Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Samenvatting

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Samenvatting

Met het tempo van de wetenschappelijke vooruitgang snel te accelereren, zijn nieuwe methoden nodig voor experimentele neurowetenschappen om snel en eenvoudig te manipuleren genexpressie in de hersenen van muizen. Hier beschrijven we een techniek voor het eerst geïntroduceerd door Passini en Wolfe voor directe intracraniële levering van viraal gecodeerde transgenen in de neonatale hersenen van muizen. In zijn meest elementaire vorm, de procedure vereist slechts een ijsemmer en een microliter spuit. Echter, kan het protocol ook worden aangepast voor gebruik met stereotaxisch frames om consistentie voor onderzoekers nieuwe om de techniek te verbeteren. De werkwijze berust op het vermogen van adeno-geassocieerd virus (AAV) vrij van de cerebrale ventrikels in het hersenparenchym bewegen terwijl het ependymale bekleding nog onrijpe tijdens de eerste 12-24 uur na de geboorte. Intraventriculaire injectie van AAV op deze leeftijd resultaten wijdverspreide transductie van neuronen in de gehele hersenen. Expressie begint binnen enkele dagen na de injectie en blijft voor de lifetime van het dier. Virale titer kan worden aangepast aan de dichtheid van getransduceerde neuronen controle, terwijl co-expressie van een fluorescent proteïne een onmisbare label van getransduceerde cellen. Met de stijgende beschikbaarheid van virale kern faciliteiten voor zowel off-the-shelf, voorverpakte reagentia en aangepaste virale voorbereiding te bieden, biedt deze aanpak een tijdige methode voor het manipuleren van genexpressie in de hersenen van muizen, dat is snel, gemakkelijk, en veel minder duur dan traditionele kiembaan engineering.

Inleiding

Traditionele methoden voor het wijzigen van neurale genexpressie vereisen tijdrovende en dure kiembaan manipulaties. Alternative de novo benaderingen zoals in utero elektroporatie of lentivirale stereotaxische injectie geven snellere resultaten en minder duur maar heeft het nadeel dat complexe chirurgische ingreep ^1-3. Verder transgenexpressie een beperkt ruimtelijk bereik van deze methodes. Hierin beschrijven we een snelle, gemakkelijke en economische methode voor grootschalige neuronale manipulatie via intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerde virus (AAV) in de neonatale hersenen van muizen. De werkwijze werd eerst beschreven door John Wolfe en Marco Passini in 2001, waar ze voorgesteld kleine deeltjesgrootte van AAV stond het diffunderen in de cerebrospinale vloeistof bij het ​​passeren van de laterale ventrikels via onrijpe ependymale barrière en in het hersenparenchym ^{4, 5.} Intraventriculaire injectie van AAV in de ferste 24 uur na de geboorte opbrengsten wijdverspreide virale transductie van neurale subsets verspreid over elk gebied van de hersenen, van de reukkwabben de hersenstam ^6,7. Viraal afgeleverd transgenen tot expressie worden gebracht en actief binnen dagen na injectie en aanhouden tot een jaar na transductie. Zo, dit veelzijdige manipulatie maakt studies variërend van vroege postnatale ontwikkeling van de hersenen tegen veroudering en degeneratie in de volwassene.

Bij de aanpassing van de techniek om onze specifieke experimentele behoeften, hebben we vooral gericht op AAV8 serotype want het is de meest efficiënte transductie neuronen ^6. We zien dat de virale titer kan worden verdund tot de dichtheid van getransduceerde neuronen voor experimenten testen cel-intrinsieke gevolgen van genetische manipulatie controleren. Daarnaast hebben we aangetoond dat twee virussen kunnen worden gecoördineerd geïnjecteerd om expressiepatronen die eenzijdig gericht afzonderlijke of overlappende sets van neuronen produceren, afhankelijk van de gekozen serotypenvirale verpakking. Ons werk vergroot de veelzijdigheid van deze techniek voor gebruik in een groot aantal experimentele neurologie instellingen.

Protocol

Voer alle procedures en protocollen met betrekking tot dieren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. De hier beschreven procedures zijn beoordeeld en door het Baylor College of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite.

Replicatie-incompetent adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren voor transgene levering in het knaagdierhersenen zijn goedgekeurd voor Biosafety Level 1 gebruik. Raadpleeg de CDC website voor de publicatie Amerikaanse overheid "Bioveiligheid in microbiologie en Biomedische Laboratories (BMBL)" welke specifieke eisen met betrekking tot de juiste bescherming en virus handling procedures Gegevens. Neem contact op met de plaatselijke veterinaire veiligheid en milieuveiligheid personeel om institutionele specifieke eisen voor de procedures met behulp van virussen te leren. Regelgeving met betrekking tot de procedure kamers, quarantaine, en de identificatie van biologisch kooien variëren tussen instellingen.

1 Prepare P0 Pups en pleegmoeders

1. Zorg voor een hoge vet voer voor alle zwangere en zogende vrouwen aan de energiebehoefte van de fokkerij en het geven van borstvoeding te ondersteunen.
2. In de avond, het opzetten van een fokprogramma kooi door het toevoegen van een of twee gezonde vrouwtjes naar de kooi van een enkele bewoner mannelijke. De volgende ochtend, controleer dan de vrouwtjes voor een dekking plug en scheiden de vrouwtjes van de mannetjes als een stekker aanwezig is.
   1. Gebruik pleegmoeders om pups te verhogen van een genetische achtergrond met slechte maternale kenmerken (bijvoorbeeld C57BL / 6 of C3HeJ). Pleegmoeders accepteren pups uit een ander nest, indien de overgedragen pups worden geboren binnen vier dagen van het eigen nest de pleegmoeder.
   2. Een afzonderlijke paring kooi met ICR of FVB vrouwtjes langs de experimentele fokkers zodat de twee vrouwtjes leveren op ongeveer dezelfde tijd.
3. Vrouwtjes zullen leveren in 19 ± 1 dagen vanaf de datum stekker, afhankelijk van de achtergrond stam. Drie dagen voor delivery (16 dagen na de datum stekker), plaats de zwangere vrouw in een schone kooi met vers nestmateriaal en een overdekte schuilplaats.
4. Controleer voor pasgeboren pups twee keer per dag te beginnen 2 dagen voor de verwachte datum van levering (17 dagen na de datum stekker). Onderzoek de kooi met minimale belasting van de moeder door gluren door de bodem op de aanwezigheid van roze pasgeborenen. Muizen in het algemeen leveren pups in de ochtend, maar in zeldzame gevallen zal leveren in de middag.
5. Plan om injecties uit te voeren zodra de pups verpleging (die duidelijk door zichtbare melk plekken zullen zijn), of binnen 6 uur van de geboorte, wat het eerst komt.

2 Bereid Apparatuur voor Injectie

1. Bereid een 10 ul injectie spuit met een 32 G naald voor algemene P0 neonaten. Als het uitvoeren van stereotactische injectie, monteer de spuit op de manipulator arm.
2. Bij gebruik van een stereotaxisch frame voor injecties, het koelen van de neonatale fase tot 4-8 ° C met toevoeging van 100% ethanol en droog ijs tot het reservoir aan de voorkant van het blok. Houd de temperatuur boven de 1 ° C tot bevriezing van de pups te voorkomen.

3 Bereid Virale Verdunningen voor Injectie

1. Bereid een 1% trypanblauw kleurstof oplossing (20x voorraad).
2. Bereid 5-25 pi fracties van adeno-geassocieerde virus (AAV) voorraad in een klasse 2 bioveiligheid kast. Plaats deze fracties bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Vermijd extra vries-dooi cycli dit veroorzaakt het virus transductie efficiëntie verliezen.
3. Verwijder een hoeveelheid van AAV uit de -80 ° C vriezer en plaats op ijs te ontdooien.
4. Bereid de virale oplossing voor injectie door verdunning van het virus in ijskoude 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Begin met een tien-voudige seriële verdunning ⁽¹⁰ oktober - 10 augustus virale deeltjes / halfrond) voor de eerste optimalisatie van de transductie patroon.
5. Voeg 20x trypan blauw aan de AAV oplossing tot een eindconcentratie van 0,05%.

4. Enscenering van de pasgeboren pups voor Injectie

1. Plaats een klein aluminium plaatje op het ijs om af te koelen. Plaats een droge taak doekje op de plaat de huid van de pup beschermen tegen de kou metaal. Dit dient als een vlakke koud oppervlak voor verlamming en het injecteren van de pups.
2. Bereid een warming pad geschikt voor het houden van neonatale muizen warm voor en na de injectie.
3. Zodra de pasgeboren pups zijn begonnen met verpleegkundige, verwijder ongeveer de helft van hen uit de kooi en laat de andere helft met hun moeder. Plaats de verzamelde pups op de opwarming pad in afwachting van injectie.
   OPMERKING: Als de biologische moeder niet de zorg voor de pups, verwijder het hele nest uit de kooi onmiddellijk en plaats de pups op een opwarming pad om injectie te wachten. Deze situatie kan zich voordoen met het eerste nest geboren C57BL / 6 vrouwtjes of met andere inteeltstammen dat arme fokkerij kenmerken hebben. In deze situatie zal melkvlekken niet zichtbaar pasgeboren pups worden.
4. Transfer een pup van de opwarming pad op de koude metalen plaat om onderkoeling anesthesie. Wacht 2-3 minuten voor de pup volledig verdoofd worden. Bevestig verdoving door heel zachtjes knijpen in een poot en monitor voor het gebrek aan beweging of ademhaling.

5 Injectie van AAV in Neonatale Muizen

1. Vrije hand intracraniële injectie van AAV in neonatale muizen:
   1. Laad 5 pl verdund AAV met 0,05% trypan blauw in de injectiespuit.
   2. Veeg het hoofd van de verdoofde pup met een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol.
   3. Identificeer de injectieplaatsen bij 2/5 van de afstand van de lambda hechting aan elk oog. Een alternatief op de injectieplaats is gelegen op ongeveer 0,8-1 mm lateraal van de pijlnaad, halverwege tussen lambda en bregma. Deze monumenten zijn zichtbaar door de huid op P0.
   4. Markeer de injectieplaats met een niet-giftige laboratorium pen.
   5. Houd de spuit met de schaal toegankelijk voor monitoring het volume van de oplossing afgegeven.
   6. Zorg ervoor dat de duim de bovenkant van de zuiger kan bereiken. Verwijder vervolgens de duim van de zuiger, terwijl het plaatsen van de naald, zodat niet onbedoeld doseren virus.
   7. Zoek een comfortabele positie om de arm voor injectie brace door de invoering van de elleboog op de bank en leunt de arm op de ijsemmer.
   8. Leg de pup op zijn kant met zijn kop direct onder de spuit. Draai de kop van de pup, zodat de gemarkeerde plaats van injectie naar boven is gericht en voorzichtig maar stevig deze positie met een open hand te houden.
   9. Houd de injectiespuit loodrecht op het oppervlak van de schedel en de naald op de gemarkeerde injectieplaats tot een diepte van ongeveer 3 mm. Injecteer de naald totdat de weerstand daalt lichtjes, wat aangeeft dat de naald is doorgedrongen in de laterale ventrikel. Als een verwijzing nodig is, markeer 3 mm van het uiteinde van de naald met een niet-giftige maker. Pas de injectie diepte voor pup grootte en spanning op basis van kleurstof targeting van de ventrikels.
   10. Houd de spuit vast zodat de zuiger ingedrukt zonder dat de naald verder in de hersenen kan zijn. Als de injectie verplaatst in de thalamus, zal virusverspreiding ernstig beperkt.
   11. Begin langzaam te injecteren virus, terwijl het toezicht op de gedoseerde volume van de spuit. Dien een maximaal volume van 2 pi in elk ventrikel. Als de naald in de juiste positie, wordt de kleurstof verspreid naar het ventrikel vullen.
   12. Trek langzaam de naald.
   13. Laat de eerste injectie te sluiten vóór het injecteren van het andere halfrond.
       OPMERKING: Niet injecteren dezelfde plaats meer dan eens. Terugplaatsen van de naald krachten virus dat al is geïnjecteerd te lekken en veroorzaakt letsel of de dood van de pup.
   14. Injecteer de contralaterale ventrikel volgens dezelfde procedure.
2. Stereotactische injectie van AAV in neonatale muizen:
   1. Laad 5 pl verdund AAV met 0,05% trypan blue into de injectie spuit in handen van de stereotaxische manipulator.
   2. Plaats voorzichtig de kop van de pup tussen het oor bars van de neonatale frame. Controleer de kop waterpas in de Y-as (voor naar achter) door te controleren dat de lijn tussen lambda en bregma parallel aan het podium. Controleer het hoofd niveau in de X-as (links naar rechts) door te controleren dat een denkbeeldige lijn tussen de oren of tussen de ogen, parallel aan de fase is.
   3. Veeg het hoofd van de verdoofde pup met een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol.
   4. Gebruik de stereotaxische manipulator aan de spuit bovengenoemde lambda positioneren en nul de X en Y coördinaten. Verplaats de stereotaxische armen (X, Y) = (0.8, 1.5) mm voor standaard P0 pups.
      OPMERKING: Pup grootte en stereotactische coördinaten kan per stam en leeftijd. Coördinaten op basis van kleurstof injecties past indien nodig de laterale ventrikels richten.
   5. Langzaam de naald in de injectieplaats. Het oppervlak van de schedel zal indent en dan los zodra de naald de huid is doorgedrongen. Trek de naald tot de schedel herstelt de normale concave vorm, maar houd de schuine kant van de naald onder de huid. Nul de Z-coördinaat op dit punt.
   6. Steek de naald tot Z = -1.7 mm en vervolgens terug te trekken tot -1.5 mm.
   7. Injecteer langzaam het virus. Elk halfrond kunnen tot 2 pi van de oplossing.
   8. Houd de spuit in de plaats voor 30-60 sec na het voltooien van de injectie en dan langzaam terug te trekken van de naald dan 1-2 minuten.
   9. Herhaal de contralaterale hemisfeer, met negatieve coördinaten in de X-as voor de injectie.
      OPMERKING: Alternative coördinaten voor injectie zijn (X, Y, Z) = (0.8, 2.0, -1.5) mm en (1.2, 1.0, -1.5) mm. Voer de eerste injectie (0.8, 2.0), dan naar (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) en tenslotte (1.2 -1.0). Injecteer 1 ul van de oplossing op elke locatie, voor een totaal van 2 pl per halfrond. Beweeg snel tussen de injecties om de procedure in de les te voltooiens dan 10 minuten.

6 Post-injectie Care

1. Na het voltooien van injecties in beide hersenhelften, plaats de pup terug op de opwarming pad totdat de lichaamstemperatuur en huidskleur terug te keren naar de normale en de pup begint te bewegen.
2. Bij gebruik van de biologische moeder om de geïnjecteerde pasgeborenen te zogen, en de terugkeer van de geïnjecteerde pups naar de biologische moeder nadat ze herstellen de normale beweging. Leg de resterende uninjected pups op de opwarming pad. Herhaal deze procedure totdat alle muizen werden geïnjecteerd.
3. Bij gebruik van een pleegmoeder voor de geïnjecteerde pasgeborenen te zogen, en de overdracht van alle geïnjecteerde pups aan de pleegmoeder voor zorg na ze herstellen de normale beweging.
   1. Verwijder meeste of alle pups die tot de pleegmoeder van de kooi tot het succes van de geïnjecteerde dieren.
   2. Als pups pleegmoeder en geïnjecteerd pups hebben dezelfde ogen en huidskleur, markeer pups van de pleegmoeder met een laboratorium pen, zodat ze kunnen wordenlater onderscheiden.
   3. Plaats pups de pleegmoeder en een aantal van hun beddengoed samen met de geïnjecteerde pups. Zorg ervoor dat de geïnjecteerde pups verwerven van de geur van haar biologische nakomelingen te verbeteren acceptatie van de nieuwe pups.
   4. Plaats alleen de geïnjecteerde pups terug in de kooi van de pleegmoeder. Ruimen eventuele resterende pups van de pleegmoeder.
4. Zorg ervoor dat de moeder is het bijwonen van en verpleging de geïnjecteerde pups binnen 10 minuten van het plaatsen van hen in de kooi. Als de moeder niet de pups binnen deze tijd heeft te verzamelen, overdragen pups naar een andere pleegmoeder.
5. Label de kooi met een biohazard-kaart te laten zien dat het bevat viraal-geïnjecteerde dieren. Het huis van de kooi in een goedgekeurd gebied voor 72 uur.
6. Na de 72 uur quarantaineperiode, de overdracht van de moeder en de pups (maar geen beddengoed of andere kooi items) om een ​​schone kooi. Uitvoeren van deze overdracht in een Level 2 bioveiligheid kast om de blootstelling aan een viraal besmette beddengoed te voorkomen. Return de schone kooi met de geïnjecteerde dieren naar de gewone muis faciliteit.
7. Plaats de vuile kooi in een biohazard zak, steriliseren in een autoclaaf, en dan terug de kooi naar het vivarium.

7 Cleanup

1. Overgebleven virus oplossing bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. Het virus blijft transductie ten minste 2 maanden bij opslag bij 4 ° C ^8.
2. Ontsmet de injectienaald en spuit met 2% bleekmiddel, gevolgd door herhaalde spoelingen in gedeïoniseerd water.
3. Reinig de werkruimte met 2% bleekmiddel gevolgd door 70% ethanol.
4. Verzamel alle disposable artikelen waaronder pipet tips, tubes, masker en handschoenen in een plastic zak biologisch gevaarlijk. Afvoeren van afvalstoffen, zoals vereist door de lokale wetgeving en institutionele beleid (dwz autoclaaf of verbranden).

8 Bereid Mouse Brains for Imaging

1. Plaats een geïnjecteerde muis in een kooldioxide euthanasie kamer bij 34 weken na injectie. Volg de institutionele richtlijnen voor een correcte euthanasie procedures. Geen dieren perfuse met paraformaldehyde als dit de fluorescentie label zal uitdoven.
2. Verwijder de gehele hersenen van de schedel en bevestig 3-12 uur in 4% paraformaldehyde in PBS bij 4 ° C.
3. Breng de vaste hersenen tot 30% sucrose voor cryoprotection. Incubeer bij 4 ° C totdat de hersenen naar de bodem zinkt.
4. Verzamel een emmer uit fijngemalen droog ijs. Snijd de hersenen in de helft beneden de middellijn. Begraaf de hersenhelften in het droogijs te bevriezen.
5. Koel de microtoom fase door toevoeging van droog ijs en 100% ethanol.
6. Bevestig de hersenen naar het podium met de middellijn naar beneden met behulp van PBS, en laten bevriezen.
7. Doorsnede van de hersenen op 30-45 micrometer dikte met behulp van een bevriezing sledemicrotoom.
8. Plaats gedeelten in 24-well platen bevattende antivries-oplossing (250 ml glycerol, 300 ml ethyleenglycol, 500 ml 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4). Afdekplaten with aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
9. Verzamel secties 1-4 putjes en spoel 3x in PBS.
10. Mount secties op objectglaasjes en dekglaasje. Laat dia's om te drogen op een donkere plaats.
11. Afbeelding dia's met behulp van geschikte filters voor inheemse YFP of tdTomato om het virus transductie patroon controleren.

Resultaten

Succesvolle intraventriculaire virale injectie opbrengsten wijdverspreid en robuuste neuronale expressie. Hier virale transductie evalueerden we gebruik YFP- of tdTomato fluorescerende genen onder de controle van de kip beta actinepromoter (CBA promotor). Deze constructen werden verpakt in AAV8 en geïnjecteerd in de laterale ventrikels van neonatale (P0) ICR-muizen. Hoge virale titers (10 ¹⁰ deeltjes per halfrond) resulteerde in dichte etikettering van de olfactorische bulb, striatum, de cerebrale cortex, hip...

Discussie

We hebben een veelzijdige werkwijze beschreven voor het manipuleren neuronale genexpressie middels AAV als middel voor grootschalige plaatsing in de neonatale muizenhersenen. Vergeleken met andere vormen van neuronale transgenese zoals in utero elektroporatie ¹ of stereotaxische intracraniale injectie ^2,3, neonatale virale injectie is relatief eenvoudig. De basis procedure kan worden uitgevoerd in een paar minuten met slechts een ijsemmer en een microliter spuit. Optimale overleving en transgene ex...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ICR outbred muizen	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	Deze stam is ook bekend als CD-1
FVB inteelt muizen	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weken oud
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-muis
Hoogvet knaagdier voer	Purina Mills	PicoLab Muis dieet 20, #5058	Dit is ons standaard fokkersvoer
Hoogvet knaagdier voer (alternatief)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% eiwit knaagdier dieet #2019S	Als laag fyto-oestrogeen, autoclaveerbare dieet is nodig
Injectiespuit	Hamilton	7653-01	10 ml spuit
Injectienaalden	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, voor standaard P0 injecties
Metalen plaat voor cryoanesthesie	McMaster Carr	8975K439	Ruwe aluminium plaat, 6” x 12”, 0.25” dik, moet worden gesneden in 3 gelijke stukken en randen gefreesd door lokale machine winkel
Stereotactisch apparaat voor kleine dieren met digitaal display	David Kopf Instruments	Model 940
Universele spuithouder met naaldsteunvoet	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatale frame	Stoelting	51625	Officieel genoemd een muis en neonatale rat adapter
Biogevaar afvoerzakken met steriele indicator	VWR	14220-030	Belangrijk! – Controleer met lokale dierenarts en milieuveiligheidspersoneel om het protocol van uw instituut voor biogevaar afvalverwijdering te leren