Een In Vitro Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy

Samenvatting

Globoïde cellen zijn een typerend pathologisch kenmerk van de ziekte van Krabbe, een leukodystrofie waarvoor momenteel geen effectieve langetermijntherapie bestaat. We hebben een celkweekmodel ontwikkeld om de intrinsieke biologie en het pathogene potentieel van geactiveerde microglia en hun transformatie in globoïde cellen te bestuderen.

Samenvatting

De exacte functie van meerdere kernen microglia, genaamd globoid cellen, die uniek overvloedig in het centrale zenuwstelsel van globoid cel leukodystrofie (GLD) is onduidelijk. Deze kloof in kennis is gehinderd door het ontbreken van een geschikt in vitro model voor onderzoek. Hierin beschrijven we een primaire murine gliale kweeksysteem waarin behandeling met psychosine leidt multinucleation van microglia lijkt het kenmerk globoid cellen in GLD. Met behulp van deze nieuwe systeem, hebben we overeenstemming over de voorwaarden en de wijze van analyse voor de studie van globoid cellen. Het potentiële gebruik van dit modelsysteem werd gevalideerd in onze eerdere studie, die een mogelijke rol voor matrix metalloproteïnase (MMP) -3 geïdentificeerd in GLD. Deze nieuwe in vitro systeem kan een nuttig model waarin de vorming en functie, maar ook de potentiële therapeutische manipulatie van deze unieke cellen te bestuderen.

Inleiding

Globoid cel leukodystrofie (GLD), ook bekend als de ziekte van Krabbe, een dodelijke demyeliniserende aandoening als gevolg van verlies van functie mutaties in het galatocerebrosidase (GalC) gen ^1. De meest voorkomende vorm van GLD is de infantiele variant die wordt gekenmerkt door het begin in de vroege kinderjaren en gekenmerkt door een agressief klinisch beloop van motorische en cognitieve achteruitgang leidt tot een voortijdige dood vaak voor vijf jaar ^2,3. Genetische tests worden gebruikt om de diagnose GLD ⁴ verifiëren. Neuropathologie van GLD onthult wijdverspreide demyelinisatie, neuronale atrofie, astrogliose en aanwezigheid van volgezogen met meerdere kernen microglia genaamd globoid cellen ^5-7. De identificatie van globoid cellen, vaak met tubulous insluitsels in hun cytoplasma, is een typisch kenmerk van GLD geweest voor de afgelopen 97 jaar, hoewel de specifieke functie van deze opvallende cellen ongrijpbaar is gebleven.

De betrokkenheid van niet-MYELsprong uit glia (microglia en astrocyten) in de pathogenese van GLD is lang beschouwd als een secundaire respons op de diepe demyelinisatie in deze ziekte ^8. Interessant is de eerste beschrijving van deze ziekte, door Knud Krabbe in 1916 ^5, rapporteerde vorming van meerkernige fagocyten lipide bevattende resten die zijn genoemd 'globoid cellen en zijn een kenmerk van deze ziekte.

Globoid cellen zijn het belangrijkste kenmerk is van GLD pathologie, hoewel hun rol in de GLD is lange tijd genegeerd. Interessant is dat deze cellen tot de vroegste kenmerkende veranderingen in CNS weefsel van GLD. Dit gebrek aan kennis kan veroorzaakt zijn door de aanname dat de vorming van meerkernige fagocyten, genaamd reuzencellen in andere ziekten, worden kenmerkend beschouwd als gevolg van pathologie dan een eerste pathogene motor ^9. Daarom zijn er weinig studies die het mechanisme whi geweestch globoid cellen worden gevormd uit fagocyten, met name in het CZS van GLD. De in dit rapport beschreven procedure richt zich op het belang van globoid vorming cel in het CZS en onze vorige demonstratie die-psychosine geïnduceerde multinucleation van microglia in vitro en deze cellen vertoonden hogere niveaus van fagocytose. Consistent met deze waarnemingen, globoid cellen in vogelaar hersenen bevatten vaak PAS-positieve puin, wat suggereert een hoge mate van fagocytose. Globoid cellen zijn ook gevonden immunopositieve voor ferritine te zijn (een microglia marker) ^10, KP-1 / CD68 (een monocyt marker), en sommige zijn ook positief voor vimentine (een intermediair filament eiwit en marker van astrocyten en geactiveerde microglia) ^11, HLA-DRA (een MHCII oppervlak receptor) en TNF-α ⁷ en Iba-1 (a calcium bindend eiwit gebruikt voor het identificeren microglia) ^12. Op basis van deze verzameling van markers, globoid cellen afkomstig van microglia die zich ontwikkeleneen unieke fenotype.

Ondanks hun uniciteit, heeft de specifieke functie en de bijdrage van de GC te GLD pathogenese grotendeels over het hoofd gezien. Globoid cellen zijn gericht op een secundair gevolg van chronische demyelinisatie. Echter, eerdere studies onderzoeken van de tijdelijke vereniging van globoid cellen aan de witte stof pathologie van GLD de aanwezigheid van globoid cellen in de late embryonale om vroege postnatale periodes geïdentificeerd; tijden voorgaande oligodendrocyte apoptose en openlijke demyelinisatie ^13. Aldus, de temporele opeenvolging van ontwikkeling van de neuropathologie in GLD stelt globoid cellen worden gevormd vóór demyelinisatie in deze ziekte ^14. Dit leidde tot onze hypothese dat de vroege vorming van globoid cellen in GLD een bepalend pathogene evenement plaats kan vertegenwoordigen dan een secundaire, reactieve reactie op oligodendrocyte schade ^15. Daarnaast heeft ontregeling van microgliale activiteit GLD beschouwd een factor het beperken van de lange-termijn effectiviteit van hematopeotic stamcel therapieën voor de behandeling van deze ziekte ^16. Aldus onderzoeken van de cellulaire functies en regulering van microglia en globoid cellen in respons op psychosine verwachting nieuwe inzichten in de pathogenese van GLD verschaffen.

Tot voor kort was het ontbreken van een geschikt model om globoid celvorming bestuderen begrip van de precieze functie en de bijdrage van deze cellen aan de pathologie van GLD beperkt. In recente studies werd vastgesteld dat globoid-achtige cellen worden gevormd in directe reactie op psychosine, een pathogeen toxine lipide dat zich ophoopt in GLD. We vonden dat microglia, maar niet macrofagen, worden geactiveerd en omgezet in globoid cellen in primaire gliale culturen in reactie op psychosine ^15. Deze transformatie in globoid cellen bleek te zijn gemedieerd door de extracellulaire protease, matrix metalloproteïnase (MMP) -3 ^15. Meer recent, wehebben deze bevindingen uitgebreid en vastgesteld dat psychosine-geactiveerde microglia en globoid cellen die in dit in vitro model systeem krachtig giftig voor oligodendrocyten en oligodendrocyt progenitorcellen. Vandaar dat, wanneer beschouwd in de context van GLD, het begin van de accumulatie van psychosine en de vorming van globoid cellen voorafgaand aan demyelinisatie zou een opkomende primaire en mogelijk pathogene rol voor microglia bij deze ziekte te steunen.

Wij stellen voor dat de studie van globoid vorming cel zal nieuwe informatie over de pathogenese van GLD, dat zal bijdragen aan ons begrip van deze ziekte te onthullen. Bovendien kan deze nieuwe cellulaire model van GLD een nieuw formaat van waaruit nieuwe therapeutische benaderingen te pakken pathologische veranderingen in deze ziekte zou kunnen worden getest bieden. Vandaar dat in dit rapport geven we een gedetailleerd protocol voor de in vitro ontwikkeling van psychosine geïnduceerde globoid cellen uit primaire kweken van niet myeliniserende glia.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid op Humanitaire Zorg en gebruik van proefdieren uiteengezet door het Office of Laboratory Animal Welfare (NIH) en alleen met toestemming van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Connecticut Health Center.

1 Voorbereiding van de Gemengde glialculturen

1. Steriliseer alle instrumenten voor gebruik. Voeg 3 ml ijskoude steriele Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) die geen kationen ^{(Mg2 +} of Ca2 ⁺⁾ drie steriele 60 mm petrischaaltjes op ijs koud houden.
2. Isoleer de cortices van postnatale P0-P2 muis pups, zoals eerder beschreven ^17,18.
   OPMERKING: Subcorticale structuren, zoals zeepaardjes, zijn niet inbegrepen in deze culturen.
3. Verwijder voorzichtig de hersenvliezen en breng de geïsoleerde cortex frisse HBSS en distantiëren de weefsels enzymatisch, met behulp van een neural weefsel dissectie kit volgens protocol van de fabrikant.
4. Plaat de cellen in steriele T-175 kolven en incubeer overnacht in medium [Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS) bevattende 1 x penicilline / streptomycine].
5. Vervang alle media de volgende dag met verse media. Blijven culturen broeden, met reguliere media veranderingen, voor ongeveer 3 weken of tot een cellulaire monolaag is gevestigd.
   Opmerking: Deze monolaag zal bestaan ​​uit astrocyten en microglia met een ongeveer 10: 1 verhouding ^19.

2 globoid Cell Inductie in Gemengde glialculturen

1. Bereid de ECM-gecoate dekglaasjes.
   1. Opnemen ronde dekglaasjes met steriele 1 N zoutzuur (HCl) in een steriele petrischaal gedurende 30 minuten. Was coverslips met steriel water 3x en dan laten weken in 95% EtOH gedurende tenminste 20 minuten. en dan laten drogen aan de lucht.
   2. Plaats druppels verdund extracellulaire matrix (ECM) eiwitten bekledingsmaterialen op een stuk Parafilm (bijvoorbeeld 150-250 gl / druppel laminine 10 ug / ml opgelost in steriele fosfaatbuffer [PBS]). Verdeel de druppels zodat coverslips toen geplaatst op deze druppeltjes niet zal raken. Plaats voorzichtig elke gedroogde dekglaasje op een druppel behulp van een tang.
   3. Laat de dekglaasjes op de druppels ca.. 4-6 uur in de cultuur kap met het raam dicht.
   4. Plaats de ECM-gecoate dekglaasjes (ECM-gecoate kant naar boven) in elk van de wells van een 24-well plaat. Was elk putje met steriel PBS 3x en bewaar bij 4 ° C totdat het nodig is.
2. Voorbereiding Gliale Cellen voor Plating op Coverslips.
   1. Zuig het materiaal uit de gliale culturen en voorzichtig te wassen de gliale monolaag 3x met 10 ml steriele PBS. Voeg daarna 8-10 ml trypsine-EDTA oplossing van het T-175, en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C.
   2. Wanneer de meeste van de monolaag is losgemaakt, voeg 20 ml van complete medianaar de kolf met trypsine te stoppen. Verzamel de media die het losgemaakte cellen in een 50 ml conische buis en draaien voor 10 min bij 300 xg bij kamertemperatuur.
   3. Zuig het supernatans zonder de pellet te verstoren, en vervolgens opnieuw op te schorten van de cellen in 2 ml verse complete media door de pipet voorzichtig de oplossing om met een P1000 pipet.
   4. Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer en resuspendeer cellen in compleet medium op de gewenste dichtheid (bijvoorbeeld 10 ⁵ cellen / ml). Plaat de cellen op de ECM beklede dekglaasjes (bijvoorbeeld 500 pl in elk putje van de 24-well plaat). Voeg extra vers compleet medium aan elk putje gedurende 3-5 dagen incubatie bij 37 ° C, of ​​totdat de cellen groeien tot de gewenste visuele samenvloeiing.
3. Behandeling met Psychosine.
   1. Reconstitueer de psychosine een voorraadconcentratie (108,3 mM) in dimethylsulfoxide (DMSO). Verdun deze voorraad in 100% EtOH een werkvoorraad maken dat kan den wordt toegevoegd aan elke well van 24-well plaat tot een eindconcentratie van 10 uM.
   2. Op het moment van toevoegen van de psychosine, draai voorzichtig met de cultuur plaat om de psychosine in de cultuur media mix. Vul het psychosine door toevoeging van het equivalent van 10 uM om de dag gedurende een week.
4. Na 7 dagen psychosine behandeling, verzamel de media en pipet 500 pi koude 4% paraformaldehyde (PFA) in elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de cellen te repareren. Vervolgens was elk putje 3x met PBS en vervolgens houden platen bij 4 ° C totdat bewerkt voor immunocytochemie (zie hieronder).
   OPMERKING: celkweek media kunnen worden verzameld voor enzymatische of ELISA assay op dit moment indien gewenst.

3 Immunocytochemie (ICC) om globoid Cells Visualiseer

1. Vervang PBS met blokkerende buffer [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normaal geit serum (NGS)] en incubeer de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
2. Incubate de gefixeerde cellen in primaire antisera tegen Iba-1 [(1: 1000) verdund in PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] minimaal 1 uur bij kamertemperatuur geroerd, daarna wassen elk putje met PBS 3 x 5 min / wassen.
3. Voeg de juiste secundaire fluorescentie-geconjugeerd antilichaam aan het primaire antilichaam labeling en contra-vlek identificeren met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1: 1000) kernen identificeren. Incubeer in secundair antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en wassen met PBS 3 x 5 min.
4. Monteer elke dekglaasje om dia's met behulp van een montage medium microscoop. Bekijk dia's op een fluorescentiemicroscoop voor visuele en kwantitatieve analyses.

4 Analyse en karakterisering van globoid Cellen in het jeugdwerk Cultuur

1. Gebruik de volgende drie morfologische criteria een globoid cel te identificeren in de cultuur:
   1. Identificeer globoid cellen met behulp van fluorescentie microscopie door immunopositieve etikettering voor de microglia marker, Iba-1 +.
   2. Identificeergloboid cellen als polynucleated (dwz met twee of meer DAPI positieve kernen).
   3. Identificeer globoid cellen door een afgeronde morfologie verschilt van de sterk vertakte weergave van rustende microgliale cellen.
      OPMERKING: Cellen kunnen ook worden verzameld celoppervlak marker-analyse en kwantificering door flow cytometrie uit deze culturen.
2. Het meten van de fagocytaire activatie van microglia en globoid cellen
   1. Om de fagocytische activiteit van psychosine behandelde microglia beoordelen, commentaar FITC-gemerkte latex bolletjes aan de putjes volgens de instructies van de fabrikant. Voeg TL-geconjugeerde latexparels 48 uur voorafgaand aan de fixatie met PFA. Fix cellen behandeld met kralen (zoals vermeld in paragraaf 2.4), en het proces voor immuuncytochemie (zoals beschreven in paragraaf 3).
   2. Selecteer fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen, zodat zij de fluorescentie emissiespectra van de fluorofoor gemerkte korrels overlappen.
   3. Analyze fagocytotische de profielen van Iba-1 + microglia door het identificeren van die cellen die co-lokaliseren met fluorescent-gelabelde beads.
      OPMERKING: Psychosine zal microglia activeren. Gefagocyteerde kralen worden geïdentificeerd binnen mononucleaire en meerkernige Iba-1 + cellen in deze cultuur instelling.

5 Inductie van globoid Cellen uit Gezuiverd Microgliale Cultures

OPMERKING: Een alternatieve benadering intercellulaire signalering tussen astrocyten en microglia ontcijferen is een ander voordeel van deze in vitro globoid celmodel. Zuivering van primaire microgliale cellen voor replating of co-kweek kan worden bereikt door hun lagere hechting eigendom in kweek, zoals beschreven in de volgende stappen (zie paragraaf 5.2).

1. Verzamel het materiaal uit de samenvloeiing gemengde glialculturen in 50 ml conische buis en onderhouden bij 37 ° C in de incubator.
2. Microglia Isolatie van primaire Mixed glialculturen.
   1. Nadat de inhoud van een confluente gemengde gliale cultuur T175 kolf, voeg warm schudden media [bestaande uit compleet medium + 25 mM 4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) + 25 mM natriumbicarbonaat (Sigma)]. Schud de kolven gedurende 3-4 uur in een orbitale schudder bij 100 rpm (37 ° C). Verzamel het materiaal uit deze geschud kolven in 50 ml conische buizen.
      OPMERKING: Dit medium zal het minder aanhangend microglia van de kolven.
   2. Spin de media bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 ml van de astrocyt-geconditioneerde media (verzameld in stap 5.1).
   3. Vaststellen van het aantal cellen verkregen met behulp van een hemocytometer en vervolgens bord van de microglia cellen op-substraat gecoate dekglaasjes (zie paragraaf 2.1) voor immunocytochemie, of plaat op Ultralow therapietrouw en platen voor de toekomstige collectie van globoid cellen voor co-cultuur met andere celtypes, zoals oligodendrocyten (als described in de volgende paragraaf).
      Opmerking: Als de geplateerde microglia worden behandeld met psychosine (10 uM) zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 2.3).
3. Co-cultuur met primaire oligodendrocyten voor Analyse van de cytotoxiciteit.
   OPMERKING: Verzameling van psychosine behandelde microglia van de lage hechting platen voor daaropvolgende co-kweek op primaire kweken van oligodendrocyten of oligodendrocyt progenitorcellen, kunnen worden gebruikt om de mogelijke cytotoxische functie van deze globoid-achtige cellen in vitro onderzoeken.
   1. Ontwikkelen culturen van primaire oligodendrocyten met aanvaarde methoden ^18,20. Om de psychosine behandelde microglia verzamelen voorzichtig pipet de losjes hechtende cellen los van de bodem van de putjes. Verzamel de cellen gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 10 min, en vervolgens voorzichtig resuspenderen in oligodendrocyten differentiatie media [samengesteld Neurobasal media, L-glutamine (1x), B-27 supplement (1x) en Triiodothyronine (T3, 10 ng / ml )].
   2. Tel het aantal cellen met een hemocytometer en zaad de microglia op de oligodendrocyt kweek bij 1 x 10 ⁵ cellen / ml, resulterend in een ongeveer 1: 2 microglia / oligodendrocyt verhouding. Incubate als een co-cultuur voor maximaal 3 dagen.
   3. Fixeer de cellen voor immunocytochemie (zie paragraaf 2.4). Verzamel celkweekmedium voor ELISA of chemische analyses nodig.

Resultaten

Dit protocol, zoals geschreven, zal naar verwachting ongeveer 36 dagen in beslag van begin tot eind (Zie Figuur 1: Experimentele Workflow Scheme). Het is onze ervaring dat de ontwikkeling van "globoid-achtige 'cellen in deze primaire kweeksysteem zowel betrouwbaar en reproduceerbaar: de vorming van meerkernige cellen in reactie op psychosine consistent waargenomen bij 7 dagen behandeling.

Immunocytochemische kleuring van microglia met Iba-1 in combinatie met een nuc...

Discussie

De hierin beschreven protocol verschaft een nieuw modelsysteem waarin de ontwikkeling en functionele karakterisatie van geactiveerde microglia en globoid cellen te bestuderen. Eerder werk door Im et al. Gebruik een HEK293 cellijn voorzien in een matrijs voor de ontwikkeling van de onderhavige protocol voor de studie van globoid celvorming ^21. Het is ook belangrijk erop te wijzen dat de globoid cellen, afkomstig van het model afwijken van de inheemse globoid cellen herkenbaar in GLD. Zo hebben we rout...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Hank’s balanced salt solution (HBSS) bevattende geen kationen (Mg2+ en Ca2+).	Life technologies	14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi	130-092-628
40 μm cell-strainer	Fisherbrand	22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) bevattende kationen (Mg2+ en Ca2+).	Gibco	14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-065
foetaal bovien serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilline/Streptomycine	Life technologies	15070-063
Laminine	Sigma	L2020
Trypsine-EDTA oplossing	Life technologies	25299-056
Psychosine	Sigma	P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	19208
Normal Goat Serum (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor geconjugeerd antiserum	Life Technologies	Various
Mounting Media	Southern Biotech	OB100-01
Phagocytic Assay Kit	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500