Methodenartikel

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

7.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51872

⸱

2 augustus 2015

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

In dit artikel

Samenvatting

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Samenvatting

High-density functioneel eiwit microarrays die ~ 4200 recombinante gist-eiwitten onderzocht-eiwit-eiwit-interacties via affiniteit gezuiverd gist-kinase-fusie-eiwit dat een V5-epitoop tag voor uitlezing. Gezuiverde kinase wordt verkregen door kweken van een giststam geoptimaliseerd voor hoog kopie eiwitproductie herbergt een plasmide dat een kinase-V5 fusieconstruct onder een induceerbare GAL-promoter. De gist wordt gekweekt bij restrictieve media met een neutrale koolstofbron gedurende 6 uur gevolgd door inductie met 2% galactose. Vervolgens wordt de kweek geoogst en kinase onder toepassing van standaard affiniteit chromatografische technieken om een ​​zeer zuivere eiwit kinase voor toepassing bij de assay te verkrijgen gezuiverd. Het gezuiverde kinase wordt verdund met kinase buffer een geschikt bereik voor de analyse en het eiwit microarrays worden geblokkeerd voordat hybridisatie met de eiwit microarray. Na de hybridisatie worden de arrays gesondeerd met monoklonale V5 ANTIBody aan eiwitten door de kinase-V5 eiwitgebonden identificeren. Tenslotte worden de arrays gescand met een standaard microarray scanner en gegevens geëxtraheerd downstream informatische analyse 1,2 tot een groot vertrouwen reeks eiwitinteracties voor downstream validatie in vivo te bepalen.

Inleiding

De noodzaak om globale analyse van eiwitbiochemie bindingsactiviteit en in vivo uitvoeren heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe methodes voor het profileren van eiwit-eiwitinteracties (PPI) en de post-translationele modificaties van hele proteomen 1,3-8. Proteïne microarrays worden vervaardigd als functioneel eiwit microarrays met behulp van full-length functionele eiwitten 4-6,8,9 of analytische eiwit microarrays die antilichamen bevatten 10,11. Ze zijn ontworpen om een hoge dichtheid van eiwitten gerangschikt op microscoopglaasjes met verschillende oppervlakchemie bevatten een verscheidenheid van de verrichting van een brede biochemische analyses 12 proefomstandigheden vergemakkelijken. Nitrocellulose en aldehyde oppervlakchemie voor chemische bevestiging door middel van lysine of affiniteit gehechtheid methoden zoals nikkel gechelateerde slides voor het bevestigen van His-gemerkte eiwitten en glutathion voor affiniteit bevestiging onder anderen 13.

Het gebruik van functioneel eiwit microarrays eiwit-eiwit interacties te detecteren is toegang tot een hoogwaardig functioneel eiwitbibliotheek 14. S. cerevisiae vatbaar is voor productie van een dergelijk bibliotheek door de koppeling van high-copy affiniteit gelabeld eiwit constructen met high-throughput chromatografische zuiveringstechnieken. Het overgrote deel van de gist genoom is gesequenced en vrijwel de gehele proteoom kan worden uitgedrukt door een hoog-kopie plasmide voor zuivering en biochemische analyses 12. Zodra de eiwitten worden verkregen en gekleed in 384-well formaat, worden ze afgedrukt op een microscoopglaasje waardoor een snelle parallelle multi-parametrische biochemische analyse en bioinformatica ondervraging 8,14-16. Proteïne microarrays zijn gebruikt voor enzymatische assays en interacties met eiwitten, lipiden, kleine moleculen, en nucleïnezuren onder vele andere toepassingen. De toegankelijkheid van eiwitten op het oppervlak van proteoomarrays maken ze vatbaar voor verschillende analytische detectie waaronder immuun-affiniteit, Surface Plasmon Resonance, fluorescentie en vele andere technieken. Bovendien maakt een nauwkeurige controle van de experimentele conditie waar het moeilijk in vivo kunnen zijn.

Het doel van dit protocol is het juiste gebruik van functioneel eiwit microarrays eiwit-eiwit interacties te detecteren tonen. Deze applicatie maakt het mogelijk high-throughput parallel biochemische analyse van eiwit binding activiteiten met een sterk gezuiverde analyt (eiwit) van belang. Een C-eindstandig (carboxy-terminale) gelabeld V5-fusie-bait eiwit van belang wordt geproduceerd uit een hoog-kopie plasmide in een giststam geoptimaliseerd voor eiwitzuivering. C-terminale tagging zodat de volledige lengte eiwit is vertaald. Het eiwit gebruikt in deze studie is Tda1-V5 fusieproteïne kinase dat gezuiverd wordt met behulp van nikkel affiniteitshars via een His6X tag. De Tda1-V5 fusion construct gebruikt een imidazoolgradiënt de meest verrijkte fractie voor toepassing bij de assay elueren via seriële elutie gezuiverd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Probe Voorbereiding

  1. Cultuur en zuiveren de V5-fusie kinase sondes gebruikt om interacties met andere eiwitten als volgt onderzocht:
    1. Gebruik vers weggeschoten giststam Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) met V5-fusie-eiwit (uitgedrukt uit GATEWAY vector pYES-DEST52). Met het geïsoleerde eiwit als probe op de microarray. Plate de gist van synthetische volledige-uracil (Sc-Ura) / 2% dextrose / Agar en groeien bij 30 ° C gedurende 3 dagen ingevroren kweek (-80 ° C glycerol voorraad).
    2. Inoculeren startculturen (5-20 ml) uit een enkele kolonie en te groeien 's nachts in Sc-Ura / 2% dextrose op schudden platform (220-250 rpm) of het wiel bij 30 ° C.
    3. De volgende morgen enten 400 ml van de Sc-Ura / 2% raffinose kweek voldoende starterkweek om een uiteindelijke OD600 van 0,1.
    4. Grow de Inoculanten om OD600 van 0,6, gevolgd door galactose inductie van de V5-kinase fusie construct expressie door een oplossing van 3 x Yeast Extract / pepton (YEP) aangevuld met 6% Galactose door toevoeging voldoende om de inductie media te verdunnen met een factor 3, zodat eindconcentratie van 2% galactose.
    5. Braken cellen bij 30 ° C gedurende 6 uur op een schuddend platform. Gebruik een 2 L Erlenmeyer passende beluchting zorgen.
    6. Oogst cellen met behulp van een JA-10 (of vergelijkbare) rotor door verspinnen 400 ml van celsuspensie bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    7. Was de cellen eenmaal met 50 ml ijskoude PBS buffer en overgebracht in een 50 ml conische buis. Was de pellet opnieuw in ijskoude PBS buffer (zonder detergenten of andere additieven) voor lysis en transfer naar 2 ml snap-cap buizen voor lysis.
    8. Draai de cellen bij 20.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C een pellet en pipet verwijderd de buffer.
    9. Plaats de buizen op ijs en ga verder met lysis stap.
    10. Lyse van de cellen (250-350 ul pellet) met 00,5 mm zirkonia parels in een 1: 1: 1 volume celpellet, kralen, en fosfaat-gebufferde saline (PBS) lysisbuffer en vortex het mengsel met een agitatie platform 3 keer met tussenpozen van 2 min bij 4 ° C.
    11. Centrifugeer het lysaat bij 20.000 x g in een tafelmodel microfuge gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    12. Pipet supernatant in polycarbonaat hoge snelheid centrifugebuis en verduidelijken door ulracentrufugation gedurende 30 minuten bij 150.000 xg bij 4 ° C.
    13. Breng het geklaarde lysaat van een buis met voorgewassen Ni2 + affiniteitshars (~ 100 ul) en geïncubeerd op een nutator gedurende 2 uur bij 4 ° C te vangen histidine (His) 6X tagged V5-fusieproteïne.
    14. Was de hars drie keer gedurende 10 minuten bij 4 ° C met wasbuffer. Pellet de hars met een tafelblad centrifuge gedurende 5 min bij 1000 xg bij 4 ° C en zuig de supernatant. Voeg verse wasbuffer voor elke wasbeurt en terug te keren de buis de nutator voor agitatie tijdens het wassen.
    15. Na het wassen steps is voltooid, breng het gewassen hars een nieuwe G-25 kolom voor elutie.
    16. Breng 25 gl elutiebuffer in een stapsgewijze wijze beginnend met 100 mM imidazol met 500 mM imidazool in stappen van 50 mM in totaal 9 fracties.
    17. Assay de verzamelde fracties middels natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel (SDS-PAGE) en Coomassie kleuring op de meest verrijkte fractie (s) te identificeren voor gebruik in de assay en voeg glycerol tot 30% en bewaar bij -80 ° C tot gebruik in de assay.

2. Onderzoek naar de Arrays

OPMERKING: Zie stap 2.6 van deze sectie om het antilichaam oplossing te bereiden voor het begin van de test.

  1. Om wisselwerkingen te detecteren verdunnen V5-fluorofoor geconjugeerd antilichaam (bijv AlexaFluor 647) tot 260 ng / ml in probe buffer en meng door schudden.
    OPMERKING: Bereid dit antilichaam oplossing 30 min vóór gebruik en plaats de buis op een nutatof of wiel om volledig mengen en een homogene suspensie van antilichaam te verzekeren.
  2. Verdun de V5-fusie-eiwit probe over een concentratiegebied van 5-500 ug / ml.
    OPMERKING: Geoptimaliseerde voor elk eiwit-eiwit interacties assay met behulp probe buffer. Optimalisatie houdt in het toevoegen van meer sondes naar buffer sonde. Typisch 10 ug / ml gebruikt als uitgangspunt en aangepast op basis van de signaalsterkte.
  3. Verwijder het eiwit microarrays uit de diepvries (-20 ° C) en breng aan 4 ° C in de koelkast juist voor gebruik.
  4. Voeg buffer direct blokkeren om de dia houder met het eiwit micorarrays en bedek de bovenkant met parafilm om lekkage te voorkomen. Blokkeer de arrays in blokkerende buffer gedurende 1 uur bij schudden bij 50 rpm op een stadium bij 4 ° C.
  5. Na blokkering dragen de arrays een bevochtigde kamer afgekoeld tot 4 ° C en voeg 90 ul verdunde probe direct aan de matrix oppervlak. Overlay de arrays met een verhoogde lifter slip en incubeer statisch (zonder schudden) in de vochtige kamer bij 4 ° C gedurende 1,5 uur.
  6. Was de arrays 3 maal gedurende 1 min elk in probe buffer in drie 50 ml conische buizen. Voeg de dia conische buisjes met genoeg pre-gekoelde sonde buffer volledig envelop de dia. Laat de lifter slip om voorzichtig glijden van het eiwit microarray (doe het niet dwingen af, omdat dit kan leiden tot schade aan de array oppervlak).
  7. Breng het antilichaam oplossing direct naar serie direct na het voltooien van de wasbeurt (stap 2.5) en overlay met een verhoogde lifter slip als voorheen. Incubeer de arrays gedurende 30 minuten bij 4 ° C in de vochtige kamer.
  8. Voer dezelfde wasstap als voorheen (3 maal 1 min in probe buffer) en rotatie in een 50 ml conische buis bij 800 xg in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Luchtdroge de matrices in een houder in het donker gedurende 30 min voorafgaand aan de matrix gescand op 647 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De eiwit-eiwit interacties activiteit waargenomen onder toepassing van een standaard chip lezer evalueren Tda1-V5 proteïne kinase fusieconstruct als lokaas eiwit tegen een gist-functioneel eiwit microarray die ongeveer 4.200 unieke S. cerevisiae GST-fusie-eiwitten. Verdere ondervraging met de GenePix software onthulde een veelheid van binding gebeurtenissen van verschillende intensiteiten. De affiniteit werd afgeleid uit de gesorteerde intensiteit van het signaal afkomstig van een monoklonaal V5-fluorofoor geco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gepresenteerde protocol werd oorspronkelijk uitgevoerd onder toepassing van 85 unieke gist proteïne kinase-V5 fusie-eiwitten aan bindingsactiviteit tussen afzonderlijke en verwante families gist eiwitkinasen resulteert in de identificatie van nieuwe kinase interactienetwerken in vivo 1 Vergelijk. Als een opkomende proteomics profiling technologie, de ontwikkeling van High Throughput (HTP) screening van proteomen gebruik van proteïne microarrays zich op peptide bibliotheken en eukaryotische en pro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH. De analyses getoond in Figuur 1 werden uitgevoerd door Dr. Joseph Fasolo. We danken Dr. Rui Chen voor nuttige opmerkingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Petri DishesVWRNC-10747of vergelijkbaar
Bacto yeast extractDifco0217-17
Bacto peptoneDifco0118-17
Bacto agarDifco0140-01
DextroseSigmaD9434
RaffinoseSigmaR0514
GalactoseSigmaG0750
Sc-Ura drop out mediaMP Bio114410622
Small Culture tubesVWR/Fisher
Large Erlenmeyer FlaskVWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 ml)
Falcon tube (50 ml)VWR/Fisher21008-951
PBS TabletsSigmaP4417
FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube)
FastPrep MachineMP Biomedicals116004500
Zircon BeadsBioSpec11079105
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266 
NaClSigmaS3014 
Imidazole (pH = 7.4)SigmaI5513 
PMSFSigma93482
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)Roche11873580001
Phosphatase inhibitor cocktail 1sigmaP2850
BSASigmaA2153 
Tween-20SigmaP1379 
ATPSigmaA1852 
Shaking Incubator (30 °C)
Nickel Affinity ResinLife TechnologiesR901-01
G25 columnGE life sciences27-5325-01 
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
Monoclonal V5 AntibodyLife TechnologiesR960-25
Alexa647 Tagged monoclonal V5 AntibodyLife Technologies451098
Protein Microarrays KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix ScannerMolecular Devices
Lifter SlipsThomas Scientifichttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF  (voeg net voor gebruik toe)		Voeg de reagentia toe aan 1x PBS (0,01 M fosfaatbuffer, 0,0027 M kaliumchloride, 0,137 M natriumchloride; pH 7,4) om het gewenste volume lysoplossing te verkrijgen
Blocking Buffer: 1% bovien serum albumine (BSA), 0,1% Tween-20Voeg de reagentia toe aan 1x PBS om het gewenste volume blokkeringsbuffer te verkrijgen
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (voor kinasen), 1% BSAVoeg het reagens toe aan 1x PBS om het gewenste volume van de probe buffer te verkrijgen
Wash Buffer: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM imidazool (pH 7,4), 2 mM MgCl2Voeg het reagens toe aan 1x PBS om het gewenste volume van de probe buffer te verkrijgen
Elution Buffer: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazool (pH 7,4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (voeg net voor gebruik toe)Voordat u begint, is het belangrijk om de concentratiegradiënt van imidazool (50 – 500 mM) op te merken en om aparte buisjes voor elke concentratie te maken (het is raadzaam om het interval te maken met incrementen van 50 mM). Voeg het reagens toe aan 1x PBS om het gewenste volume van de probe buffer te verkrijgen
3x YEP +6% galactose: Los 30 g gistextract op en  60 g pepton in 700 ml H2O, en autoclaveer. Voeg 300 ml van gefilterde gesteriliseerde 20% galactose toe (wt/vol) Galactose mag niet worden geautoclaveerd

Referenties

  1. Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
  2. Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110(2006).
  3. Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
  4. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  5. Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  7. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
  8. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
  9. Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
  10. Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
  11. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
  12. Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
  13. Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
  14. Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
  15. Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
  16. Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).
  17. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prote ne microarraygistkinaseaffiniteitszuiveringV5 epitope tagmicroarray scannerfluorescentiedetectiebioinformatische analyseprote ne expressiegistcultuur

Gerelateerde artikelen