platen uit de incubator en was driemaal met 200 ul van 1 x PBS om niet-geassocieerde bacteriën te verwijderen.
- Na het wassen, besparen de plaat voorzien van "vereniging" voor verdere behandeling. Voeg 200 pl DMEM medium dat 100 ug / ml Gentamicine aan elk putje van de platen aangeduid met "invasie" en "replicatie" volledig to dood de extracellulaire Salmonella. Breng de platen 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende een extra uur.
- Besparen ook een uit elk geïnfecteerd stam voor het opnemen macrofaag cellen, behandel de rest van putten op de "associatie" plaat met 200 ul van 1 x PBS bevattende 1% Triton X-100 gedurende 10 minuten. De Triton oplossing macrofaag cellen lyseren en laat bijbehorende Salmonella.
- Harvest Salmonella uit elk putje en plaats ze in 1,5 ml Eppendorf buizen. Voeren drie 10-voudige seriële verdunningen met 900μl 1x PBS op de geoogste monsters uit elk putje wordt vortex uitgevoerd tussen elke verdunning.
- Plate de derde verdunning, 10 -3, aan beide LB (WT) of LB Kan (mutanten) platen. Label de platen met de juiste Salmonella stam naam, verdunning nummer, tijdstip en datum.
- Na vortexen derde verdunning buis afzien 10 ul monster op het oppervlak van de agar en herhaal fdeze tijd voor een totaal van 5 druppels. Zorg ervoor dat de ruimte van de vijf 10 pl druppels gelijkmatig op de petrischaal platen 7.
- Na de druppels dringen in de agar, draai de platen over en incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Behandel putjes opgeslagen telling van macrofagen met 150 gl 1 x PBS dat 0,25% trypsine-EDTA gedurende 10 minuten.
- Na behandeling met trypsine, plaats macrofagen in 1,5 ml Eppendorf buizen en behandel ze met 50 ul van FBS tot trypsine / EDTA-oplossing te neutraliseren, vlekken op de cellen met 0,4% Trypan blauw en scoren ze door het gebruik van hemacytometer.
- Wanneer de een uur incubatie is verstreken, haalt u de "invasie" en "replicatie" platen uit de CO 2 incubator, en was elke goed als bij "Stap 3.4".
- Sla de "invasie" plaat voor verdere behandeling als "Step 3,6-3,12".
- Voeg 200 pl DMEM medium bevattende 10 ug / ml gentamicine tede "replicatie" plaat aan de goedkeuring van de extracellulaire Salmonella in het medium te behouden. Zet de plaat tot 37 ° C, 5% CO2 incubator tegen 22,5 uur.
- De volgende dag, verwijder de "replicatie" plaat van 37 ° C, 5% CO2 incubator, en was iedere evenals "Stap 3.4" en behandelen hen als "Step 3,6-3,12".
- Tot slot, verwijder de agarplaten na incubatie overnacht in 37 ° C incubator en scoor het aantal bacteriële kolonies.
- Een goede kolonie verdeling moet zijn tussen de 10 en 100 kolonies, elke spot bevat ongeveer 2-20 koloniën, zou het moeilijk zijn om te scoren als er meer dan 20 kolonies op een plek. Als het aantal te laag of te hoog, replate het monster met 10-voudig hogere of lagere verdunningen indien nodig.
4 Data Analysis
- Bereken de CFU (kolonie vorming eenheden per ml) van elke plaat op basis van de beplatingvolume en de verdunningsfactor.
- Thans wordt het aantal Salmonella per macrofagen door de geregistreerde macrofaagcellijn telling van elke stam.
- Bereken de geometrische gemiddelden van CFU per macrofaag uit ten minste drie onafhankelijke experimenten voor mobiele associatie, invasie of replicatie, respectievelijk, en normaliseren na de WT voor relatief.
- Analyseer de gegevens voor associatie, invasie en replicatie door Student's t-test respectievelijk door vergelijking elke stam WT en bepaal de statistische significantie van de p-waarde.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zie representatieve resultaten (figuur 2) nadat de data zijn uitgezet gebaseerd op de gemodificeerde fagocytische cel invasie assay. De gegevens zijn vijf verschillende stammen, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A en mutant B. Δ inva, bekend gebrekkig invasie, en ΔphoP bekend defecte replicatie 8 zijn, worden gebruikt als positieve controles om de experimentele validiteit . Sterker nog, in de gewijzigde invasie assay, een ΔinvA mutant is slecht geïnternaliseerd door...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De Gentamicine bescherming assay wordt wijd gebruikt om de invasie en replicatie van intracellulaire bacteriële pathogenen binnen gastheercel bestuderen, en het is bijzonder belangrijk biologisch hulpmiddel om pathogenen zoals Salmonella, waarvan invasie de vereiste stap voor het vaststellen infectie 1. De standaard Gentamicine bescherming assay in Salmonella onderzoeksgemeenschap wordt uitgevoerd in 24-well cultuur schotel 5. Hoewel het gebruik van 48 of 96-well platen voor bespr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project werd mede ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health NIAID (voor AJB en LGA, R01 AI076246). De Salmonella mutant collectie werd mede ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie (voor MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 en R01 AI039557-11 AI075093-01), deels door de National Institutes of Health-subsidie (voor HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Wij danken Steffen Prowollik voor replica plating en bevestiging van de mutanten in de collectie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetaal bovien serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Celcultuurkolf met geventileerde filterdop | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100x Niet-Essentiële Aminozuren | Life Technologies | 11140 | |
| Celschraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-wels Celcultuurplaat | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) bouillon | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 ml Polypropyleen Ronde-Bodembuis | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin oplossing | Sigma | K0254 | |
| Gentamicine oplossing | Sigma | G1272 | |
| 0,25% Trypsine-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blauw | Sigma | T8154 |
Referenties
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869(2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
