Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Summary

Gepresenteerd is een flexibele informatica workflow waardoor multiplex-image-based analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers en berekent marker translocatie tussen deze compartimenten. Procedures zijn voorzien verstoring van cellen met siRNA en betrouwbare methode voor het merkerdetectie door indirecte immunofluorescentie in 96-well formaat.

Abstract

Vooruitgang in het begrijpen van de controlemechanismen inzake het gedrag van cellen in aanhangend zoogdieren weefselkweek modellen worden steeds meer afhankelijk van vormen van single-cell analyse. Methoden die composite data die de gemiddelde waarden van biomarkers van celpopulaties leveren riskeren subpopulatie dynamiek dat de heterogeniteit van de onderzochte biologische systeem reflecteren. In overeenstemming hiermee worden traditionele benaderingen vervangen of ondersteund, meer verfijnde vormen van cellulaire assay ontwikkeld voor de beoordeling van high content microscopie mogelijk. Deze testen kunnen leiden tot grote aantallen beelden van TL-biomarkers, die mogelijk gemaakt door de begeleidende proprietary software pakketten, zorgt voor een multi-parametrische metingen per cel. Echter, de relatief hoge kapitaalkosten en overspecialisatie van veel van deze apparaten hun toegankelijkheid verhinderd om vele onderzoekers.

Hier beschreven is eenuniverseel toepasbaar workflow voor de kwantificering van meerdere fluorescente merker intensiteiten van specifieke subcellulaire gebieden van individuele cellen geschikt voor beelden door de fluorescente microscoop. De sleutel tot deze werkstroom is de uitvoering van de vrij beschikbare Cell Profiler software ¹ tot afzonderlijke cellen in de afbeeldingen segment ze in bepaalde subcellulaire gebieden onderscheiden en leveren fluorescentie marker intensiteitswaarden specifiek zijn voor deze regio. De extractie van individuele cel intensiteitswaarden van beeldgegevens het hoofddoel van deze werkstroom en wordt geïllustreerd met de analyse van bedieningsgegevens van een siRNA scherm G1 controle punt regelgevers hechtende menselijke cellen. Echter, de hier gepresenteerde workflow worden toegepast op de analyse van gegevens van andere middelen cel verstoring (bijvoorbeeld verbinding screens) en andere vormen van op fluorescentie gebaseerde cellulaire merkers en aldus zou nuttig zijn voor diverse laboratoria.

Introduction

De hier gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van de vrij beschikbare software Cell Profiler-algoritme geleide verdeling van fluorescentie microscopie beelden van hechtende cellen aan individuele cellen en subcellulaire gedefinieerde gebieden identificeren voeren. Deze benadering genoemd beeldsegmentatie, kan de daaropvolgende meervoudige parametrische analyse van de afgebeelde cellen kwantificeren fluorescent gelabelde markers gelokaliseerd op elke cel of subcellulaire gebied (aangeduid als gesegmenteerde objecten). Deze workflow vormt een basis voor het inschakelen van high-inhoudelijke analyse en is bedoeld om te dienen als een instrument dat verder kan worden ontwikkeld en aangepast om multi-parametrische passen, individuele cel-analyses in laboratoria zonder toegang tot gespecialiseerde high-gehalte instrumenten of proprietary software. De met dit manuscript aangeleverde bestanden bevatten een test reeks relevante ruwe beeldgegevens, algoritme instellingen en het ondersteunen van scripts om de beschreven analyse te genereren. De verstrekte algoritme instellingen fof Cell Profiler zijn geoptimaliseerd voor Voorbeeld dataset en de discussie sectie gegevens welke aanpassingen nodig zijn om gebruik van beeldgegevens uit andere studies mogelijk.

Zodra kwantitatieve gegevens wordt gewonnen met behulp van Cell Profiler, kunnen verschillende laboratoria verschillende vereisten om op de door de individuele cel waarden in de ruwe data informatie te gebruiken; hier is een benadering waarbij poorten worden toegepast op de ruwe gegevens voor elke assay. Met behulp van deze poorten, worden de gegevens omgezet in binaire termen van respons, waardoor visualisatie van trends verbinding van verschillende behandelingen met de subpopulaties van cellen die respons gedefinieerd door de poorten. De poorten zijn ingesteld op basis van opmerkingen van de verdelingen verkregen voor passende negatieve en positieve controles voor elke relevante meting. Het gebruik van poorten is slechts een voorbeeld van hoe je de ruwe, cel-gebaseerde metingen te beheren. Ook hier is het gebruik van nucleair DNA intensiteit measurements in hun ruwe vorm als een continue reeks van waarden in combinatie met de gated gegevens. Andere manieren waarop het beeld analysegegevens worden overwogen, afhankelijk van de aard van de studie; statistische alternatieven voor poorten voor het toekennen cellen subpopulaties gemeld ² en systematische vergelijkingen van strategieën om high content samenvat in grote aantallen parameters gemeld ^3.

High-inhoud analyses van beeldgegevens hebben gebruik in cellulaire studies van drug-respons gevonden, reverse genetics en milieu-stress signalisatie ^4-6. De verdienste van high content analyse komt voort uit het feit dat algoritmische analyse van fluorescentiemicroscopie gegevens maakt kwantitatieve en ruimtelijke parameters tegelijk worden beschouwd in afzonderlijke cellen ^7. Zo kan cellulaire resultaten voor meerdere assays kruisverwijzingen, differentiële gedrag van assay-d zijnefined cel subpopulaties kunnen worden gevolgd binnen de experimentele condities en testen kunnen worden gekeken naar morfologische variabelen. De strategieën en analyse workflow besproken, als voor andere hoog-gehalte benaderingen kunnen leveren gemultiplexte gegevens die zijn kruisverwijzingen naar individuele cellen. High-inhoud methoden pak studies die fluorescentiemicroscoop beelden te genereren en zijn van toepassing op de analyse van gegevens, variërend van tientallen beelden geproduceerd in lage doorvoer conventionele fluorescentie gebaseerde microscopie door naar de duizenden beelden geproduceerd met behulp van geautomatiseerde high content platforms.

De workflow wordt hier geïllustreerd met bijvoorbeeld gegevens uit die afzonderlijke tests worden gemeten in termen van zowel de nucleaire fluorescerende marker intensiteiten of nucleaire / cytoplasmatische translocatie van een fluorescerende reporter eiwit. De workflow is flexibel doordat deze testen kunnen afzonderlijk worden onderzocht of in combinatie, afhankelijk each gegeven onderzoeksvraag door verschillende onderzoekers. De voorbeeldgegevens worden geproduceerd als onderdeel van een RNA interferentie (RNAi) experiment (figuur 1). Kleine interfererende RNA oligonucleotiden (siRNA) worden gebruikt om specifieke eiwitten knockdown in HCT116 humane colorectaal carcinoom cellen die tot veranderingen twee fluorescente reporters van kinase (CDK) activiteit van cycline afhankelijke. De CDK6-afhankelijke fosforylatie van het nucleaire retinoblastoma eiwit op serine 780 (P-S780 RB1) wordt beoordeeld door antilichaam kleuring. In dezelfde cellen, wordt een groen fluorescent proteïne-gemerkte reporter van CDK2 activiteit (GFP-reporter CDK2) bepaald door de nucleaire cytoplasmatische verhouding waarin bij afwezigheid van CDK2 activiteit van de reporter bevindt in de kern en bij CDK2 activatie shuttles in het cytoplasma ^8. Bovendien wordt de kern-DNA van elke cel gekleurd met een DNA intercalerende kleurstof, bisbenzimide, die dient als middel om cellen kernen grenzen opsporen en definiëren de beelden ook eensa mate van DNA overvloed voorlichting over celcyclus positie van de cel (figuur 2).

De activiteiten van CDK6 en CDK2 zijn detecteerbaar als cellen doorvoer van G1 naar S-fase van de celcyclus ⁵ en volgen elkaar ^9,10 en, als zodanig, is nauwe overeenstemming tussen de twee reporters in individuele cellen verwacht. De demonstratie dataset hier gebruikte analyses als voorbeeld het effect van siRNA gericht CDK6, retinoblastoma proteïne (RB1) en een niet-gerichte negatieve controle (tabel 1). Knockdown van CDK6 moet zowel een afname van de P-S780 RB1 epitoop en een accumulatie van cellen in G1 fase van de celcyclus te wekken. De RB1 knock-down dient als reagens controle voor de specificiteit van de fosfo-S780 antilichaam. Fluorescentie microscoop beelden van formaline gefixeerde ^11, fluorescerend gekleurd HCT 116 weefselkweek cellen worden gebruikt voor het algoritmische beeldanalyse. De verkregen numerieke data wordt dan gebruikt omkruisverwijzingen de verslaggevers en peilen naar de impact van de verschillende knockdown staten.

De potentiële omvang van de door dit type analyse van gegevens kan een uitdaging om de normale analyse-instrumenten te presenteren. Bijvoorbeeld, kan de individuele cel data groter is dan sommige spreadsheet-software zal plaats zijn. Inbegrepen zijn Perl scripts die eenvoudige, zeer repetitieve, begeleid verwerking uitvoeren van de gegevens ten behoeve van analyse van grote datasets. De Perl scripts zijn speciaal geschreven voor de output bestanden door Cell Profiler bij de verwerking beeldbestanden met een specifiek bestandsnaamconventie (figuur 3), en laat variabele aantal velden per putje voor gebruik in de analyse. Het is vaak belangrijk gate individuele cel assay gegevens om trends in cel subpopulaties ⁵ volgen en hier is het gebruik van een Perl-script om vlag elke cel gebaseerd op een voorafbepaalde poort voor elk type assay. Ook inbegrepen zijn optionele Perl scriptswaarvan de gegevens samenvatten resultaat voor afzonderlijke putjes (of condities) levert: percentage cellen binnen de gestelde poort en de gemiddelde waarden van de ruwe test scores. Deze laatste, meer homogene manier bekijken van de gegevens, is geldig wanneer responsen invloed op alle of de meeste cellen in een put. Zoals hierboven besproken, zoals evaluatie lager nuttiger dan die welke de individuele cel gegevens gating waarin respons beperkt tot een subset van cellen in een populatie.

De bruikbaarheid van de beschreven werkstroom is niet beperkt tot verstoring van siRNA of de marker assays beschreven. Studies hebben deze benadering gebruikt om reacties in weefselkweek experimenten met combinaties van siRNA, chemische remmers en bestraling en voor de beoordeling van andere dan CDK6 markers en CDK2 activiteit ⁵ assay.

Conceptueel, de experimentele strategie maakt het mogelijk een verscheidenheid van biologisch bruikbare subcellulaire regio's automatisch worden geregistreerdin individuele cellen aanwezig in fluorescentiemicroscoop afbeeldingen. Als zodanig kan deze benadering kwantitatieve multiplex waaruit biologische informatie die kunnen worden gemist door technieken die gericht zijn op populaties plaats van individuele cellen opleveren. Met kleine aanpassingen kan de aanpak en analyse workflow beschreven kwantitatieve, individuele cel gegevens opleveren voor elke fluorescentie gebaseerde test uitgangen en cel-biologische reacties, waar de kwantitatieve beoordeling van DNA-gehalte, kwantificering van nucleaire of cytoplasmatische fluorescentie of het pendelen van merkers tussen deze twee compartimenten afzonderlijk of in een multiplex wijze van belang. Publicatie-eisen steeds meer neigen naar het indienen van openlijk toegankelijke ruwe gegevens, toegang tot en vertrouwdheid met gratis tools voor het microscopie analyse zoals die hier beschreven zal ook van direct belang zijn voor laboratoria op zoek naar gepubliceerde gegevens opnieuw analyseren.

Protocol

1. Experimentele Perturbation en Cell Labeling voor Response Markers (Reverse Transfection siRNA Screen)

1. In een steriele weefselkweek kap pipet 70 ul van 200 nM siRNA in 1x siRNA buffer in putjes van een steriele, gewoon 96 well plaat. Verdun transfectie lipide in 40 volumes serumvrij DMEM medium en breng 105 pl in elk putje met siRNA.
   OPMERKING: Verdunnen 262,5 pl lipide in 10,5 ml serumvrij DMEM levert een master mix geschikt om hele plaat met 96 putjes van siRNA, leveren 2.6 pl lipide per putje. Het gebruik van 200 nM siRNA beginconcentratie in deze stap een werkende concentratie van 20 nM leveren in stap 1.3, maar procedures zal voor werken concentraties tot 5 nM, met de beginconcentratie dienovereenkomstig aangepast (50 nM). Lagere werkende concentratie kan off-target vals positieve scores te verminderen, hoewel ze de omvang van on-target respons kan verminderen, wat leidt tot verhoging van de on-Target fout-negatieve uitslagen.
2. Meng de plaat met zachte trillingen gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Splitsen het resulterende 175 ul in drie replicaten per 50 ul doel op een ondoorzichtige, weefselkweek behandeld, 96-wells plaat met een transparante basis.
3. Reverse transfecteren door intrekking 8000 cellen per putje in 150 ul DMEM bevattende 10% serum direct op de 50 pl lipide-siRNA complexen. Gebruik HCT116 humane colorectale cellen stabiel tot expressie van een GFP-gelabelde marker rapportage CDK2 activiteit ^5,8. Geen verdere menging nodig. Sluit de plaat met een steriele, zelfklevende ademend membraan vochtregeling en plaat "edge-effecten te voorkomen" en plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende 48 uur.
4. Zuig het medium zodanig dat een kleine resthoeveelheid media blijft de putjes. Fixeer de cellen door toevoeging van 100 pl 4% gebufferde formaldehyde aan elk putje en incubeer in een zuurkast gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur temperature.
5. Verwijder de fixeeroplossing door opzuigen van de plaat. Op dit moment de stoppen de proef door wassen van de plaat driemaal met 100 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar afgedicht onder 100 ul PBS in het donker bij 4 ° C gedurende maximaal een week, of doorgaan met de permeabilisatie van de cellen.
   OPMERKING: We raden verwerking platen zo spoedig mogelijk na fixatie, en algemeen de voorkeur opslag van volledig verwerkt platen. Biociden conserveermiddelen zoals thimerosal, natriumazide of commerciële alternatieven worden toegevoegd micoroganismal groei te voorkomen. Toevoeging van fosfataseremmers helpt fosfo-epitopen behouden, en andere middelen voor eiwitmodificatie toestanden behouden kan bruikbaar relevante assay contexten
6. Verwijder PBS uit de plaat en permeabiliseren de cellen door toevoeging van 100 ul permeabilisatie oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder schudden. Zuig het permeabilisatie oplossing met behulp van een multikan.Annel pipet. Herhaal deze stap drie keer.
7. Blokkeer de cellen door toevoeging van 100 pi blokkeren oplossing per putje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het blok oplossing opzuigen de plaat vervolgens sonde met 50 pl anti P-S780 RB1 antilichaam verdund 500-voudig in het blok oplossing 2 uur in het donker bij kamertemperatuur.
8. Was de plaat drie keer met 100 ul plaat wassen oplossing, waardoor de oplossing op de plaat gedurende 5 minuten per keer. Probe de plaat overnacht in het donker bij 4 ° C met 50 ul fluorescent gelabelde secundaire antilichaam 1000-voudig verdund in blok-oplossing aangevuld met 2 uM van de chromatine-specifieke DNA kleurstof bisbenzimide. Was de plaat driemaal vóór en opslag verzegeld onder 100 ul PBS in het donker bij 4 ° C. De plaat binnen twee weken.

2. Imaging and Image Segmentatie

1. Gebruik een confocale of spinning-disk fluorescentie microscoop met een 20X objectief apart te nemen 16bit, grijswaarden TIFF-afbeeldingen in drie kanalen die overeenkomt met het DNA-kleurstof, GFP en immuno-kleuring fluoroforen. Leg vele niet-overlappende beeldreeksen, hier aangeduid als frames, naar afbeelding ongeveer 1000-2000 cellen per putje.
2. Noem de beeldbestanden systematisch zodat elke bestandsnaam is een unieke combinatie van 'experiment naam', 'goed adres', 'framenummer' en 'channel identifier', in deze volgorde (figuur 3). De set voorbeeld data maakt gebruik van "Blue" (chromatine DNA vlekken) of "Groen" (GFP) of "Red" (de immuno-gekleurd fluorofor) als kanaal identificatiemiddelen. De goed adres, framenummer en kanaalidentificeermerk worden verder aangeduid als de metadata. Gebruik de underscore symbool om verwarrende goed en het frame metadata te voorkomen.
3. Geef de bestanden met deze metadata elementen in de aangegeven volgorde. Dit is nodig om ervoor te zorgen dat de volgende software stappen Correctly groep sets van beelden voor analyse.
4. Download en installeer de freeware Cell Profiler, Active Perl Community Edition, R statistische programmeeromgeving en RStudio. Accepteer alle standaard opties tijdens de installatie; PC-gebruikers de installatie van Active Perl moeten alle opties met betrekking tot PATH, bestandsextensie vereniging en script in kaart brengen waar gevraagd in te schakelen. Actieve Perl is optioneel voor Mac-gebruikers, maar zij anders zal nodig hebben om de Perl-script draaien in stap 3.2 van de Terminal command line in plaats van het pictogram te klikken.
5. Open de Cell Profiler-software, klikt u op 'Bestand', 'Import Pipeline' dan 'Uit bestand "en selecteer het bestand 3_channels_pipeline.cppipe (Cijfers S1A & S1B). Het bestand bevat instructies die noodzakelijk zijn voor de software om image-bestand metagegevens interpreteren vanuit de bestandsnaam conventie beschreven. Cell Profiler betreft nu de beelden, uittreksels nucleair DNA en antilichamen intensiteiten van these en gebruikt de GFP kanaal om de verhouding van nucleaire versus cytoplasma intensiteit te berekenen voor elke cel gedetecteerd (figuren 4 en 5).
6. Klik op de knop 'Bekijk output-instellingen' in de linkerbenedenhoek van de Cell Profiler venster. Aan de bovenkant van het nieuwe scherm zijn tekstvakken label 'Default Input Folder' en 'Standaard Output Folder'. Een tegelijk, op de map-iconen aan de rechterkant van deze dozen en selecteer de locatie van de beeldbestanden voor analyse en de bestemming voor de opgehaalde gegevens, respectievelijk (Figuur S1C).
7. Begin de beeldanalyse door op de knop 'Analyze Images' in de linkerbenedenhoek van Cell Profiler. Aan de onderkant van het scherm te houden aan de resterende tijd voor de extractie van gegevens, het 'Stop Analysis' en 'Pause' toetsen. Indien nodig pauze de analyse door het selecteren van de 'Pause' knop op elk gewenst moment, wat handig isbij het bekijken van de beelden die worden geanalyseerd (beschreven in stap 2.8).
8. Eventueel, de ramen open voor een van de stappen beeldanalyse door te klikken op het oog-pictogrammen in het paneel op de uiterst links van het programmavenster (Figuur S1D). Observeer het venster 'IdentifyPrimaryObjects' en die voor 'Secundair' en 'Tertiaire Objects' om te controleren of de huidige instellingen in Cell Profiler om te presteren beeldsegmentatie zijn geschikt (zie figuur 1 en discussie voor advies over het wijzigen van deze instellingen).
9. Klik op 'OK' in het bericht dat wordt weergegeven wanneer de analyse is voltooid. Ga naar de locatie 'Standaard Output Folder' waar alle data bestanden met de resultaten worden opgeslagen als komma-gescheiden-waarde (.csv) (Figuur S2A).

3. Gegevens Extraction

1. Vind het nieuwe bestand 'Nuclei.csv', die is opgenomen onder deoutput van Cell Profiler. Dit bestand bevat individuele cellen voor tl-nucleaire antilichamen intensiteit, nucleair DNA intensiteit en GFP-CDK2 reporter ratiowaarden (figuren 6A & S2A).
   OPMERKING: Verschillende laboratoria willen dergelijke gegevens verwerken aard van hun assays passen. Voorgesteld voor de huidige gegevens is het gating van de cellen van elke behandeling conditie volgens het antilichaam gegevens en het GFP-CDK2 reporter waarden met behulp van de meegeleverde Perl-script '2_gate_classifier.pl'.
2. Kopieer de voorwaarde Perl-script bestand '2_gate_classifier.pl' in dezelfde map als de 'Nuclei.csv' databestand (figuur S2A). Dubbelklik op het pictogram voor de Perl-script en, als daarom wordt gevraagd, typt u de volledige naam van het gegevensbestand, gevolgd door een '.csv' filename naam voor het bestand waarin de cellen moeten worden afgesloten en uiteindelijk de poort waarden voor het antilichaamfluorescentie en GFP-CDK2 reporter gegevens.
   OPMERKING: Hoe voornamelijk bepalen poort instellingen en deze toe te passen voor de analyse van de gegevens worden hieronder in de sectie representatieve gegevens en figuur 6 besproken (om de verstrekte gegevens gebruik '0.004' en '1.5', respectievelijk te analyseren). Mac-gebruikers moeten het Perl-script van de Terminal commandoregel te typen draaien: 'perl 2_gate_classifier.pl'.
3. Let op de nieuw aangemaakte bestand waar de rauwe individuele cel assaywaarden combineert uit de oorspronkelijke Cell Profiler gegevens met sub-populatie labels die laten zien hoe elke cel van elk goed presteert tegen beide poorten (figuur 6C).
4. Plot de gegevens voor elke experimentele conditie met behulp van de individuele cel subpopulatie labels door het openen van de RStudio software. Klik op 'Bestand' en 'Open File' en selecteer vervolgens de voorwaarde 'analysis.r' bestand. Let op de commando's van de figuren 6B plotten, 7 en 8 in de linker venster van RStudio (figuur S2B). In het venster linksboven, tussen de dubbele aanhalingstekens symbolen op de lijnen 5 en 6, typt u de computer het adres van de map met de gated gegevens. Onder meer de stationsletter en de naam van het bestand zelf, respectievelijk (bijvoorbeeld "C: / analyse map / analyse output" en "nuclei_gated.csv").
   OPMERKING: Als RStudio wordt gebruikt voor de eerste keer op een bepaalde computer, zal de R grafische pakket 'ggplot2' moeten eerst worden geïnstalleerd. Dit is een eenmalige stap voor een nieuwe installatie van RStudio, waarna deze stap overbodig. Om 'ggplot2' te installeren, klik op het tabblad genaamd 'Pakketten' boven het venster in de rechter benedenhoek van RStudio, klikt u op de knop 'Install Packages' die onder deze verschijnt. Een nieuw venster verschijnt. Type 'ggplot2' (het weglaten van citaten) in de 'pakketten' stempo in dit nieuwe venster en tenslotte klikt u op de knop 'Installeren' om het venster te sluiten, installeert u de benodigde ggplot2 functies en terug te keren naar de belangrijkste RStudio venster om verder met stap 3.6.
5. Hoogtepuntlijnen 1 tot en met 17 in de linker raam van RStudio, klik op de knop 'Uitvoeren'. Dit zal de experimentele gegevens, drempelwaarden en goed locatie gegevens in te voeren in R (figuur S2C). R zal nu tijdelijk de relevante gegevens te houden voor het plotten.
6. Markeer individuele blokken van de rest van de code onder lijn 17 en maak de bijbehorende percelen met maar voordat u op de 'Run' te klikken. Let op de percelen in het venster in de rechterbenedenhoek van RStudio en aantal formaten opslaan door op de knop Exporteren (Figuur S2D).
7. Bij het sluiten RStudio, klik op 'Do not Save' als daarom wordt gevraagd. Dit voorkomt verwarring over het volgende gebruik van RStudio die anders gegevens houdenvan de vorige sessie.

Results

De set van beelden bijvoorbeeld gegenereerd met behulp van de reverse-transfectie siRNA screening protocol is opgesteld voor en het gebruik van Cell Profiler-software geanalyseerd. De resulterende numerieke ruwe data is zodanig dat elke cel afzonderlijk vertegenwoordigd is, terug te voeren zijn imago en goed van oorsprong en gemeten voor verschillende fluorescentie-intensiteit parameters (Figuur 6A). Voor elke cel die de nucleaire gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor de P-S780 RB1 antilichaam en het geïntegreerde DNA intensiteit van de DNA-kleurstof gedefinieerde nucleaire maskers bepaald. De gemiddelde GFP intensiteitswaarden voor kern en cytoplasma gebieden van elke cel worden ook opgenomen waardoor de berekening van nucleaire versus cytoplasmatische fluorescentie van de GFP-reporter CDK2. Stroomafwaarts van deze algoritmische fluorescentie-intensiteit metingen gebruik wordt gemaakt van deze individuele cel gegevens gates definiëren twee assays, kleuring nucleaire antilichamen en GFP-reporter CDK2. Latere annotatie van de cellen op the basis assay resultaten en het gebruik van deze labels specifieke subpopulaties mogelijk verder gekenmerkt door een derde meting (DNA gehalte kern) wordt beschreven.

Histogram plots van de ruwe fluorescentie-intensiteit van gegevens verzameld voor elke test zijn een effectieve manier om te beoordelen hoe celsubpopulaties gedragen onder verschillende omstandigheden. De histogrammen in Figuur 6B de populatieverdelingen van individuele cel gegevens van drievoudige putjes voor elke RNAi knockdown conditie. Aan de linkerkant zijn de gegevens voor de intensiteit nucleaire antilichaam en rechts worden de overeenkomstige gegevens voor het GFP-CDK2 reporter. De P-S780 RB1 antilichaam gegevens blijkt dat de cellen grotendeels bestaan ​​in twee populaties met betrekking tot deze post-translationele modificatie en dat celpopulaties met verlies van RB1 gefosforyleerd op S780 kan worden onderscheiden als een linkse piek van nucleaire intensiteit die verrijkt wanneer CDK6 beneden wordt gevloerd door siRNA. Deze zelfde linker piekwordt gezien als RB1 zelf is de RNAi doel, als gevolg van de regelrechte verwijdering van het eiwit en daardoor P-S780 RB1 kleuring. Daarentegen dezelfde experimentele condities voor dezelfde cellen als waargenomen via de GFP-CDK2 reporter assay tonen een andere dynamiek in de individuele cel gegevens. Een continue verdeling wordt waargenomen, met slechts een enkele piek, maar siRNA die de celcyclus (siCDK6) verstoord, waardoor accumulatie resultaten G1 fase van verlenging van de rechter schouder van deze verdeling (waarbij er dus verhoogde aanwezigheid van cellen die een verhoging van de nucleaire / cytoplasma GFP verhouding, uitgezet op de X-as).

Ook getoond op de histogrammen van figuur 6B zijn de waarden poort (verticale staven) die worden gekozen op basis van de verdelingen van beide reeksen analysegegevens. De regel gebruikt voor de P-S780 RB1 antilichaam gegevens is om de positie van de poort als de halve hoogte te definiëren: op de linker schouder van de belangrijkste maximale breedte positie(Rechts) piek bij het overwegen van de negatieve controle mobiele data (niet-targeting siRNA). Data gemarkeerd rood zijn cellen met verminderde en afwezige P-S780 RB1, die worden geïdentificeerd met deze poort. Een soortgelijke poort gepositioneerd op de tegenoverliggende schouder van de ratiowaarde verdeling wordt gebruikt voor het GFP-reporter CDK2. De resulterende hoge verhouding subpopulatie cellen, die ontbreekt of functie verminderd CDK2 activiteit, worden in het groen weergegeven. Om gemultiplexte analyse van de twee assays illustreren Figuur 6C toont de uitvoering van beide gate waarden met de 2_gate_classifier.pl perl-script om de ruwe data (figuur 6A) te zetten in de geannoteerde bestand hieronder. Deze nieuwe bestand bevat de oorspronkelijke gegevens naast een nieuwe kolom van klasse labels voor elke cel en de twee gate waarden waarmee ze te onderscheiden (in casu poorten van 0,004 voor het antilichaam data en 1.5 voor het GFP-reporter CDK2 gebruikt, respectievelijk) .

Na geclassificeerd de individuele cellen from elk knockdown vast op basis van de twee assays is het nu mogelijk om deze klasse labels gebruiken om de annotatie van plots van de analysegegevens staan. Figuur 7 toont puntgrafieken van de individuele cellen voor de P-S780 RB1 en GFP CDK2 assays van de voorbeeldgegevens in voor alle drie RNAi omstandigheden. Getallen annoteren de kwadranten op de scatterplots tonen de relatieve percentages van elk gated subpopulatie om de hele voor die knockdown context en worden gegenereerd in R met behulp van de klasse labels hierboven beschreven. Deze kavels blijkt dat, vergeleken met cellen die met niet-targeting siRNA (figuur 7B), cellen getransfecteerd met siCDK6 onthullen een netto gegevensverspreiding verschoven zowel neerwaarts over de Y-as (aanduiden geen RB1 fosforylatie bij serine 780) en rechts Op de X-as (met vermelding van lage CDK2 activiteit, figuur 7C). Beide ploegen worden verwacht voor het uitschakelen van deze doelstelling. In tegenstelling hiermee, de gegevens van siRB1 getransfecteerde cellen (Figuur 7A) tonen een verlies van het antilichaam kleuring in overeenstemming met het verlies van het epitoop, maar weinig effect op de datadistributie voor de CDK2 reporter vergelijking met controles getransfecteerd met niet-targeting siRNA suggereert geen groot effect op de GFP -CDK2 verslaggever komt voort uit RB1 knockdown.

Om het gebruik van individuele cel gegevens, subpopulatie classificatie en assay multiplexing Figuur 8 verder te verkennen toont de scatterplot voor de siCDK6 gegevens uit figuur 7C naast gepaarde histogram profielen voor geïntegreerde DNA-intensiteit. De paren histogrammen betreffen tegengestelde helften van de gehele bevolking, verdeeld op basis van hetzij antilichaam intensiteit (rechts van de puntenwolk) of GFP-reporter CDK2 verhoudingswaarden (boven scatterplot). Kwantificering van nucleair DNA intensiteit van deze populatie toont twee pieken karakteristiek 2N en 4N DNA gehalte als de linker en rechter pieken, respectievelijk. De intentions van de poorten getoond in Figuren 6, 7 en 8 zijn zodanig dat cellen geïdentificeerd als laag P-S780 RB1 (gelabeld P-S780-) of een hoge verhouding waarde van de GFP-reporter CDK2 (gemerkt: G1) wordt in G1 fase van de celcyclus. Inderdaad, het DNA-profiel histogrammen subpopulaties geïdentificeerd met een van deze assays overheersend cellen met 2N DNA inhoud. DNA-profielen van de tegengesteld gated populatie (gemerkt: P-S780 + of Non-G1) bevat cellen met distributies variërend van 2N tot 4N, in overeenstemming met dergelijke cellen vaststelling diverse celcyclus posities na de G1 fase.

Hoewel de focus hier het genereren en analyseren van individuele cel gegevens fluorescerend gekleurd afbeeldingen is, is het ook handig om deze gegevens te nemen en samenvatting van elk assay op een goed door-well basis variabiliteit tussen replicaten en de prestaties te monitoren alle putjes voor een bepaling over de gehele plaat van gegevens. Figuur 9 toont de gegevens van elke siRNA behandeling samengevat als de gemiddelde waarden van drievoudige putjes voor het percentage cellen in de poorten toegepast A) P-S780 RB1 data en B) het GFP-reporter CDK2 gegevens. De uitgezette waarden van A en B worden door twee extra Perl scripts die bij dit manuscript; 'Antibody_fluorescence_summary.pl' en 'G1assay_summary.pl', respectievelijk. Deze scripts gebruik maken van de ruwe data gecreëerd door Cell Profiler (Nuclei.csv) en het verslag van gegevens per alsmede i) totale cellen gemeten per well, ii) het aantal cellen binnen de poort, iii) het percentage cellen binnen de poort en iv) het rekenkundig gemiddelde van de gemeten, ruwe gegevens voor dat ook. Dit is als optie geschikt voor het kijken in grote reeksen analysegegevens vóór op de individuele behandeling van gegevens met gemultiplexte beoordeling van individuele cel gegevens zoals in Figuren 7 en 8. De grafieken weergegeven hier plot 'iii) procent cellen binnen de poort' voor beide testen, waarbij de niet-normale verdelingen gezien voor de P-S780 RB1 en GFP-CDK2 in de histogrammen in figuur 6B passen. Deze scripts berekenen ook "iv) het rekenkundig gemiddelde van de gemeten ruwe gegevens voor die goed", waarop de analyse van gegevens voor homogene populatie reacties en normale data verdeling voor en na experimentele verstoring past.

Figuur 1:. Overzicht van de stappen in de workflow fluorescent gelabelde beeld microscoop gegevens kwantitatief te analyseren wordt de workflow hier voorgesteld als vier stappen (A) Ten eerste moet experimenteel cellen te bereiden voor fluorescentie beeldvorming.. De hier beschreven voorbeeld is dat van eenscherm waarin siRNA behandelde hechtende humane tumorcellen gekweekt gedurende 48 uur, gefixeerd en gekleurd op een 96-well weefselkweek platen. Verschillende RNAi staat zijn aanwezig in drievoud in afzonderlijke putten binnen de plaat. De cellen worden gekleurd met een DNA-kleurstof, een antilichaam specifiek voor RB1 gefosforyleerd op CDK4 en 6 selectieve doelplaats Serine-780 (P-S780 RB1) en ze ook stabiel tot expressie GFP-CDK2-reporter, rapportage G1 celcyclus verlaten. Gezamenlijk deze fluorescerende probes vormen twee assays afzonderlijk binnen de workflow beoordeeld. (B) Parallelle microscoopbeelden per fluorescente probe (kanaal) wordt gegenereerd en genoemd zodanig dat gegevens waarmee de beeldanalyse software data organiseren bevatten. (C) The beeldbestanden worden naar de Cell Profiler-software, die individuele cellen en de bijbehorende paren van kernen en cytoplasma algoritmisch identificeert voordat opleveren intensiteitsmetingen voor de drie fluorescerende probes detecteren geladened in elk. (D) Ten slotte een Perl-script wordt gebruikt om de ruwe kwantitatieve gegevens geproduceerd organiseren. Deze stap geldt poorten naar de fluorescentie-intensiteit van gegevens voor elke cel, effectief binning de cellen in subpopulaties, die kan worden uitgezet, gevolgd en kruisverhoor. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Experimentele gegevens moeten worden verkregen door beeldanalyse De vaste, siRNA-behandelde, fluorescent gelabelde cellen uit het voorbeeld dataset werden afgebeeld en bijbehorende intensiteit metingen per cel.. Representatief beeld gegevens worden getoond voor elke parameter opgenomen tijdens beeldanalyse (A) Nucleaire DNA-intensiteit:. De intensiteit van de kleuring van DNA kleurstof kernenergie wordt gebruikt om leveren een maatregel van DNA per kern (B) Nucleaire intensiteit van fosfo-RB1.:-Immuno kleuring specifiek voor P-S780 RB1 met behulp van een primaire (zwart) antilichaam en fluorescent gelabeld secundair antilichaam (rood) staat een intensiteit meting van RB1 fosforylering op . S780 per kern (C) GFP-CDK2 reporter: De cellen die stabiel tot expressie van een GFP-gelabelde reporter eiwit dat translocatie tussen de kern en het cytoplasma in een vast patroon met de celcyclus. Dubbele meting van de gepaarde nucleaire en cytoplasmatische GFP intensiteit voor elke cel maakt berekening van een verhouding per cel die kan worden gebruikt om G1 fase onderscheiden van de rest van de celcyclus. Drie siRNA targets wordt gebruikt voor de analyse illustreren; een niet-targeting negatieve controle siRNA; CDK6 siRNA als een positieve controle in perturbing RB1 fosforylering en celcyclus vooruitgang; RB1 siRNA antilichaam specificiteit.k "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Organisatie van beeldbestanden voorafgaand aan beeldanalyse De beelden uit de weefselkweek plaat worden systematisch genoemd, zodat de beeldanalyse software om de beeldgegevens terug naar de oorspronkelijke experimentele context betrekking hebben.. Deze informatie wordt geplaatst in de bestandsnaam elke afbeelding. (A) Al elke put op de plaat experiment kunnen overeenkomen met verschillende RNAi targets of behandelingen, de bron adres deel uitmaakt van de bestandsnaam. (B) Het framenummer is onderdeel van de bestandsnaam . als elk putje wordt afgebeeld om meerdere, niet-overlappende frames (C) te verzamelen Fluorescerende probes van elk frame worden apart in beeld gebracht; dus ook de bestandsnamen moeten ook nadenken welk kanaal elk beeld betreft. (D) Voorbeeld bestandsnamen, met betrekking tot goed (G12), Frame (2) met elk beeld vertegenwoordigt een van de kanalen (Blauw, Rood, Groen). Gestippelde lijnen verbinden de bestandsnaam elementen om de relevante schematische representaties voor Nou, Frame en Channel, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4:. Het gebruik van Cell Profiler nucleaire DNA en antilichaam kleuring gemeten met de instellingen in het ontvangen bestand pijplijn (3_channels_pipeline.cppipe), Cell Profiler software voor beeldanalyse maatregelen fluorescentie-intensiteitswaarden voor nucleair DNA en antilichaam-binding betreffende individuele cellen . (A) Kernen zijn aangegeven in het 'blauwe' channel beeld van gekleurd DNA. (B) < / Strong> De posities van de DNA-gekleurde kernen worden tijdelijk in een 'Kernen masker'. De kernen masker wordt vervolgens bedekt op (C) de blauwe en rode kanaal afbeeldingen (DNA en antilichaam fluorescentie data, respectievelijk) en de fluorescentie waarden beeld segmenten die overlappen met het masker zijn opgenomen tegen elkaar geïdentificeerde cel. Succesvolle identificatie van afzonderlijke, aangrenzende kernen kan visueel worden beoordeeld in de verschijning van de kernen masker. Ter illustratie, getoond omcirkeld in dit beeld Het masker, zijn voorbeelden waarbij de gekozen instellingen voor het algoritme hebben verkeerd geïdentificeerd naburige kernen als een enkele kern. Het algoritme instellingen op deze gebeurtenissen wordt geïntroduceerd in de sectie Discussie minimaliseren het aanpassen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

/ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg "/>
Figuur 5: Gebruik van Cell Profiler nucleaire en cytoplasmatische GFP intensiteit meten Het GFP-gelabeld CDK2 reporter verplaatst zich tussen de kern en cytoplasma met betrekking tot de celcyclus positie van de cellen.. Op hetzelfde moment dat Cell Profiler berekent het DNA en antilichaam nucleaire intensiteiten per cel (figuur 4), ook eventueel de nucleaire cytoplasma verhouding van GFP intensiteiten voor elke cel. (A) Het DNA kleurstof data voor elk beeld wordt gebruikt voor het genereren Kernen een masker. (B) Cell Profiler gebruikt Kernen masker samen met het GFP beeld van het GFP-reporter CDK2 de positie van elke cel zaad en vervolgens expandeert perimeter elke cel om de gehele voetafdruk van elke cel schatten. Dit wordt een nieuw, "Cell masker. (C) De kernen masker wordt afgetrokken van de cel masker een donut-achtige serie cytoplasma schetst, die worden verkregende 'Cytoplasma masker'. (D) De kernen masker en cytoplasma masker worden gebruikt door Cell Profiler om paren van nucleaire en cytoplasmatische GFP waarden te meten. Deze gepaarde waarden worden vervolgens gebruikt door Cell Profiler om verhoudingen, die te informeren over de positie van elke cel in de celcyclus te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6:. Gegevens extractie - Verwerking ruwe individuele cel gegevens door het opleggen van poorten op assaywaarden Biologische trends van de individuele cellen voor de antilichaamkleuring en GFP-CDK2 reporter assays worden gewonnen met behulp van gated gegevens. Histogrammen van de ruwe data identificatie mogelijk maken van geschikte poort waarden. Deze worden opgelegd een Perl-script. (A) Deeindproduct van het analyseren van de beeldbestanden met de meegeleverde instellingen voor Cell Profiler zijn komma-gescheiden-waarde (.csv). Deze bestanden c ontain individuele cel gegevens over elk van de verschillende subcellulaire segmenten. Het bestand "Nuclei.csv bevat alle geselecteerde metingen van het gebruik van de kernen masker. Deze metingen omvatten intensiteit nucleaire antilichaam, nucleair DNA intensiteit en GFP verhouding (kern / cytoplasma). (B) Histogrammen van intensiteit nucleaire antilichamen (links) en GFP-reporter CDK2's (rechts) uitgezet individuele cellen voor elke siRNA knockdown conditie . De balken in de weergegeven histogrammen tonen de gewenste poort posities voor deze testen. Gekleurde gegevens betreffende de histogrammen geven de gated subpopulaties. (C) De poorten van de twee assays geïllustreerd in B worden toegepast op de ruwe gegevens het Perlscript '2_gate_classifier.pl. Het scriptcreëert een aangepaste kopie van het bestand originele Cell Profiler-uitgang (Nuclei.csv) op latere plotten helpen. De twee gate waarden worden opgenomen in het nieuwe bestand (in kleur gemarkeerd hier) en een nieuwe 'Label' kolom wordt toegevoegd. De labels bin elke cel in vier mogelijke subgroepen op basis van de twee gated assaywaarden voor elke cel. Deze labels worden gebruikt in volgende percelen waarop de berekeningen van de bijdragen van elke subpopulatie, alsook de kruisverwijzingen van extra parameters gegenereerd in Cell Profiler beschikken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7:. Puntgrafieken voor elke siRNA conditie beeltenis van ruwe gegevens voor individuele cellen en poort posities puntgrafieken van inddual cel gegevens van alle beelden voor de siRNA voorwaarden aangegeven: (A) siRB1; (B)-Sinon targeting negatieve controle; (C) siCDK6. Uitgezet tegen de Y-as zijn waarden van nucleaire fluorescentie van anti-P-S780 RB1 kleuring. Uitgezet tegen de X-as de overeenkomstige verhouding waarden berekend uit de GFP-reporter CDK2. De rode en groene balken geven de posities van de poorten van de P-S780 RB1 poort en het GFP-reporter CDK2 poorten, respectievelijk. De twee poorten verdelen de cellen in vier subpopulaties en de nummers op de resulterende kwadranten het percentage aantal cellen van elk van deze. Annotaties rond de assen voor A geven de vier mogelijke label-elementen door de 2_gate_classifier.pl Perl-script toegepast op elke cel. Deze labels worden in verhouding tot hun respectievelijke assay poort en worden in de R-script (analysis.r) te plaatsen in figuren 6, 7 genereren 8. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8: Cel subpopulaties gedefinieerd door de twee G1 transit assays tonen 2N en 4N DNA-profielen in overeenstemming met de test uitkomst De scatter plot van gegevens voor de siCDK6 cellen wordt herhaald uit figuur 7C.. Rondom de scatterplot zijn histogrammen voor geïntegreerde nucleair DNA intensiteit met betrekking tot subsets van de bevolking. Die boven de puntenwolk betrekking op de GFP-reporter assay CDK2. Die aan de rechterkant van de puntenwolk betrekking hebben op nucleaire fosfo-RB1 antilichaam metingen alleen. De gekleurde poort lijnen worden uitgebreid tot hun relatie tot de histogrammen tonen. Poort labels waarmee de cel gegevens werden geselecteerd voor deze extra kavels worden ook getoond. Cellen met een verlies van RB1 gefosforyleerd op serine 780 (P-S780-) of die met een hoge GFP-CDK2 reporter nucleaire om cytoplasma-ratio (met vermelding van laag CDK2 activiteit) tonen overwegend 2N-achtige DNA-profielen, terwijl hun collega tegenhangers voor elke respectieve assay vertonen een verspreiding van 2N en 4N, kenmerkend voor een gemengde, post-G1 fase populatie van cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 9: Samenvatting plots gated assaywaarden voor elke siRNA conditie Samenvatting gegevensplots gated (A) P-S780 RB1 databank (B) GFP-CDK2 gegevens van drievoudige putjes voor elke siRNA knockdown conditie.. Waarden werden berekend uit de ruwe Cell Profiler uitgang (Nuclei.csv) met dePerl scripts, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) of 'G1assay_summary.pl' (B). De uitgezette waarden zijn gemiddelden van het percentage cellen in de poort toegepast op elke assay. Balken geven standaardfouten berekend uit drievoudige putjes. Ongepaarde, homoscedastisch T-Test P-waarden voor elke knock-down conditie in vergelijking met niet-targeting siRNA worden boven de geplotte gegevens getoond waarbij P <0,001 (**) en P <0,05 (*). Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.

Figuur S1. Het opzetten van de Cel Profiler-software voor beeldanalyse. (A) Screenshot van Cell Profiler voordat een beeldanalyse instellingen worden (B) Screenshot van Cell Profiler ingevoerd. Na het algoritme details in '3_channels_pipeline.cppipe' zijn geladen. De hoge aangestoken tab in de linkerbovenhoek geeft aan dat dit scherm toont de parameters voor de 'LoadImages' stadium van de analyse. Te klikken op de andere delen van de lijst onder deze zal de details voor de volgende stappen in de analyse te openbaren. (C) Screenshot van Cell Profiler met de details voor Folder Input en Output Folder ingevoerd. (D) Screenshot van Cell Profiler na de 'Analyze knopafbeeldingen 'is geklikt om de analyse te beginnen. Bovenop zijn drie nieuwe vensters ter illustratie van de algoritmisch geproduceerde maskers gegenereerd door de software van de beelden onder analyse. Deze ramen worden geopend door de 'ogen' pictogrammen om de open positie te klikken naast de betreffende stappen in de analyse, in de linkerbovenhoek van de belangrijkste Cell Profiler venster. Deze inzichten helpen de gebruiker na te gaan of de instellingen van het genereren van de confetti-gekleurde maskers eens met de bijbehorende, originele, greyscale gegevens.

ent "> Figuur S2. Het gebruik van Perl en RStudio naar gate individuele cel gegevens en plot de resulterende cel subpopulaties. (A) De rechter paneel toont de map gekozen om de output CSV-bestanden (groene pictogrammen) ontvangen van de Cell Profiler-analyse. De Perl scripts voorzien van het manuscript (blauwe pictogrammen) worden gekopieerd naar deze map. Opvallende is de '2_gate_classifier.pl' Perl-script, dat dubbelklikt met de muis om het dialoogvenster te produceren in het linkervenster is geweest. Getoond worden de prompts en bijbehorende getypte antwoorden die nodig zijn om de poort van de individuele cel gegevens van de 'Nuclei.csv' bestand. (B) Screenshot van RStudio onmiddellijk na het laden van de 'analysis.R' script. Opvallende zijn de commando's om de gated gegevens van A naar te uploaden de software voor het plotten (noot details lijnen 5 en 6 moeten worden aangepast aan waar de gated gegevens op de computer gebruikt voor analyse). (C) Screenshot van RStudio zodra de gegevens is geüpload. (D) Screenshot van RStudio tonen gewezen op het blok van de code die nodig is om de in het venster rechts onderaan plot te produceren. Codes voor elk perceel worden gescheiden door witregels en gegroepeerd per type plot.

siRNA doel	Plaat goed adressen
Non-targeting (NT)	E5, F5, G5
Retinoblastoom (RB)	E7, F7, G7
Cycline afhankelijke kinase 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tabel 1: Goed adressen en bijbehorende siRNA omstandigheden in het voorbeeld dataset.

Discussion

De beschreven workflow vormt een procedure voor multiwell perturbance cellen met siRNA daaropvolgende merkerdetectie en uiteindelijk gebruik van een reeks softwarematig ondersteunde stappen extractie van kwantitatieve gegevens van de resulterende fluorescentie microscopie beelden vergemakkelijken. De aanpak is gericht op de levering van nucleaire en cytoplasmatische intensiteit waarden voor individuele cellen, die een brede praktische toepassing in veel cellen gebaseerde toepassingen heeft. Het voorbeeld van gegevens die hier gebruikt werd gegenereerd in een siRNA scherm setting waarin twee tl-assays voor G1-fase van de celcyclus transit zijn getest en weer terug naar een meer directe biofysische maatregel van DNA-gehalte nucleaire gecorreleerd.

Het gebruik van een fluorescente DNA kleurstof aan het kern-DNA is een essentiële stap in het beeld segmentatieproces omdat hiermee identificatie van afzonderlijke cellen en de resulterende "Kernen mask 'dient als uitgangspunt overeenkomstige cytoplasmi identificerenC-gebieden. De GFP-gelabeld CDK2 reporter, die stabiel tot expressie wordt gebracht in de cellen, geeft nog een variabele consistent hoger dan achtergrondsignaal in het cytoplasma waarin dit compartiment kan worden afgebakend. Dezelfde analyse pijpleiding moet voor de analyse van eiwit translocatie gebeurtenissen op andere geschikte fluorescentie gebonden reporters en hun reactie op perturbance zijn. Ook substitueren van de GFP-reporter CDK2 met cytoplasma-specifieke fluorescente kleurstoffen zou het alternatief gebruik van deze algoritme om de afmetingen van het cytoplasma en de relatieve afmetingen van de cellen in het beeld te meten.

Een andere overweging bij het ontwerp beeldsegmentatie strategie beschreven is het gebruik van Cell Profiler geïntegreerde intensiteitswaarden voor DNA kwantificatie leveren. Integratie van de intensiteit waarden voor de nucleaire DNA-kleuring gegevens mogelijk te maken voor mogelijke variaties in de kern grootte, en vertegenwoordigt een spannende wedstrijd voor de kwantificering profielen gezienvoor propidiumiodide gebrandschilderde FACS data. Echter, kan geïntegreerde intensiteit geen geschikte middel om eiwitfunctie beoordelen waar de gemiddelde concentratie, geïllustreerd door de gemiddelde intensiteit van de fluorescentie-antigeen, is meer biologisch relevant dan de geïntegreerde totale hoeveelheid eiwit (en bijbehorende fluorescentie) binnen een cel compartiment. Daarom gemiddelde intensiteit waarden werden gebruikt voor de P-S780 RB1 en GFP gegevens. De optie om te veranderen tussen de twee modi (gemiddelde of geïntegreerde) van data evaluatie is te vinden op het paneel 'ExportToSpreadsheet' van de Cell Profiler-software.

De analyse instellingen in het 3_channels_pipeline.cppipe bestand zijn geoptimaliseerd voor de beelden in de set voorbeeld data. Analyse van nieuwe beelden sets met dit protocol vereist dat de bestandsnamen nemen de naamgeving hierboven beschreven (figuur 3). Ook gevoeligheid waarden voor de helderheid van nucleair DNA kleuring en drempels voor achtergrond pastintensiteiten in de nieuwe beeldreeksen moet worden ingesteld binnen het Cell Profiler instellingen. Gegeven de sleutelrol de DNA kleuring geldt voor de bouw van de verschillende beeldsegmentatie maskers, de toepassing van juiste gevoeligheid voor dit kanaal is essentieel voor een succesvolle analyse nieuwe beeldgegevens met de Cell Profiler software. Het dossier Cell Profiler instellingen (3_channels_pipeline.cppipe) bevat aantekeningen over de meest bruikbare parameters voor de aanpassing van de analyse om nieuwe gegevens. Deze notities zijn in het tekstvak aan de bovenkant van het scherm in de Cell Profiler hoofdvenster en bevatten voor het wijzigen van de gevoeligheid en het aanpassen van het aantal kanalen te analyseren. Zoals aangeklaagd in protocol paragraaf 2.8, de instellingen voor de nieuwe beeldgegevens te testen kan het nodig zijn om het beeld segmentatie tijdens beeldanalyse observeren door te klikken openen het 'oog' iconen voor elk van de 'Identificeren ... Objects' protocol stappen (Figuur S1D ). Met name visualisatie van de beeldgegevens via "IdentifyPrimaryOjects 'tonen als de kernen masker correct geïdentificeerd uit beelden van het DNA kleuring. Op de Cell Profiler-software pagina voor module de 'IdentifyPrimaryOjects' is de drempel correctiefactor. Trial and error aanpassing van deze waarde zal de meeste fouten nucleaire erkenning te repareren. De waarden van de balans van de DNA-kanaal tegen de achtergrond intensiteit voor elk beeld. Drempel correctiefactor waarden scharnier rond 1, waar meer dan dit is strenger (goed voor heldere beelden) en minder dan 1 wordt toegeeflijk (geschikt voor afbeeldingen met minder contrast tussen vlekken en achtergrond).

De ruwe uitvoer van individuele cel gegevens Cell Profiler kunnen worden geanalyseerd op verschillende manieren aan de behoeften van andere studies passen. Afgebeeld is het gebruik van een Perl-script om gates toepassing op twee van de gemeten parameters per cel om te helpen extraheren biologische trends uit de gegevens eend vergunning kruisverwijzingen van de geïdentificeerde subpopulaties met aanvullende metingen. Hoewel het ook mogelijk om elementen van gating omvatten in het kader van Cell Profiler, de alternatieve route hier gebruikte grotere flexibiliteit en snelheid, vooral als grote datasets moeten worden beoordeeld. De langzaamste etappe in de post-afbeelding overname fasen van het huidige protocol is het verloop van de Cell Profiler-software. Cel profiler hier wordt gerund zonder dat poorten naar een-un gated reeks ruw gegevens die sneller kunnen worden opnieuw geanalyseerd met de volgende Perl-script te produceren en, indien nodig, iteratief met verschillende poort waarden. Niet alle studies zullen van tevoren weten de geschikte poort waarden omdat dit kan variëren met de reagentia op een bepaalde set van gegevens, en mogelijk in de tijd. Het is daarom aan te raden om histogrammen beeltenis van de ruwe data distributie verkregen van Cell Profiler voor positieve controles en mock-verstoorde cellen te genereren om geschikte poort waardevolle identificerenes voor de parameters van belang.

De Perl scripts zijn geschreven om een ​​strikt gedefinieerde kolom structuur van de gegevens van de Cel Profiler te accepteren en kan stoppen met werken als een gebruiker het aantal parameters uitgang door Cell Profiler met de instellingen van de 'ExportToSpreadsheet' wijzigt. Te helpen uitvoeren wijziging van de instellingen noten worden opgenomen in de Perl-script-bestanden. Om te zien deze te bekijken het script in een teksteditor, bij voorkeur teksteditor voor programmeurs ingesteld op kleurcode Perl-elementen (bijv http://www.activestate.com/komodo-edit). Deze notities geven waar het script aan te passen aan te passen aan veranderingen in data-formaat. Vergelijkbaar met de Perl-scripts, de R-code bestand geleverd (analysis.r), met daarin de instructies voor het plotten van de cijfers van de beeldanalyse gegevens kan worden gelezen in een teksteditor of RStudio software om extra toelichting op het gebruik en de aanpassing te zien. Deze notities kunnen worden aangevuld met informatie over reguliere expressies en Perl ^{12 en het pakket ggplot2 13 voor R, die beide vormen de basis van de data wordt gelezen, geannoteerd en uitgezet, respectievelijk.}

Nieuwe studies met fluorescentiemicroscopie als ruwe gegevens gedeponeerd met open source publicaties vatbaar analysemethoden zoals hier beschreven. De aard van high content data leent zich recursieve analyse met verschillende analytische accenten afhankelijk van de interesses van een bepaalde waarnemer. Ofschoon de vragen die de gebruiker aan de gegevens worden beperkt door de sondes oorspronkelijk gebruikt, beeldgegevens kunnen vaak zinvol reanalyzed buiten het kader van de onderzoeken die hen gegenereerd.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars negative control siRNA	Qiagen	1027280	Negatieve controle siRNA.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequentie: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequentie: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x siRNA buffer	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	Te verdunnen met nuclease-vrije, niet-DEPC behandeld water.
Nuclease-vrij water (niet-DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	Voor verdunning van siRNA buffer.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfectie lipide.
DMEM	Life Technologies	41966052	Met pyruvaat en hoog-glucose aangevuld weefselkweekmedium.
96 well weefselkweekplaat	Falcon	3072	Vlakke, 96 well weefselkweekplaat voor het parallelle, gecompartimenteerde mengen van transfectiecomplexen.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96 well TC plaat met optische basis waarop cellen worden getransfecteerd, gekweekt, gefixeerd en uiteindelijk geïmaged. Geleverd met ondoorzichtige, zelfklevende plaatverbindingen, die worden gebruikt tijdens het opslaan van gebruikte platen.
Ademende membraan	Alpha Labs	LW2783	Steriele, gas-doorlaatbare, zelfklevende membraan.
Neutraal gebufferd formaline, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formaline (4% formaldehyde) fixatief gebruikt in zuivere vorm in protocol.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Niet-ionogene detergent
[header]
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethaan)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Voor plaatwasoplossing.
Anti-P-S780 RB1 antilichaam	Abcam	ab32513	Konijnen monoklonaal
AlexaFluor647 Anti-konijn	Invitrogen	A21245	Hoogwaardig gekruisadsorbeerd, fluorescent gelabeld secundair antilichaam.
Hoechst 33342 (Bisbenzimide)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescent, chromatine-intercaleerende, DNA kleurstof.
Permeabilisatieoplossing	NA	NA	0,1% Triton X-100 in 50 mM Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 8,0.
Plaatwasoplossing	NA	NA	Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20.
Blokoplossing	NA	NA	5% poedervormig melk in Tris-gebufferde zoutoplossing en 0,1% Tween-20. Voor het blokkeren van plaat voorafgaand aan immunokleuring en verdunning van antilichamen.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R programmeeromgeving	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/