Blootstelling van bloed aan polymere bloedgeleiders initieert de vreemde lichaamsreactie die is geassocieerd met klinische complicaties. Hier wordt de Chandler Loop Apparatus beschreven, een experimenteel hulpmiddel dat de bloedperfusie door deze geleiders nabootst. Het toevoegen van recombinant CD47 resulteert in verminderde aanwijzingen van de vreemde lichaamsreactie op deze geleiders.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het gebruik van de Ex Vivo Chandler Loop Apparaat om Beoordeel de Biocompatibility Modified Polymer Blood Conduits
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De vreemd lichaam reactie optreedt bij een kunststof oppervlak is ingevoerd om het lichaam. Het wordt gekenmerkt door adsorptie van bloedeiwitten en de daaropvolgende bevestiging en activatie van bloedplaatjes, monocyten / macrofagen hechting en ontstekingscellen signalering gebeurtenissen, die leiden tot post-procedurele complicaties. De Chandler Loop Apparatus is een experimenteel systeem waarmee onderzoekers om de moleculaire en cellulaire interacties die optreden bij grote hoeveelheden bloed worden doorbloed dan polymere leidingen te bestuderen. Hiertoe is deze inrichting gebruikt als een ex vivo model waarmee de beoordeling van de anti-inflammatoire eigenschappen van verschillende polymeren oppervlaktemodificaties. Ons laboratorium heeft aangetoond dat het bloed leidingen, covalent bewerkt via fotoactivatie chemie met recombinant CD47, kan biocompatibiliteit verlenen aan polymere oppervlakken. Het toevoegen CD47 op polymere oppervlakken, kan een effectief middel om de werkzaamheid van polymere bloed leidingen bevorderen. HaarEin is de methode waarin de fotoactivatie chemie gebruikt om recombinant CD47 klinisch relevante polymère bloed leidingen en het gebruik van de Chandler Loop een ex vivo experimenteel model toevoegen bloed interacties met CD47 gemodificeerd en regelleidingen onderzoeken.
Inleiding
Vele klinische procedures zoals cardiopulmonale bypass en nierdialyse, vereisen het gebruik van polymere bloed leidingen en zijn vaak geassocieerd met post-procedurele complicaties 1. Bij geperfuseerd met bloed, deze polymeren ontlokken het vreemdlichaamsreactie (FBR), waardoor adsorptie van bloedeiwitten en bloedplaatjes, monocyten / macrofagen hechting en het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines, die allemaal bijdragen tot post-procedurele complicaties en / of falen apparaat 2,3. Zo strategieën om dit probleem aan te pakken blijft een belangrijke en voortdurende gebied van biomaterialen onderzoek. Onderzoekers hebben geprobeerd om dit probleem aan te pakken door het wijzigen van bloed contactoppervlakken met bioactieve moleculen of bioinert 4-6. Onderzoek in ons laboratorium is gericht op het toevoegen van recombinant CD47 (recCD47) polymere biomaterialen als een strategie om de FBR beperken en toename van de werking van deze materialen. CD47 is een alomtegenwoordig uitgedrukt transmembrane eiwit met een bekende rol in de immuun-ontduiking, het verlenen van de status van 'zelf' op te drukken cellen 7-10 en toont belofte bij het verlenen van biocompatibiliteit wanneer toegevoegd aan polymere oppervlakken 11-13. Signaal-regulerend eiwit alfa (SIRPα), de verwante receptor voor CD47, en een lid van de immunoreceptor tyrosine-gebaseerd remmend motief (ITIM) bevattende familie van transmembraan eiwitten tot expressie wordt gebracht op cellen van myeloïde oorsprong 14. We hebben eerder aangetoond dat CD47, via SIRPα-gemedieerde signalering, down-reguleert de immuunrespons op polyurethaan (PU) en polyvinylchloride (PVC) in in vitro, ex vivo en in vivo modellen 11-13.
Centraal in ons onderzoek is een betrekkelijk nieuwe fotoactivatie chemie hierin beschreven, waarbij chemisch reactieve thiol groepen covalent gehecht aan polymère buis door reactie van de buis met een multifunctioneel polymeer (PDT-BzPh), bestaande uit 2-pyridyldithio (PDT), de fotoreactieve benzofenon (BzPh) en een carboxy-gemodificeerde polyallylamine 11-13. Vermindering van het covalent aangehechte PDT groepen met tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) 11 levert een gethioleerde oppervlak dat vervolgens kan worden omgezet met therapeutische groepen. En hierin eerder beschreven 12,13, recCD47, verder gemodificeerd door toevoeging van een C-eindstandige poly-lysine tail 12,13, wordt omgezet met sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC) gedurende 1 uur tot thiol-reactieve groepen genereren, waardoor een formatie monosulfide binding tussen de buis en recCD47 11. De anti-inflammatoire vermogen van de CD47 gefunctionaliseerde oppervlakken werd getest ex viv o via de Chandler Loop Inrichting met menselijk bloed, die oorspronkelijk werd beschreven in 1958 als een in vitro model van trombose coagulatie 15. De inrichting is gebaseerd op eengesloten buissysteem gedeeltelijk gevuld met lucht en een roterende motor om het bloed circuleren door de buis 15. Dit experimentele model biedt de mogelijkheid om het effect van blootstelling bloed op niet gemodificeerde oppervlakken en het effect van deze oppervlakmodificaties bij de fysiologie van cellen van het bloed onderzocht.
recCD47 kan worden toegevoegd aan een verscheidenheid van polymere oppervlakken met deze fotoactivatie chemie, en de anti-inflammatoire capaciteit kan worden beoordeeld met behulp van een klinisch relevante ex vivo model nabootst bloeddoorstroming via polymere oppervlakken 11,12. Klinische kwaliteit bloed leidingen gemodificeerd met recCD47 significant lagere bloedplaatjes en inflammatoire celhechting vergeleken met ongemodificeerde polymeren bij blootstelling aan menselijk bloed in de inrichting. Een stap-voor-stap beschrijving van deze wijziging wordt hierna beschreven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 wijzigen Polymere Oppervlakken met recCD47
Opmerking. Het protocol is schematisch samengevat in figuur 1 Figuur 1A illustreert generatie thiol-reactieve polymere oppervlakken Figuur 1B illustreert generatie thiol-reactieve recCD47..
- Dag 1
- Bereid een oplossing van PDT-BzPh (1 mg / ml) en kaliumbicarbonaat (KHCO3) (0,7 mg / ml) in steriel water. Roer overnacht bij 4 ° C (beschermd tegen licht).
- Dag 2
- Snijd polymere slang in 40 cm lange stukken (lang genoeg om te passen rond draaiende wielen).
- Geniet buizen in een 0,1% waterige oplossing van hexacylpyridinium gedurende 90 min bij kamertemperatuur op een shaker of Chandler Loop Apparatus. Spoel de buizen met steriel water 3x na 90 min inwerken.
- Zuur de PDT-BzPh vanaf dag 1 door de toevoeging van 15% waterige kalium monobase (KH 2 PO 4). Voeg 50 ul KH 2 PO 4 per ml van PDT-BzPh, de vorming van een troebele micellaire oplossing.
- Week de buizen in de aangezuurde PDT-BzPh oplossing gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur op een shaker of inrichting.
- Spoel de buizen met verdund azijnzuur (1: 1.000) eenmaal.
- Maak de buizen aan UV-bestraling met een totale duur van 60 minuten. Draai buizen ¼ draai om de 15 minuten naar het gehele oppervlak bestralen.
- Week de buizen in een oplossing van 20 mg / ml kaliumbicarbonaat (KHCO3) gedurende 20 min bij kamertemperatuur op een shaker of inrichting.
- Spoel de buizen met steriel water 3x en bewaar bij 4 ° C in steriel water.
- Dag 3
- Los 5 mg Sulfo-SMCC in 200 ul dimethylformamide (DMF) (Let op: Voer in de zuurkast).
- Voeg 50 ul van de Sulfo-SMCC bereid in stap 1 0,1 mg / ml recCD47 poly-lysine oplossing en roer gedurende 60 minuten bij roOM temperatuur.
- Gedurende 60 min roer, ontgas steriele Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en zet apart.
- Zuiveren Sulfo-SMCC omgezet recCD47 met een 7K molecuulgewicht cut-off rotatie ontzoutingskolom instructies van de fabrikant. Collect final doorstroomsysteem (hoogwaardige thiol-reactieve recCD47) en verdund tot een volume noodzakelijk het bekleden van de binnenkant van de buis met DPBS.
- Spoel de buizen van dag 2 met een steriele, ontgast DPBS 3x.
- React het gemodificeerde oppervlak van de buizen met een oplossing van 20 mg / ml met tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) in ontgast DPBS minder dan 2 minuten. Spoel de buizen met steriele ontgast DPBS 4x.
- Voeg de Sulfo-SMCC-gereageerd recCD47 de buizen en incubeer overnacht bij 4 ° C op een schudder of inrichting.
2 Immunochemie Kwantificering van recCD47 op Gewijzigd Surfaces
- Spoel bewerkt buizen worden gekwantificeerd van Dag 3 with DPBS 3x. WINKEL buizen niet voor kwantificering in DPBS bij 4 ° C.
- Gebruik een 4 mm punch biopsie om dubbele buis steekproeven en plaats biopsie stoten in putjes van een 96-well plaat.
- Bereid een negatieve controle bestaande uit een ongemodificeerd buis monster niet behandeld met het detectie-antilichaam. Bereid een antilichaam controle bestaande uit een ongemodificeerde buis monster behandeld met het detectie-antilichaam. Bereid de gemodificeerde buis monsters behandeld met het detectie-antilichaam.
- Vak monsters met 0,4% bovine serum albumine (BSA) in DPBS gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur op een shaker.
- Na blokkering aspireren BSA en spoel met tris-gebufferde zoutoplossing plus 1% Tween-20 (TBST) 3x, 10 min elk op een shaker.
- Bereid een werkende verdunning van antilichamen in 0,4% BSA volgens de aanbevolen verdunning fabrikant voor immunoassays. Verdunnen menselijk CD47 Antibody B6H12-FITC 1: 100 in 0,4% BSA.
- Voeg 200 ul van antilichaamverdunning aan geschikte putjes. IncubaTe negatieve controles met slechts 0,4% BSA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten op een schudapparaat (beschermd tegen licht).
- Spoelen met TBST 3x, 10 min elk op een shaker. Zuig het laatste TBST spoelen en voeg 200 ul DPBS om buis monsterputjes.
- Verzamel de uiteindelijke doorstroom, die hoogwaardige thiol-reactieve recombinant CD47 en verdun tot een volume noodzakelijk het bekleden van de binnenkant van de buizen met DPBS.
- Lees FITC intensiteit van het signaal met behulp van een microplaataflezer met FITC excitatie (485 nm) en emissie (538 nm) instellingen.
- Bereken recCD47 gebonden aan polymere vlak uitgaande van standaardwaarden, goed voor auto-fluorescentie en niet-specifieke binding van het antilichaam controlemonster.
3 Chandler Loop Apparatus Protocol
Seek Institutional Review Board (IRB) goedkeuring van de bloedafname-protocol en geïnformeerde toestemming papierwerk voorafgaand aan de start van de verzameling van menselijke bloedmonsters. Verkrijgen van informatiermed toestemming van een menselijk bloed donor.
OPMERKING: Een diagram dat de inrichting is weergegeven in figuur 2.
- Vul waterbad met gedestilleerd water tot ongeveer 1/2 van de wielen een diameter worden ondergedompeld. Voeg genoeg bleekmiddel aan het waterbad tot 10% bleekmiddel oplossing te maken. Stel waterbad tot 37 ° C en laat de temperatuur in evenwicht.
- Verzamel metalen adapters (figuur 1B), ongemodificeerde buizen gewijzigde slangen en assembleren ongeveer inrichting wielen, zoals getoond in figuur 1C. Zorg ervoor dat slangen past nauwsluitend rond het wiel met de metalen adapter op zijn plaats.
- Verkrijgen van 30 ml bloedmonster die een IRB-goedgekeurde protocol, in een flacon ingevuld met 2 ml citraat of andere anticoagulantia, en meng door omkeren om te voorkomen dat stolling zodra het monster is verzameld.
- Voeg ongeveer 10 ml bloed aan elke buis met de metalen ventiel en spuit, waardoor lucht in de buis. Bevestig het ventieldopje en rraaien 3 uur.
- Het bloed afvoeren naar een verspilling beker behandeld met een 10% bleekwater-oplossing (of zoals vereist door institutionele beleid).
- Voorzichtig afspoelen slangen interieur met DPBS om alle sporen van bloed te verwijderen. Collect doorstroom in de afvalvaten. Afvoeren van het bloed in overeenstemming met de institutionele beleid.
- Ontsmet het apparaat en eventuele bloed contact oppervlakken met behulp van een 10% bleekwater oplossing of volgens de institutionele beleid.
- Werkwijze monsters voor fluorescentiemicroscopie of scanning elektronenmicroscopie zoals hieronder beschreven.
4 fluorescentie microscopie en Celtelling
- Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing (Let op: Voer in de zuurkast).
- Incubeer buizen in een 4% PFA oplossing overnacht bij 4 ° C.
- Na een nacht incubatie, verwijder 4% PFA en spoel films erg voorzichtig met DPBS.
- Snijd de slang in secties om het lumen oppervlak bloot voor vlekken.
- Staineen gedeelte van de buis met een paar druppels fixeermiddelen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (bescherming tegen licht). Na het kleuren, spoel de slangen heel voorzichtig met DPBS om de achtergrond DAPI signaal te verminderen.
- Afbeelding met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een DAPI filter en digitale camera het aantal cellen in 9 blindelings geselecteerde gezichtsveld onder 200X vergroting tellen.
- Record cel telt per gezichtsveld en passende statistische analyses uit te voeren om de statistische significantie van de resultaten te bepalen.
5 Scanning Electron Microscopy
- Bereid een 2% glutaaraldehyde-oplossing (Let op: Voer in de zuurkast).
- Incubeer buizen in 2% glutaaraldehyde oplossing overnacht bij 4 ° C.
- Na een nacht incubatie voorzichtig spoel de slangen 3x met DPBS.
- Bereid een oplossing van osmiumtetroxide 1% (Let op: Ernstig gevaar bij inademing! Gebruik in zuurkast).
- Incubeer buizen in een oplossing van 1% osmiumtetroxide gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Voorzichtig Spoel de slang 3x met DPBS.
- Bereid een reeks concentraties ethanol (25%, 50%, 75%, 95% en 100% ethanol).
- Dehydrateer de slang door incubatie in de reeks van ethanol concentraties. Incubeer bij 25%, 50%, 75% en 95% ethanol gedurende 20 minuten elk. Incubeer in 100% ethanol gedurende 30 minuten.
- Superkritische punt droog de buis met CO 2 gedurende 45 minuten om alle vocht te verwijderen.
- Mount buis secties op een specimen stub met zilver pasta of grafiet.
- Coat buis secties met 12,5 nm van goud-palladium.
- Onderzoek in een scanning elektronenmicroscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Genereren thiol-reactieve polymere oppervlakken op het gebruik van PDT-BzPh en TCEP samen met thiol-reactieve recCD47 poly-lysine met SMCC maakt de bevestiging van recCD47 polymere oppervlakken. De modificatie proces is schematisch weergegeven in figuur 1. Het gemak van deze wijziging werkwijze is dat het kan worden toegepast op vele verschillende eiwitten en veel verschillende polymere oppervlakken, uitgaande van het eiwit kan worden gewijzigd met voldoende chemisch reactieve groepen zoals amine bevatt...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De fotoactivatie chemie (samengevat in figuur 1) maakt de modificatie van vrijwel elk polymeer oppervlak dat voldoende koolwaterstoffen moet PDT-BzPh hechting en daaropvolgende UV bestraling vergemakkelijking foto-activeren PDT-BzPh. Functionaliseren het polymere oppervlak met reactieve thiolgroepen maakt de latere bevestiging van een reeks testbare moleculen van interesse. In onze specifieke studies kozen we recombinant CD47 11-13. De specifieke conjugatie chemie die we gebruikten betrof de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, onder nummer award R21 EB015612 (SJS), en het National Heart, Lung, and Blood Institute, onder nummer award T32 HL007915 (JBS en RJL), van de National Institute of Health.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Let op! Gebruik in dampkap |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Let op! Gebruik in dampkap |
| 2-pyridyldithio,benzofenon (PDT-BzPH) | Gesynthetiseerd in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digitale Camera | Leica | DC500 | Niet meer in productie |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Let op! Gebruik in dampkap |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescente Microscoop | Nikon | TE300 | |
| Glacial Azijnzuur | Fisher Scientific | A38-212 | Let op! Gebruik in dampkap |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antilichaam | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Let op! Gebruik in dampkap |
| Kalium Bicarbonaat (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Kalium Fosfaat Monobasisch (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Buizen (Cardiovasculair Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Meest klinische kwaliteit buizen zullen werken |
| Scanning Elektronen Microscoop | JEOL | JSM-T330A | |
| Natrium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Gevoelig voor vocht! |
| tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield met DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Licht gevoelig! |
| Zeba Spin Desalt Kolommen – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
Referenties
- Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
