Generatie van transgene Hydra Door Embryo Microinjection

Samenvatting

Stabel transgenetische Hydra worden gemaakt door micro-injectie van plasmide DNA in embryo's, gevolgd door willekeurige genomische integratie en aseksuele voortplanting om een uniforme lijn te vestigen. Transgenetische Hydra worden gebruikt om celbewegingen te volgen, genen overexpresseren, promotorfunctie te bestuderen, of genexpressie te onderdrukken met behulp van RNAi.

Samenvatting

Als lid van het fylum Cnidaria, de zustergroep van alle bilaterians, kan Hydra licht werpen op fundamentele biologische processen die gedeeld worden door meercellige dieren. Hydra wordt gebruikt als een model voor de studie van regeneratie, patroonvorming en stamcellen. Echter, onderzoeksinspanningen zijn gehinderd door een gebrek aan een betrouwbare methode voor genperturbaties om moleculaire functies te bestuderen. De ontwikkeling van transgene methoden heeft de studie van Hydra biologie nieuw leven ingeblazen¹. Transgene Hydra maken het mogelijk om levende cellen te volgen, te sorteren om pure celpopulaties te verkrijgen voor biochemische analyse, manipulatie van genfunctie door knockdown en overexpressie, en analyse van promotorfunctie. Plasmide-DNA geïnjecteerd in embryo's in een vroeg stadium integreert willekeurig in het genoom vroeg in de ontwikkeling. Dit resulteert in jongen die transgenen expresseren in stukken weefsel in een of meer van de drie lijnen (ectodermale epitheel, endodermale epitheel of interstitieel). Het succespercentage van het verkrijgen van een jong met transgeen weefsel is tussen de 10% en 20%. Aseksuele vermeerdering van de transgene jong wordt gebruikt om een uniform transgene lijn in een bepaalde lijn te vestigen. Het genereren van transgene Hydra is verrassend eenvoudig en robuust, en hier beschrijven we een protocol dat gemakkelijk kan worden geïmplementeerd tegen lage kosten.

Inleiding

Hydra is gebruikt voor regeneratie, patroonvorming bestuderen en stamcellen ongeveer 250 jaar ² Hydra een eenvoudige body opgesteld met drie cellijnen. Ectodermale epitheel, endodermale epitheliale en interstitiële. Het buisvormige lichaam wordt gevormd door de ectodermale en endodermale epitheliale lijnen, die elk een enkele cellaag. Alle epitheliale cellen in de kolom lichaam mitotische. Wanneer epitheelcellen verplaatst naar de uiteinden ^3, de kop (mond en tentakels) aan het einde orale of voet (basale schijven) op aboral zij daartoe arresteren in de G2 fase van de celcyclus en veranderen lot van de cel ^4. De cellen van het interstitiële lineage verblijf op de tussenruimten tussen de epitheelcellen. Deze lijn wordt ondersteund door multipotente stamcellen die zich in het ectodermale epitheliale laag van het lichaam kolom ^5. De interstitiële stamcellen leiden tot drie somatische cell types (zenuwen, klier cellen, en nematocytes) en de kiemcellen ^6,7.

Als lid van de phylum Cnidaria, de zuster groep om alle bilateria, Hydra kan licht werpen op fundamentele biologische processen verdeeld onder meercellige dieren. Tot voor kort werden deze pogingen belemmerd door het gebrek aan betrouwbare methoden voor de verstoring van de genfunctie. Echter, met de ontwikkeling van transgene methodologie ^1, we zijn nu in staat om optimaal te profiteren van Hydra tot een beter begrip van de fundamentele mechanismen gebruikelijk om meercellige dieren, zoals stamcel functie, regeneratie, en patroonvorming krijgen. Hydra Transgene lijnen worden vastgesteld door injectie van plasmide DNA in embryo, wat resulteert in willekeurige integratie en chimere expressie in een aanzienlijke frequentie van jongen. Een lijn uniforme expressie in een bepaalde lijn kan worden vastgesteld door ongeslachtelijke voortplanting. Het vermogen om klonale vermeerderen transgenic Hydra lijnen is een voordeel boven de meeste diermodellen, die kan worden vermeerderd alleen geslachtelijke voortplanting. Bovendien kunnen transgene cellen gemakkelijk in vivo worden gevolgd door de transparantie van het dier en de afwezigheid van endogene fluorescerende eiwitten ^8.

In de zeven jaar sinds de eerste transgene Hydra lijnen werden ^1, dergelijke lijnen zijn gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen. Expressie van proteïnen verschillende celtypen is het mogelijk om celbeweging te volgen, veranderingen in celvorm waarnemen en volgen celtypes zowel wildtype omstandigheden en na chemische verstoring ^1,5,9-12. Bovendien expressie van verschillende proteïnen de diverse lineages maakt FACS isolatie van specifieke celpopulaties. Deze techniek is gebruikt voor het sequencen van stamcellen specifiek mRNA en afstammings-specifieke RNA's ^13,14. Terwijl de promotor vaneen van de twee Hydra actinegenen is meest gebruikt, enkele celtype specifieke promotors geïdentificeerd en gebruikt om expressie van GFP rijden transgene Hydra ^9,11,15,16. In de toekomst zal celtype specifieke promotors zorgen voor waarneming en verzameling van specifieke celtype. Bovendien werd een transgene benadering succes gebruikt om de cis-werkende regulerende elementen van de promoter Wnt3 ¹⁷ definiëren.

De ontwikkeling van transgene werkwijzen Hydra biedt een robuuste benadering voor het testen van de functie van genen door ectopische expressie, overexpressie en knockdown. Transgene dieren gemaakt die fluorescent-gemerkte eiwitten tot expressie teneinde zowel de functie en cellulaire lokalisatie ^18-20 onderzocht. Daarnaast is de expressie van RNA haarspelden in de 3'UTR van een GFP-transgen leidt tot knockdown van doelgenen ^21,22. In deze benaderingen GFP moet identificerenen volgen de transgene weefsel tijdens de creatie van de transgene lijn. Het is echter waarschijnlijk dat in sommige gevallen de GFP molecuul zou interfereren met de functie van het gecodeerde eiwit. Een recente studie toont aan dat Hydra genen kan worden geregeld in een operon configuratie, dwz polycistronische transcripten gemaakt, die vervolgens worden gescheiden door trans-spliced ​​leader toevoeging afzonderlijk ²³ vertaald. Door een gen dat codeert voor een eiwit of een RNA haarspeld in de stroomopwaartse positie van een operon en een fluorescent eiwit gen in de stroomafwaartse positie, kan een transgeen weefsel te volgen zonder het gen dat voor het eiwit of RNA haarspeld taggen. Deze werkwijze is gebruikt om een RNA haarspeld in een operon configuratie met DsRed2 drukken om te komen gen knockdown ^14.

Protocol

1 Voorbereiding van plasmide DNA, naalden en injectie Gerechten

1. Bereid het plasmide-DNA met behulp van een High Speed ​​Maxi of Midi kit en concentreer het DNA tot 2,5 mg / ml met ethanol precipitatie. De DNA pellet moet worden opgelost in nuclease-vrij gedeïoniseerd water. Bewaar het DNA in 10-20 pi aliquots bij -20 ° C. (Zie Aanvullende tabel 1 voor een overzicht van beschikbare vectoren)
2. Een injectie schotel middels agarose een trog construeren voor het vasthouden van embryo's in een 100 x 15 mm petrischaal.
   1. Plaats een 75 x 50 glazen microscoop dia in een 100 x 15 mm petrischaal in een hoek. Giet ongeveer 50 ml van 2% agarose gesmolten in Hydra medium ²⁴ in de petrischaal. Als alternatief, giet de agarose in de schaal eerst en drijven een "Micro-injectie Fish Mold" bovenop.
   2. Nadat de agarose is gestold, verwijder het glaasje of de mal. Als een glasplaatje werd gebruikt, te snijden overtollige agarose weg met een scheermes blade aan een wand te vormen. Giet Hydra medium in de schotel en onmiddellijk te gebruiken of op te slaan bij 4 ° C totdat het nodig is. Opmerking: Injectie gerechten worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C tussen toepassingen.
3. Trek naalden van borosilicaatglas capillairen met een filament op de micropipet trekker met de volgende voorwaarden: verwarmen 525, trek 75, snelheid 100 keer 50 WINKEL de naalden door ze in een smalle strook klei persen in een petrischaal zodat zij die evenwijdig aan de bodem van de schaal.
4. Aan de injectie-oplossing bereiden combineren 3 pi 2,5 mg / ml plasmide-DNA-oplossing met 2 ui 10% fenolrood. Vortex de oplossing kort draai vervolgens gedurende 10 minuten bij maximale snelheid in een microcentrifuge om eventuele deeltjes die de naald kunnen verstoppen.
5. Onder een dissectiemicroscoop klem de naald enkele millimeters van de tip met een tang om een ​​kleine opening te creëren. Opmerking: Er is enige flexibiliteit in de juiste grootte van de opening omdat de druk kan worden aangepast in stap 3.3 deze variatie tegemoet.
6. Plaats de petrischaal zodat houdt de naald in een verticale stand met de punt naar beneden. Plaats de naald met ongeveer 0,5 pi injectie-oplossing door pipetteren vloeistof in het achtereinde van de naald. Laat capillaire werking om de oplossing te trekken naar de punt van de naald.

2 Voorbereiding van embryo's voor Injectie

1. Op een dagelijkse basis te scannen de Hydra AEP stam cultuur voor poliepen produceren van eieren. Verzamel deze poliepen en leg ze opzij in een aparte cultuur schotel. Neem deze poliepen om de paar uur gedurende de dag om de voortgang van de vorming van ei bewaken. Wanneer eieren breken door het ectoderm en zitten op een ring van ingetrokken ectodermale cellen zijn ze klaar voor injectie ^25. Plaats deze poliepen in een schotel met verschillende Hydra die testes hebben voor ten minste 1 uur voor injectie op voor de bevruchting. Hydra </ Em> mannetjes zaadcellen vrijkomen zonder speciale manipulatie.
2. Als vrouwtjes in de AEP kolonie volledig gevormde eieren, die ongeveer 400 micrometer in diameter ^25, of 1 tot 8-cellig stadium embryo's, verzamelen ook deze voor injectie. Direct injecteren embryo's die klieven begonnen. Opmerking: Het is niet mogelijk om het verschil tussen de volledig gevormde eieren en eencellige zygoten zeggen, waardoor deze worden geïncubeerd bij mannen vóór injectie.
3. Vóór injectie, is het grootste deel van de ouderlijke weefsel boven en onder het embryo met een scalpel met een # 15 blad. Laat alleen embryo met een klein stukje body kolom gehecht te worden gebruikt om de embryo manipuleren tang indien nodig. Opmerking: Het weefsel dat uit de buurt van het embryo wordt ontleed zal regenereren en moet worden opgeslagen om ervoor te zorgen dat de vrouwen blijven in de Hydra kolonie.
4. Met behulp van een Pasteur pipet, verplaats's naar de injectie schotel, regelen parallel aan de wand van deagarose trog.

3 Micro-injectie van plasmide DNA

1. Monteer de microinjector op een magnetische standaard die zit op een ijzeren plaat. Monteer de injectie houder, dat is het deel van de microinjector dat de naald heeft, op een joystick micromanipulator. Monteer de joystick manipulator aan de ijzeren plaat, met een magnetische voet. Plaats deze gehele set-up op de rechterkant van een dissectie microscoop en plaats de injectie houder zodat het zichtbaar is in het waarnemingsveld.
2. Zet de injectie schotel met embryo's onder de dissectiemicroscoop georiënteerd dat de verticale wand van de goot agarose naar links. Steek de naald in de injectiespuit houder en laat de punt van de naald in de Hydra medium in de schaal.
3. Draai langzaam de knop van de spuit met de klok mee tot minerale olie vult de top van de naald en een gestage stroom injectieoplossing waargenomen verlaten van de naald in de Hydreen medium. Als de stroom te sterk is, hoe lager de druk door naar links te draaien aan de knop. Oefen deze stap om een geschikte druk, die afhankelijk van de grootte van de naald opening (dat wil zeggen hoe de naald werd geknipt in stap 1.5) routinematig te verkrijgen. Opmerking: Als de stroom te sterk is, zal het embryo niet de injectie overleven.
4. Tijdens het bekijken door de microscoop ontleden, verplaatst u de injectie gerecht zodat de eerste embryo zich in het midden van het veld. Verplaats de naald zodat raakt dat embryo. Gebruik de micromanipulator om het embryo met de naald prikken. Opmerking: de verticale wand van de agarose trog zal het embryo te houden van wordt verdrongen door de naald.
5. Laat de injectie-oplossing te stromen in het embryo 1 of 2 sec en dan snel te verwijderen van de naald. Als de embryo meerdere cellen, injecteren elke cel afzonderlijk. Tang om de embryo heroriënteren naar de volgende cel lijn met de punt van de naald.
6. Na de eerste embryo wordt geïnjecteerd, bewegen de schotel, zodat de volgende embryo is in de injectie en herhaal de procedure; doorgaan totdat alle embryo's geïnjecteerd.

4 kweken en broedeieren van embryo's

1. Verplaats alle geïnjecteerde embryo's in een schotel met een paar Hydra die testikels (dit is dat alle embryo bevrucht). Incubeer de embryo's in een 18 ° C incubator, terwijl ze blijven embryogenese.
2. Zodra de cuticula stadium is bereikt, beweegt elke geïnjecteerde embryo een individuele well van een 24-wells plaat vol Hydra medium.
3. Incubeer de geïnjecteerde embryo's gedurende 2 weken in het donker bij 18 ° C.
4. Na de 2 weken incubatietijd, controleer elke geïnjecteerde embryo onder de stereomicroscoop. Noteer alle gevallen waarin de cuticula-stadium embryo losgemaakt van het stukje ouderlijke weefsel en het oorspronkelijke weefsel geregenereerd. Verwijder deze geregenereerd poliep onmiddellijk zodat het niet mistaken voor een nieuwe hatchling.
5. Verplaats de schotel van de geïnjecteerde embryo's onder een aquarium licht bij RT. Controleer de platen elke dag en verzamel jongen. Nieuwe jongen zal wit zijn, omdat de typische roze kleur van Hydra poliepen afkomstig van de Artemia ze eten.
6. Let op de jongen onder een fluorescentiemicroscoop om transgene expressie te detecteren.

Resultaten

Oprichting van transgene Hydra lijnen

Feed transgene jongen om de 2-3 dagen met Artemia naupliën. Hatchlings soms niet eten voor een dag of twee na het uitkomen. Sommige nieuwe jongen zal nooit eten, en dus zal het niet overleven. Als het jong is transgene in ofwel de ectodermale (Figuur 1A) of endodermaal epitheelweefsel, zodat het dier uit te lopen en het verzamelen van de knoppen die de meeste transgene weefsel (Figuur 1B, C) ​​te hebben. D...

Discussie

Hydra reproduceert routinematig ongeslachtelijk, maar vereist prikkels uit de omgeving naar de productie van gameten beginnen. Deze stimuli zijn niet goed gedefinieerd voor de meeste Hydra soorten en kunnen van stam tot stam. Een belangrijke hindernis voor de productie van transgene Hydra is het verkrijgen van embryo's regelmatig omdat het moeilijk in een laboratoriumomgeving te induceren Hydra seksuele thuis hoort. De AEP stam ²⁵ echter produceert gameten gemakkelijk i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano op celina.juliano@yale.edu of Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1,0 mm, I.D.: 0,50 mm, 10 cm lengte
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151