High-throughput Titratie van Luciferase-expressie Recombinant virussen

Samenvatting

Dit artikel presenteert een methode op basis van luciferase-expressie met hoge doorvoer voor het titreren van verschillende RNA- en DNA-virussen met behulp van geautomatiseerde en handmatige vloeistofbewogen.

Samenvatting

Standaard plaque-assays om infectieuze virale titers te bepalen, kunnen tijdrovend zijn, zijn niet geschikt voor een groot volume aan monsters en kunnen niet worden uitgevoerd met virussen die geen plaques vormen. Als alternatief voor plaque-assays hebben we een hoogdoorvoermethode voor titratie ontwikkeld die het mogelijk maakt om in één dag een groot volume aan monsters tegelijkertijd te titratie. Deze aanpak omvat infectie van de monsters met een Firefly luciferase-gelabeld virus, overdracht van de geïnfecteerde monsters naar een geschikte permissieve cellijn, daaropvolgende toevoeging van luciferine, lezen van platen om luminescentiemetingen te verkrijgen, en tenslotte de omrekening van luminescentie naar virale titers. De beoordeling van cytotoxiciteit met behulp van een metabolische levensvatbaarheidskleurstof kan eenvoudig parallel in de workflow worden opgenomen en geeft waardevolle informatie in de context van een geneesmiddelenscreening. Deze techniek biedt een betrouwbare, hoogdoorvoermethode om virale titers te bepalen als alternatief voor een standaard plaque-assay.

Inleiding

Klassieke virale plaque-assays blijven een steunpilaar in virusonderzoek, ook al kunnen ze berucht tijdrovend zijn en vormen een belangrijke bottleneck bij het verkrijgen van resultaten uit experimenten. Snellere indirecte methoden voor viruskwantificering zijn opgekomen, waaronder kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), ELISA en flowcytometrie^1-4. Recente innovaties zoals de Virocyt-virusteller kunnen direct virussen tellen met behulp van geavanceerde flow-sorteringstechnologie en een combinatie van eiwit- en DNA/RNA-kleurstoffen⁵. Hoewel al deze methoden ongetwijfeld het tempo van virusonderzoek hebben versneld, heeft elke methode zijn voor- en nadelen. Zo kan qPCR de kwantificering van specifieke virale genoomsequenties mogelijk maken, maar kan het niet effectief onderscheid maken tussen besmettelijke en defecte virionen⁶. ELISA's kunnen zeer specifiek zijn, maar vereisen een geschikt antilichaam tegen het gewenste doelwitvirale eiwit en kunnen erg duur zijn. Hoewel flowcytometrietechnologie vele voordelen biedt en aanzienlijk is verbeterd, blijven doorvoer en toegang tot zeer gespecialiseerde apparatuur een hindernis. Belangrijk is dat al deze technieken niet ideaal geschikt zijn voor high-throughput screening, waarbij de gemak en tijdsvereiste van de viruskwantificeringsstap van kritiek belang is.

Hier beschrijven we een high-throughput en gemakkelijk te automatiseren techniek om virussen te titraten die een Firefly luciferase (Fluc) transgeen tot expressie brengen. Deze methode genereert benaderd virale titers in een testmonster op basis van luminescentie signaallezingen door de parallelle gebruik van een standaardcurve van bekende hoeveelheden virus. monsters die onbekende hoeveelheden luciferase-expresserend virus bevatten, worden overgebracht naar een permissieve "plaquing"-cellijn parallel met de standaard virusverdunningscurve en virus-geassocieerde luminescentie wordt gelezen na een paar uur incubatietijd. Dit maakt snelle, kwantitatieve, vaak op dezelfde dag resultaten mogelijk, in tegenstelling tot klassieke plaque-assay protocollen die doorgaans enkele dagen incubatie vereisen om zichtbare plaques handmatig te tellen^7-9.

Het protocol schetst de stappen van onze titratiemethode met behulp van oncolytisch Vesicular Stomatitis Virus dat een Fluc transgeen codeert (VSVΔ51-Fluc) als voorbeeld en geeft een overzicht van 1. Voorbereiding van het monster 2. Het plateren van een permissieve cellijn voor virustitratie met behulp van een geautomatiseerde dispenser 3. De voorbereiding van de virale standaardcurve 4. De overdracht van de monstersupernatants naar de permissieve cellijn met behulp van een 96-well handmatige pipetteerder 5. De beoordeling van monsterscytotoxiciteit met behulp van een celviabiliteitsreagens 6. De voorbereiding van het luciferine substraat 7. Lezen van bioluminescentie en 8. Data-analyse.

Protocol

1 Monstervoorbereiding

1. Verkrijgen monsters die luciferase-expressie virus (hierin VSVΔ51-Fluc als voorbeeld) voor titratie en overbrengen in 96-well platen. Anders, infecties in 96-putjes weefselkweekplaten en gebruik supernatanten direct uitvoeren.
2. Laat twee kolommen onbehandeld voor het opnemen van standaard curves. Voor experimenten direct uitgevoerd in 96-well platen, titer aan het einde van het experiment (40 uur na infectie) of bewaar bij -80 ° C en titer later.

2 Voorbereiding van Tolerante Cellen voor virustitratie

1. 24 uur vóór titering Bereid een suspensie van Vero-cellen bij een concentratie van 2,5 x 10 ⁵ cellen / ml in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum (FBS), 30 mM HEPES en 1% penicilline / streptomycine. OPMERKING: Hoewel dit protocol maakt gebruik van Vero-cellen, elk geschikt tolerante cellijn voor VSV infectie kan be gebruikt.
2. Seed 2,5 x 10 ⁴ cellen (100 ui) in 96-well witte vaste stof platte bodemplaten met een microplaat dispenser.
   1. Bereid 12 ml celsuspensie per plaat plus 5 ml voor priming.
   2. Schoon microplaat dispenser cassette door spoelen van de buis met 50 ml steriel water.
   3. Vul de microplaat dispenserlijnen met celsuspensie en laat 5 ml celsuspensie doorstromen.
   4. Selecteer een programma dat 100 gl zal afzien in elk putje van een witte wanden 96-well plaat. Afzien, en indien nodig herhalen voor extra borden. Ook zaad enkele putjes in een 96-well duidelijke platte bodemplaat als opaak-witte bottom wand platen worden gebruikt voor verificatie van de gezondheid van de cellen en dichtheid.
   5. Wanneer u klaar bent, spoel cellen terug in de oorspronkelijke verpakking. Reinig de cassette door het uitvoeren 50 ml 70% ethanol gevolgd door 50 ml warm steriel water door de buis.
   6. Zorg ervoor dat de cassette en slangen zijn appropriately gereinigd tussen toepassingen.
3. Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 incubator.

3 Voorbereiding van Viral Standard Curve

1. Bereid een standaard kromme van VSVΔ51-Fluc in serumvrij DMEM zodanig dat de eindconcentratie van plaque vormende eenheden (pfu) per ml na overdracht op Vero-cellen is als volgt: 10 ⁸ pfu / ml, 10 ⁷ pfu / ml, 10 ⁶ pfu / ml, 10 ⁵ pfu / ml, ⁴ 10 pfu / ml, 10 ³ pfu / ml, 10 ² pfu / ml en 10 ¹ pfu / ml. Bereid 50 pi van elke concentratie per plaat van Vero-cellen en een extra 10%.
   OPMERKING: Titer van de luciferase virus voorraad moeten worden beoordeeld op een klassieke manier ¹⁰ om een standaard curve die zal zorgen voor absolute kwantificatie genereren. Anders relatieve kwantificatie mogelijk zonder nauwkeurige titer informatie willekeurig instellen virale titer gebaseerdverdunning stappen. Bijvoorbeeld de eerste verdunning van de standaard curve kan worden ingesteld op 10 ⁸ virale eenheden en de volgende 1/10 verdunning tot 10 ⁷ enzovoort. In deze context moet men waarden als fold-verandering ten opzichte van een vooraf bepaald monster als absolute kwantificering niet nauwkeurig uit te drukken.

4 Overdracht van Sample Supernatants op Tolerante Cellen

1. Controleer Vero-cellen uitgeplaat in de heldere bodem 96-well plaat onder een lichtmicroscoop te bevestigen dat monolagen ten minste 95% confluent.
2. Transfer 25 ul monster supernatant op Vero-cellen gezaaid in witte wanden platen. Niet supernatanten over in de kolommen 2 aangewezen standaard curves. Opmerking: Dit kan gelijktijdig plaats voor alle putjes op een enkele plaat met een 96-kanaals vloeistofmanipulator.
3. Met een 8 of 12-kanaals Meerkanaalspipet Voeg 25 ul van elke verdunning van de standaardkromme bereid in Stap 3, de Vero-cellen inde 2 aangewezen kolommen.
4. Centrifugeer platen gedurende 5 min bij 430 x g bij kamertemperatuur.
5. Incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 incubator.

5 Beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen

1. OPMERKING: Bij het starten van supernatanten verkregen uit infectie experimenten gedaan in heldere 96-well platen kunnen levensvatbaar monster voor kwantificatie met cellevensvatbaarheid indicatorkleurstof worden beoordeeld zoals Resazurin.
2. Voeg Resazurin in een hoeveelheid gelijk aan 10% van het volume in elk putje van de 96-well plaat of monsters met virus en cellen. Omvatten cel alleen, als aan-only media controle grenswaarden voor 100% en 0% levensvatbaarheid respectievelijk bepalen.
3. Na 2-4 uur (incubatietijd afhankelijk van het celtype en van de concentratie van commercieel verkrijgbaar of gereconstitueerde poeder van de kleurstof), gelezen en registreer het signaal met behulp van een fluorescentie plaatlezer (530-560 excitatie, 590 emissie). Verslag cel viability een monster volgens de formule relatieve metabole activiteit = ((Monsterhoeveelheid signaal - negatieve controle signaal) / (Cell enkel stuursignaal - negatieve controle signaal)) x 100%

6 Voorbereiding van de Luciferine Ondergrond

1. 30 min vóór het einde van de 5 uur incubatie, bereid de luciferine een 2 mg / ml oplossing in steriele met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) te verkrijgen. Bereid 2,5 ml per plaat plus een extra 2 ml. Bescherm oplossing tegen licht. OPMERKING: De luciferine kan ook eerder op de dag worden bereid en bewaard bij 4 ° C tot gebruik.

7 Reading Bioluminescence

1. Na 5 uur incubatieperiode voeg 25 pl luciferine aan elk putje van Vero-cellen in de witte vaste platen. Luciferine Voeg handmatig of met een geautomatiseerd dispenser geïntegreerd in de luminometer. Opmerking: het gebruik van een instrument met slechts enkele en eindpunt leest kunnen de toevoeging van een luciferase compatibele lysis buf vereisenfer vóór toevoegen van het substraat luciferine consistentie verbeteren.
2. Lees de platen met de volgende parameters:
   1. Schud gedurende 5 sec.
   2. Wacht 30 sec.
   3. Lees luminescentie op een geschikte vaste waarde gevoeligheid / blootstelling. Als de optie is beschikbaar op het instrument te gebruiken multi-point leest (bijvoorbeeld 3 x 3 matrix) om de nauwkeurigheid te verbeteren.
3. Opnemen en opslaan van de gekwantificeerd bioluminescentie intensiteit.
4. Als een geautomatiseerde dispenser werd gebruikt om toe te voegen luciferin zuiveren de luciferin en prime de lijnen met warm steriel water.

8 Data Analysis

1. Voor nauwkeurige resultaten, lossen de niet-lineaire regressie om een ​​Heuvel vergelijking van de standaard curves genereren. Breng deze vergelijking om de monsters getitreerd virale expressie-eenheden berekenen. Sommige virussen of situaties kan een standaardcurve met een lineair verband te produceren; in dit geval lossen voor een lineaire vergelijking.

Resultaten

Samenvatting van de werkstroom waarin de high-throughput werkwijze is geïllustreerd in figuur 1. Figuur 2 toont de resultaten van een typische standaardcurve ofVSVΔ51-Fluc. Vier-parameter niet-lineaire regressieanalyse gegenereerd een Heuvel plot van onbekende invoer pfu (schatting van virale titer) worden geïnterpoleerd. Deze geschatte titers worden genoemd virale expressie-eenheden (VEU). Figuur 3A toont VEUs en titers verkregen door het uitvoeren van een standaard plaque assay met dezelfde monsters ^10. Monsters afkomstig van een experiment waarbij verschillende chemicaliën werden gebruikt om de replicatie te verbeteren en de verspreiding van VSVΔ51-Fluc in 786-0 cellen. VEUs geïnterpoleerd uit de standaard curve moet worden vermenigvuldigd met een factor die is gebaseerd op de verdunning van monster supernatanten worden overgebracht naar Vero-cellen (in dit geval, is de verdunningsfactor 5). De lineaire correlatie tussen de titers en VEU wordt getoond in figuur 3B Met een ^R2 van 0,8083 en een Pearson's r score van 0.899 (p <0,0001). In figuur 4, typisch celcytotoxiciteit gegevens van een metabolische bepaling getoond voor 786-0 cellen behandeld met chemicaliën vóór infectie met VSVΔ51-Fluc. Tenslotte Figuur 5 toont typische standaard curves verkregen met diverse virussen (Herpes Simplex Virus (HSV), vacciniavirus en adeno-geassocieerd virus (AAV), alle expressie Firefly luciferase) en beschrijft incubatietijden en vries-dooi cycli, zoals vereist.

Figuur 1 Workflow van high-throughput virus titering en cytotoxiciteit assay met VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 ⁴ Vero-cellen per putje (100 pl) en incubeer bij 37 ° C. (B) 24hr latere overbrenging 25 gl standaardcurve op Vero-cellen (2 kolommen per plaat). (C) Breng 25 pl monsters worden getitreerd op Vero-cellen blijven. Centrifuge platen en incubeer bij 37 ° C. (D) In een bedrag gelijk aan 10% van het volume in het goed, voeg resazurin reagens om de plaat met de originele samples. Incubeer de platen bij 37 ° C. (E) na 3 uur, leest en schrijft fluorescentie en beoordelen cytotoxiciteit. (F) na 5 uur, voeg 25 ul van 2 mg / ml oplossing van luciferine aan elk putje van Vero-cellen. Lees luminescentie en bereken Viral Expression Units.

Figuur 2 Verwachte standaard curve van VSV Δ 51-Fluc. Luciférase uitdrukking was measured 5 uur overdracht bericht supernatant op vijf verschillende punten in een goed gebruik van een lichtmeter en bioluminescentie werd uitgedrukt in gemiddelde relatieve licht (RLU). De gemiddelde RLU werd uitgezet tegen bekende invoer pfu / ml aan de niet-lineaire regressie lossen en genereren Hill vergelijking. Het gemiddelde van twee repliceren bochten en standaard error bars worden getoond (r ² = 0,9993).

Figuur 3 Vergelijking van standaard plaque assay met titers die verkregen door high-throughput-methode. (A) Virale titers in pfu / ml verkregen door standaard plaque assay op Vero-cellen vergeleken met de berekende virale titers (VEU / ml) van dezelfde monsters getitreerd met de high-throughput luciferase assay. (B) lineair verband tussen VEU / ml en titer verkregen via standaard plaque assay. Lineaire regressie-curve en de determinatiecoëfficiënt ^(R2) getoond.

Figuur 4 Voorbeeld levensvatbaarheid. Levensvatbaar monster voor overdracht supernatant op Vero-cellen werd bepaald door het bepalen van cellulaire metabolische activiteit met een commercieel verkrijgbare Resazurin oplossing. Raw fluorescentiewaarden werden genormaliseerd aan die van onbehandelde, geïnfecteerde putjes.

Figuur 5 Verwachte standaardcurven met HSV, Vaccinia- en AAV virussen. Luciférase expressie werd gemeten op vijf verschillende punten in een goed gebruik van een lichtmeter en bioluminescentie werd uitgedrukt in gemiddelde relatieve lichteenheden (RLU). (A) HSV standaardcurve werd toegevoegd aan Vero-cellen uitgeplaat 24 uur eerder bij een dichtheid van 2,5 x 10 ⁴ cellen per putje (100 pl) en luciferase meting werd 17 h na supernantant overdracht ^(R2 = 0,9489, n = 1). Een Hill vergelijking werd gegenereerd door het oplossen van de niet-lineaire regressie. (B) Vaccinia standaardcurve werd toegevoegd aan Vero-cellen uitgeplaat 24 uur eerder een dichtheid van 2,5 x 10 ⁴ cellen per putje (100 pl) en gedurende 2,5 uur bij 37 ° C, waarna luciferase metingen werden uitgevoerd ^(R2 = 0,9892). Een lineaire vergelijking werd gegenereerd door het oplossen van de lineaire regressie. (C) AAV standaardcurve werd toegevoegd aan humane longcarcinoom cellen (A549) uitgeplaat 24 uur eerder bij een dichtheid van 2,5 x 10 ⁴ cellen per putje (100 pl) en luciferase meting werd 24 uur na infectie. Een Hill vergelijking werd gegenereerd door het oplossen van de niet-lineaire regressie. De gemiddeldevan vijf repliceren bochten en standaard error bars worden getoond ^(R2 = 0,9926).

Discussie

De luciferase-gebaseerde strategie beschreven is, een aantal voordelen boven andere bestaande werkwijzen waaronder het eenvoudige, snelheid, minimale uitrusting nodig en relatief lage kosten. Een belangrijke bijdrage aan deze is het vermijden van een seriële verdunning stap. Toch seriële verdunning gebaseerde derivaten van dit protocol zijn zeker haalbaar en werden onlangs gebruikt om luciferase uitdrukken Ebola titers beoordelen in een high-throughput antivirale scherm ^11. Terwijl inherent tijdrovend en duurder, kunnen dergelijke aanpassingen groter dynamisch bereik voor virale kwantificering indien nodig. Naast de bijzonder geschikt voor de evaluatie van virale titers in de context van high-throughput screens, onze eentraps luciferase gebaseerde virale kwantificeringsmethode genereert nauwkeurige schattingen van infectieuze virions bij replicerende virussen. Bovendien uitlezingen van luminescentie naast cytotoxiciteit gegevens van hetzelfde experiment geven eenvolledig beeld van het effect van de experimentele voorwaarden doelcellen, hetgeen bijzonder nuttig in de context van oncolytische virussen en drugsgebruik schermen.

De hier getoonde voorbeeld wordt een negatieve replicerende enkelstrengs RNA-virus; echter kan dit protocol worden aangepast om een ​​aantal replicerende en niet-replicerende virussen met enkele kleine aanpassingen protocol. Dit omvat DNA-virussen zoals Vaccinia, HSV en AAV (zie figuur 5). Monsters geïnfecteerd met intracellulaire virussen zoals vacciniavirus vereisen bijvoorbeeld een virus afgifte stap voor kwantificering (bijvoorbeeld ten minste een vries-dooi cyclus). Bij toepassing van deze techniek op andere virussen, moet de incubatietijd optimaliseren van de overdracht van het virale lysaat supernatant of het lezen van de platen door de luminometer. Deze parameter zal voornamelijk afhangen van de replicatiecyclus van het virus in de tolerante cellijn en de sterkte van de promoter rijden luciferase expressie. Dit kan het beste met de volledige standaard curve in de optimalisatie stap. Daarvoor moet men de geschikte permissieve cellijn met verschillende monsters van het bereide standaardkromme infecteren en lees elk repliceren op een andere tijdstippen na overdracht. Idealiter wordt een incubatietijd punt gekozen, dat leidt tot een lineair verband tussen LOG (RLU) en LOG (titer) verspreid over de verwachte monster titer bereik. Voor VSVΔ51-Fluc deze bedraagt ​​typisch 10 ⁴ pfu / ml -10 ⁷ pfu / ml gedurende 5 uur incubatietijd. Bij lagere of hogere titers worden verwacht van monsters, kan men eenvoudig verhogen respectievelijk verlagen de incubatietijd. Alternatief kan monsters verdund binnen het bereik veel wordt typisch gedaan ELISA vallen.

Zoals hierboven vermeld, is deze methode zeer geschikt voor high-throughput drug screens middels drug bibliotheken meeste stappen worden automatisch uitgevoerd. Cellen worden uitgeplaat efficiently toepassing van een geautomatiseerde microplaat dispenser, kan de geneesmiddelenbibliotheek toevoegen via een 96-kanaals vloeistofmanipulator, kan virus worden toegevoegd met behulp van een microplaat dispenser en borden lezen met een geautomatiseerde luminometer. In principe kan deze ook worden aangepast aan 384 putjes of kleinere formaten; echter, de beperking tot dit einde is het aantal cellen die kunnen worden verzilverd, krijgen minder cellen leidt tot een kleiner bereik in de lineariteit van het LOG (RLU) tot (titer) relatie LOG. Tenslotte kan beoordeling van cellevensvatbaarheid met resazurin of andere metabole kleurstoffen gemakkelijk worden opgenomen in de workflow, waardoor discriminatie cytotoxische verbindingen antivirale schermen of identificatie van verbindingen die leiden tot synergistische doden in combinatie met virussen ^12. Toch beperkingen van deze werkwijze omvatten het vereiste van een luciferase transgen virus, wat niet altijd mogelijk is, en de beschikbaarheid van voldoende permissieve cellijn. Het is echter waarschijnlijk mogelijk aanpassende werkwijze voor gebruik met andere reporter genen (bijvoorbeeld GFP) verstrekte de reporter kwantificeringsmethode een geschikte lineariteit en signaal-ruisverhouding. Kortom, kan de beschreven high-throughput werkwijze worden gemodificeerd om verschillende virussen aangepast en afgestemd op diverse toepassingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
Fetal bovine serum	NorthBio Inc.	NBSF-701
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Bereid een 1 mM oplossing, pH 7.3
alamarBlue	AbD Serotec	BUF012B
D-Luciferin potassium salt	Biotium	10101-2
96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates	Corning	3917	384-well platen kunnen ook worden gebruikt voor hogere doorvoer
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Monochroom microplate reader
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	96 tip handmatig pipetteringssysteem
Liquidator96 LTS Tips gesteriliseerd met filters	Mettler Toledo	LQR-200F	Elke steriele gefilterde tips die compatibel zijn met pipettors naar keuze zijn geschikt
Microflo	BioTek	111-206-21	Gebruikt om cellen in een 96-well plate te plaatsen
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Microplate fluorometer