Methodenartikel

Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen

DOI:

10.3791/51762

⸱

17 oktober 2014

 , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de intrinsieke adhesieve eigenschappen van vermeende celadhesiemoleculen. Het uitgescheiden, epatoom-getagde ectodomein van een celadhesiemolecuul wordt gevangen uit het kweekmedium op kleine, uniforme functionele kralen. Deze kralen kunnen vervolgens onmiddellijk worden gebruikt in eenvoudige kralagomaggregatie-assays.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel-cel adhesie is fundamenteel voor meercellig leven en wordt gemedieerd door een divers scala aan eiwitten van het celoppervlak. Echter, de bindingsinteracties voor veel van deze eiwitten slecht begrepen. Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de klevende eigenschappen van vermeende homofiele celadhesiemoleculen. Gekweekte HEK293 cellen getransfecteerd met DNA dat codeert voor een uitgescheiden, epitoop-gelabelde ectodomein van een celoppervlakte-eiwit. Met gefunctionaliseerde kralen specifiek voor het epitoop tag, wordt de oplosbare, uitgescheiden fusie-eiwit gevangen uit het kweekmedium. De beklede korrels kunnen vervolgens direct in kraal aggregatie assays of fluorescente kralen sortering assays om te testen op homofiele adhesie. Desgewenst kan mutagenese dan worden gebruikt om de specifieke aminozuren of domeinen die voor hechting helderen. Deze test vereist slechts kleine hoeveelheden van tot expressie gebracht eiwit, niet vereist de productie van stabiele cellijnen en kan worden ACCOmplished in 4 dagen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adhesie van cellen is essentieel voor de ontwikkeling en integriteit van meercellige organismen en wordt gemedieerd door een diverse reeks van celoppervlakmoleculen. Veel van deze adhesiemoleculen zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd, hoewel velen nog worden ontdekt. Verschillende methoden worden gebruikt om de eigenschappen van celadhesie moleculen (CAMs), inclusief celsortering assays, cel aggregatie assays 1-8 en biofysische werkwijzen zoals atomic force microscopie en oppervlaktekracht spectroscopie 9-12 onderzoeken.

De complexiteit zelfs vereenvoudigde in vitro systemen die cellijnen bemoeilijkt de kleefeigenschappen van een vermeende CAM bepalen. Typisch wordt een molecuul als een CAM indien induceert cel aggregatie bij getransfecteerd in een niet hechtende cellijn. Het is echter duidelijk dat dit niet direct bewijs kleefmiddel activiteit. Bijvoorbeeld, het celoppervlak levering of stabiliteit van een vergemakkelijkingCAM leidt ook tot verhoogde celaggregatie 1,13. Bovendien kan een echte CAM niet aan celaggregatie mediëren als de cellijn mist andere co-factoren nodig zijn voor celoppervlak levering of stabilisatie.

Om deze complicerende factoren te vermijden, meer direct testen kunnen worden gebruikt die zijn gebaseerd op het idee dat bindingsinteracties dient een intrinsieke biochemische eigenschap van het extracellulaire domein. Terwijl korrels aanvankelijk gebruikt Ng-CAM 2 karakteriseren, zijn deze assays uitgebreid om-cadherine-gemedieerde adhesie 12,14,15 onderzoeken. Met fusie van de C-cadherine ectodomein-Fc-fusies, de Gumbiner lab bleek dat meerdere cadherine herhalingen bijdragen tot 14 homofiele interacties. Met vergelijkbare kraal aggregatie assays, E-cadherine en N-cadherine hechting zijn ook gekarakteriseerd 12,15, evenals een aantal protocadherines 1,15-18 en Dscam isovormen van Drosophila 19. Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige en snelle test voor het karakteriseren van de kleefstof activiteit van uitgescheiden, epitoop-gemerkte ectodomeinen van vermoedelijke homophilic CAMs (figuur 1). We hebben deze assay gebruikt hoofdzakelijk, leden van de cadherine-superfamilie karakteriseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Cell Voorbereiding (dag -2 tot 0)

  1. Split HEK293 cellen 1: 5 met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing en incubeer in groeimedia bij 37 ° C met 5% CO2 totdat 60 - 80% confluent (2-3 dagen). Voor elke aandoening, cultuur cellen in 2 x 100 mm gerechten.

2 celtransfectie (Dag 1)

  1. Transfecteren HEK293 cellen met plasmide codeert Fc-fusie met een transfectie reagens zoals Lipofectamine. Alternatieve methoden die resulteren in vergelijkbare transfectie efficiënties kunnen ook worden gebruikt.
  2. Terug getransfecteerde cellen incubator gedurende 24 uur.

3 Cell Voortplanting (Dag 2)

  1. Verwarm Growth Media zonder foetaal runderserum (-FBS) tot 37 ° C.
  2. Spoel schotels 2x met 10 ml Groei Media -FBS, en de terugkeer van de gerechten tot de 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
  3. Spoel de kweken gerechten een keer met 10 ml kweekmedium -FBS, voor een totaal van 3 wasbehandelingen.
  4. Incubate de getransfecteerde HEK293 cellen bij 37 ° C gedurende nog 48 uur zonder FBS voor het verzamelen media.

4 Bead Aggregation (dag 4)

  1. Om media vanaf kweekschaaltjes verzamelen, overbrengen media van elk paar gerechten tot 50 ml conische buizen en draaien op 500 xg gedurende 5 minuten om cellulaire puin neer te slaan.
  2. Filter media uit 50 ml conische buis in een centrifugaal filter met behulp van een 30 ml spuit en 0,45 pm spuitfilter.
  3. Spin centrifugale filters bij 4.000 xg en 4 ° C tot het volume geconcentreerd kweekmedium is ongeveer 500 pi (ongeveer 15 min). Herhaal dit tot alle kweekmedia toegevoegd en geconcentreerd.
  4. Voeg 1,5 ul Proteïne G magnetische kralen 1 ml ijskoude bindingsbuffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis voor elk monster, plaats op een magneet en verwijdert buffer. Voeg onmiddellijk de geconcentreerde kweekmedium aan de Proteïne G magnetische korrels.
  5. Draai buizen bij 4 ° C gedurende 2 uur.
  6. Place-buizen op een magneet en verwijder media. Snel wassen kralen tweemaal met ijskoud 1 ml Binding Buffer, en vervolgens opnieuw in suspensie kralen in 300 ul Binding Buffer.
  7. Split geresuspendeerd parels in 2 buizen, 150 ul in elke buis en voeg 1,5 ul van 200 mM CaCl2 en 200 mM EDTA de "calcium" en "no calcium" omstandigheden respectievelijk.
  8. Breng 100 pi van elke aandoening depressie goed glijden en laat microfoto met een doorvallend licht microscoop (figuur 2). Verzamel beelden van 5 gezichtsveld voor elk experiment op elk gewenst tijdstip.

5 Data Analysis

  1. Met behulp van ImageJ, of vergelijkbare software voor beeldanalyse, opent u een van de vijf beelddatasets behulp van de Import / Afbeelding Sequence ... uit het File pulldown menu. Deze wordt geopend als afbeeldingsstapel.
  2. In het Beeld / Eigenschappen ... dialoogvenster veranderen de image eenheden naar pixels en stel Pixel Breedte en Pixel Hoogte tot 1,0.
  3. Converteer de beelden naar binair via de Adjust / Drempel ... commando in het Afbeelding pulldown menu. Stel de drempel om pixels die bijdragen aan kralen of kralen aggregaten omvatten, maar dat uitgesloten achtergrond en kleine deeltjes. Toegepast op alle beelden in de stapel.
  4. Klik in het dialoogvenster Metingen Set doos, controleer dan de dozen Ruimte en Stack Position.
  5. Run Analyseer Deeltjes ... in het Analyseren pulldown menu. Dit zal een lijst van de geïdentificeerde deeltjes, met inbegrip van hun grootte (gebied) en het beeld waarin ze werden geïdentificeerd genereren.
  6. Herhaal dit proces voor die experiment en experimentele conditie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een voorbeeld experiment wordt gepresenteerd in figuur 2, die calcium afhankelijk bead aggregatie toont het ectodomein van N-cadherine gefuseerd aan Fc (NcadEC-Fc). Aangezien calcium, parels vertonen weinig of geen neiging tot aggregeren en er is geen toename in korrelgrootte tijd (Figuur 1 A, C). In de aanwezigheid van calcium, kralen bekleed met NcadEC-Fc tonen robuuste aggregatie, met totale grootte verhoging in de tijd (Figuur 1B, C). Dit experiment werd driem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celhechting een essentieel kenmerk van meercellig leven en wordt gemedieerd door een brede reeks celoppervlak eiwitten. Hiervan worden de gedetailleerde kleefeigenschappen begrepen slechts een relatief klein deel. Hier hebben we een eenvoudige, snelle protocol beschreven voor het onderzoeken van de homofiele hechtmiddel aantal uitgescheiden ectodomeinen gefuseerd aan een geschikte epitoop tag. Deze benadering heeft een aantal belangrijke voordelen. Eerst worden stabiele cellijnen niet nodig 14,20, voldoende h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een NSF/ARRA-subsidie (IOS 0920357) en een subsidie van de NIH (5R21MH098463).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pFc-N1 plasmidAddgeneTe dienen
HEK293 cellenAmerican Type Culture CollectionCRL-1573
DMEMMediatech - Corning10-013-CV
Fetaal bovien serum (FBS)SigmaF2442
100x Pen-Strep (10.000 U/ml)Life Technologies15140-122
0,05% Trypsin-EDTALife Technologies25300054
Lipofectamine 2000Life Technologies11668030
Dynabeads – Protein GLife Technologies10003D
Bovine Serum AlbumineSigmaA3294
DepressieschuifjesElectron Microscopy Sciences71878-06
Amicon Ultra-15 Centrifugafiltereenheid met Ultracel-10 membraanMilliporeUFC901024
0,45 mm spuitfilterSarstedt83.1826
Dynamag-2 MagneetLife Technologies12321D
Fiji (ImageJ) Beeldanalysesoftwarehttp://fiji.sc/Fiji
Tabel van Buffers/Oplossingen
GroeimediumDMEM + 10% FBS + Pen-StrepFilter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
Groeimedium –FBSDMEM + Pen-StrepFilter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
Binding Buffer50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSAVortex tot oplossing, op ijs bewaren.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
  2. Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
  3. Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
  4. Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
  5. Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
  6. Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
  7. Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
  8. Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
  9. Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
  10. Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
  11. Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
  12. Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
  13. Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
  14. Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
  15. Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
  16. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
  17. Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
  18. Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
  19. Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
  20. Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bead Aggregation AssayCell Adhesion MoleculesHEK293 CellsProtein G Magnetic BeadsHomophilic AdhesionCalcium Dependent AdhesionImage AnalysisTransmitted Light MicroscopyEpitope tagged EctodomainFunctionalized Beads

Gerelateerde artikelen