Methodenartikel

Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

DOI:

10.3791/51934

⸱

31 oktober 2014

1Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prototrofe bacteriën groeien op M-9 minimale zouten medium aangevuld met glucose (M-9 medium), welke wordt gebruikt als een koolstof- en energiebron. Auxotrofen kan worden gegenereerd met behulp van een transposome. De commercieel verkrijgbare, Tn 5 -afgeleide transposome gebruikt in dit protocol bestaat uit een lineair segment van DNA dat een R6K γ replicatieoorsprong, een gen voor kanamycine resistentie en twee mozaïek sequentie eindigt, die als transposase bindingsplaatsen. De transposome, verschaft als een DNA / transposase eiwit complex wordt geïntroduceerd door elektroporatie in de stam prototroof, Enterobacter sp. YSU, en integreert zich willekeurig in het genoom van deze host. Transformanten zijn replica uitgeplaat op Luria-Bertani agar platen die kanamycine, (LB-kan) en op M-9 medium agarplaten die kanamycine (M-9-kan). De transformanten die groeien op LB-kan borden maar niet op M-9-kan kentekenplaten geacht auxotrofen zijn. Gezuiverd genomischeDNA van een auxotroph wordt gedeeltelijk verteerd, geligeerd en getransformeerd in een PIR + Escherichia coli (E. coli) stam. De R6Kγ replicatieoorsprong kan het plasmide te repliceren in pir + E. coli-stammen, en de kanamycineresistentie marker zorgt voor plasmide selectie. Elke transformant bezit een nieuw plasmide dat het transposon geflankeerd door de onderbroken chromosomale regio. Sanger sequencing en de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggereren een vermeende identiteit van de onderbroken gen. Er zijn drie voordelen om met deze transposome mutagenese strategie. Ten eerste is het niet vertrouwen op de expressie van een transposase gen van de gastheer. Ten tweede wordt de transposome in het doel gastheer geïntroduceerd door elektroporatie, niet door conjugatie of transductie en daarom efficiënter. Ten derde, de R6Kγ replicatieoorsprong maakt het gemakkelijk om de gemuteerde g identificerenene die gedeeltelijk wordt teruggewonnen in een recombinant plasmide. Deze techniek kan worden gebruikt om de genen in andere kenmerken van Enterobacter sp. YSU of meer verschillende bacteriestammen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prototrofe bacteriën groeien op M-9 minimale zouten medium glucose (M-9 medium) bevattende glucose omzetten door de centrale koolstof metabolisme routes voorlopers, zoals aminozuren, nucleïnezuren en vitaminen genereren voor biosynthese 1. M-9 medium bevat ammoniumchloride als een stikstofbron, natrium en kalium fosfaat als buffer en fosforbron, magnesium sulfaat als zwavelbron en glucose als koolstof- en energiebron. Luria-Bertani (LB) medium rijk aan aminozuren van trypton en vitaminen en groeifactoren uit gistextract. Het ondersteunt de groei van auxotrofen die aminozuren, vitaminen en andere groeifactoren vereist voor groei op M-9 medium niet kan synthetiseren. Zo zal prototrofen groeien in LB en M-9 medium, terwijl auxotrofen groeien in LB-medium, maar niet in M-9 medium. Door het introduceren van mutaties in een prototrofe bacteriepopulatie en identificatie gemuteerde genen die auxotrofe fenotypes veroorzaken, is het possible een beter begrip van het metabolisme in een bacteriële stam te verkrijgen.

Transposon mutagenese kan worden gebruikt om veel van de genen die nodig zijn voor groei op glucose in M-9 medium identificeren. Transposons voegen zich willekeurig in het gastheergenoom 2. Door het spotten transposon transformanten op LB-agarplaten en replica uitplaten ze op M-9 medium agarplaten, kan men screenen voor auxotrofen. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door middel van genetische rescue. Deze studie maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar Tn 5 -afgeleide transposome die wordt geleverd als een oplossing van een lineair transposon DNA-segment gemengd met transposase eiwit. Het DNA-segment mist een transposase-gen, maar bevat een gen voor kanamycine resistentie, een R6K γ replicatieoorsprong en twee mozaïekmotief die DNA sequenties voor transposase binden aan elk uiteinde van het segment 3,4 zijn. Aangezien het transposase eiwit direct toegevoegd aan het DNA, de DNA-segment alleenwordt gedefinieerd als het transposon en de DNA / transposase eiwit complex wordt gedefinieerd als de transposome. De transposome wordt getransformeerd door elektroporatie 5 in een kanamycine gevoelige gastheer (Figuur 1A). Kolonies die groeien op LB-agarplaten die kanamycine (LB-kan) hebben transposon inserts (Figuur 1B), en replica uitgeplaat transformanten die niet groeien op M-9 medium agarplaten die kanamycine (M-9-kan) zijn auxotrofen (Figire 1C). Genomisch DNA van een mutant is gezuiverd en gedeeltelijk gedigereerd met 4-base knippende restrictie endonuclease, BFU CI (figuur 1D). Het geligeerde DNA wordt getransformeerd in een stam van Escherichia coli (E. coli) die het pir gen (figuur 1E) bevat. Dit gen maakt de nieuwe plasmide dat het transposon en flankerende chromosomale regio repliceren in E. coli 6. De kanamycine resistentiegen fungeert alsverkiesbare marker voor de nieuwe plasmide. Tenslotte sequentiebepaling met primers complementair aan elk uiteinde van de transposon en Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 analyse van de resulterende sequentie worden gebruikt om de identiteit van de onderbroken genen bepalen.

Dit transposome mutagenesestrategie biedt drie voordelen 3. Ten eerste, omdat het transposase eiwit direct gebonden aan het transposon insertie niet afhangt van de expressie van het transposase-gen in de gastheer. Zodra het transposon omvat zelf in het gastheergenoom, wordt de transposase afgebroken, waardoor extra beweging van het transposon. Echter, kan extra beweging niet worden voorkomen als de gastheer bezit een endogene Tn 5 transpositional element. Tweede, invoering van de transposome door elektroporatie maakt het mogelijk om het te gebruiken in een grote verscheidenheid van gastheren. Het elimineert tevens de noodzaak om de transposon voeren door bacteriële conjugatie of viral infectie. Beide processen vereisen waardplantgevoeligheid. Ten derde, opname van de kanamycine resistentie gen en de R6K γ replicatieoorsprong in de transposome vergemakkelijkt de onderbroken gen te identificeren. Transposon-onderbroken gebieden worden bewaard en de sequentie plasmiden, waardoor de noodzaak om de inverse polymerase chain reaction (PCR) techniek voor gen-identificatie.

De in deze video protocol beschrijft elke stap transposon mutagenese van Enterobacter sp. YSU 9 met een transposome van het inbrengen ervan in de bacteriecellen op het identificeren van de vermoedelijke gen dat onderbroken. Naast de eerder gepubliceerde protocollen 3,4,10 zijn nauwkeurige werkwijzen voor het gebruik replica plating te screenen voor auxotrofen gepresenteerd. Deze mutagenese techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken fenotypes, zoals antibiotica en metaal weerstanden, verschillende soorten bacteriën, identcerende het minimale aantal genen die nodig zijn voor de groei onder gedefinieerde kweekomstandigheden in de synthetische biologie studies, of voor het onderwijzen van een laboratorium onderdeel van een genetica of microbiële fysiologie cursus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Electroporatie van Competent Cells 5,11

  1. Verdun een O / N LB cultuur van Enterobacter sp. YSU 1/20 in 50 ml vers LB-medium en kweken onder schudden bij 120 rpm en 30 ° C tot een OD (600 nm) tussen 0,4 en 0,6. Eventueel groeien andere bacteriestammen op hun optimale groeitemperatuur.
  2. Koel de cellen op ijs gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 4 ° C en 7000 g gedurende 5 min.
  3. Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in 50 ml steriel ijskoud water en centrifuge bij 4 ° C en 7000 g gedurende 5 min. Herhaal deze stap.
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in een volume van ijskoud water gelijk aan het volume celpellet. Voor langdurige opslag, was de cellen met 10 ml ijskoude 10% (v / v) glycerol, resuspendeer in een gelijk volume pellet ijskoude 10% (v / v) glycerol, bewaar bij -80 ° C en ontdooien op ijs vóór elektroporatie.
  5. Voeg 0,5 ul van de transposome 40 glcellen. De commercieel verkrijgbare transposome oplossing wordt toegevoerd aan een DNA- concentratie van 0,33 ug / ul. Hoewel 0,33 ug aanbevolen, 0,165 ug DNA voldoende.
  6. Plaats de cel / transposome mengsel in een ijskoude, 0,2 mm, elektroporatie cuvette en tik het mengsel naar de bodem van de cuvet. Shock de cellen bij 25 uF, 200 Ω, en 2,5 kV. Om de cellen blijven gekoeld, slaan de elektroporatie cuvetten in een -20 ° C diepvriezer vóór gebruik.
  7. Onmiddellijk voeg 960 gl filter gesteriliseerd super optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) medium. Meng door en neer te pipetteren en breng de cellen naar een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
    OPMERKING: De cellen beginnen af ​​te sterven na de schok, maar het zout in het SOC medium hen in staat stelt om te herstellen. Bezuinigen is niet noodzakelijk transposome toevoegen of de negatieve controlecellen schok. Voeg 960 ul van steriel SOC medium aan.
  8. Incubeer de cellen bij 30 ° Cfof 45-60 min met schudden bij 120 rpm. Dit verschaft tijd voor de transposome recombineren met het gastheergenoom en de cellen voor kanamycine resistentie drukken.
  9. Spread 100 pl cellen op LB-kan agar plaat en incubeer de plaat O / N bij 30 ° C. Bewaar de resterende transformatiemengsel in de koelkast bij 4 ° C. Verspreid extra bedragen op een later tijdstip tot 2 weken na de eerste elektroporatie indien nodig.

2. gridding van Transformanten

  1. Tape een rooster om het deksel van een lege 100 x 15 mm petrischaal. Kopieer een raster van "een korte cursus in Bacteriële Genetica" 12.
  2. Teken een lijn op de bodem van een LB-kan agarplaat. Gebruik een klein stukje tape om het te verankeren aan de gerasterde deksel, zodat het raster zichtbaar is door de agar. Zorg dat de lijn op de bodem van de plaat is uitgelijnd met de bovenkant, het midden van het raster. Verankeren van de plaat met tape houdt het schuiven, waardoor er een nog gridding. De lijn faciliteert kolonie identificatie na replica plating.
  3. Sla een transformant met een steriele tandenstoker en ter plaatse het in het midden van een plein in het raster. Raak de kolonie en de spot. Graven niet de tandenstoker in de agar. Om verontreiniging van de plaat te voorkomen, omgaan met de tandenstoker slechts aan één zijde.
  4. Spot andere transformant in een aangrenzend veld als in stap 2.3. Wanneer de plaat vol, incubeer het O / N bij 30 ° C. Dit is de meester plaat.

3. Replica Plating aan Bepaal de auxotroph Phenotype 12

  1. Voor elke plaat die was gerasterde, maak een stapel van drie verse agarplaten genummerd één tot drie: één voor LB-kan, twee voor M-9-kan en drie LB-kan. Droog de platen ondersteboven, O / N bij 37 ° C vóór gebruik.
  2. Teken een lijn op de top van elke plaat als in stap 2.2.
  3. Veeg de replica plating tool met 70% ethanol, plaats een steriele velveteen plein op de top van de replica plating aanol en klem de velveteen plein beneden. Handen zitten vol met microben, zelfs na het wassen. Voorkomen dat de introductie van verontreinigende micro-organismen door het hanteren van de fluwelen plein bij de rand.
  4. Lijn de lijn op de master-plaat met een lijn op de klem en zet de plaat op de top van de fluwelen plein. Druk zachtjes op de bacteriën te dragen van de plaat naar de velveteen plein. Wees voorzichtig niet om de bacteriën te smeren. Verwijder de master plaat uit de velveteen plein.
  5. Lijn de lijn getrokken op plaat nummer één met de lijn op de klem en plaats het op de top van de fluwelen plein. Pas lichte druk om de bacteriën overdragen van de fluwelen haaks op de plaat. Verwijder plaat nummer één.
  6. Gooi de velveteen plein in een beker water en plaats een schone, steriele velveteen plein aan de replica plating hulpmiddel zoals in stap 3.3. Deze stap voorkomt over-inenting die de groei doorbraak en vals positieve resultaten veroorzaakt.
  7. Lijn delijn op plaat nummer één met de lijn op de klem en plaats het op de top van de nieuwe fluwelen plein. Druk zachtjes op de bacteriën overbrengen van plaat nummer één op de velveteen plein. Verwijder plaat nummer één.
  8. Lijn de lijn getrokken op plaat nummer twee met de lijn op de klem en plaats het op de top van de fluwelen plein. Druk zachtjes op de bacteriën overbrengen van de velveteen plein aan plaat nummer twee. Verwijder plaat nummer twee.
  9. Herhaal stap 3.8 voor plaat nummer drie. De derde plaat als controle voor volledige overdracht van de masterplaat aan de andere twee platen. Gooi de velveteen plein in een beker water. Om de velveteen pleinen hergebruiken, autoclaaf de beker die de verontreinigde velveteen pleinen, was ze, droog ze af, wikkel ze in aluminiumfolie en re-autoclaaf hen.
  10. Incubeer de platen bij 30 ° CO / N. Kolonies die groeien op beide LB-kan agarplaten maar niet groeien op M-9-kan kentekenplaten geacht auxotrofen (be Figuur 2).
  11. Streak uit auxotrofen van plaat nummer één op een verse LB-kan agar plaat, en incubeer de plaat bij 30 ° CO / N.
  12. Streak uit voor isolatie 3 kolonies van de streak plaat in stap 3.11 op een verse LB-kan plaat. Incubeer de plaat bij 30 ° CO / N. Dit zorgt ervoor dat de mutant is goed geïsoleerd. Verdeel de plaat in drieën en streak uit elke kolonie in één sectie.
  13. Spot kolonies van de uitgestreken kolonies afgeleid van stap 3.12 op een verse LB-kan plaat om een ​​rooster te vormen zoals in de stappen 2,1-2,4. Elke mutant wordt opnieuw getest in drievoud.
  14. Repliceren plaat weer zoals in de stappen 3,1-3,10 de auxotroph fenotype bevestigen.

4. Gene Rescue

  1. Kweek een 3 ml O / N kweek van een geïsoleerde mutant kolonie van stap 3.13 in vloeibaar LB-kan medium bij 30 ° C. Zuiver genoom DNA van 1 ml van de cultuur met behulp van een in de handel verkrijgbaar genomische DNA-zuivering kit.
  2. Het opzetten van een mengsel van 0,025 UBFU CI restrictie endonuclease en 14 pl van 1 ug / ul genomisch DNA in een 20 ul reactie op ijs. Aangezien BFU CI snijdt het transposon op twaalf verschillende locaties, kan het efficiënter zijn om restrictie-endonuclease, BFA I of Hae III, die het transposon snijdt op twee en drie verschillende locaties, respectievelijk gebruikt.
  3. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 25 minuten en vervolgens bij 80 ° C gedurende 20 minuten om het enzym te inactiveren. Analyseer 3 pl van het gedeeltelijk gedigereerd DNA op een 0,8% agarosegel (Figuur 3). Een succesvolle gedeeltelijke digestie resulteert in een uitstrijk van boven 10 kb naar de onderkant van de gel.
  4. Ligeren 15 ui genomisch DNA gedeeltelijk gedigereerd met 800 eenheden T4 DNA ligase in een 500 ui reactie. Incubeer het reactiemengsel O / N bij 4 ° C. De grote reactievolume maximaliseert de ligatie van de fragmenten aan zichzelf en minimaliseert interacties tussen twee of meer DNA-fragmenten.
  5. Precipitate de geligeerde DNA door toevoeging van 50 pl 3 M natriumacetaat, pH 5,5, en 1 ml 95% ethanol en incuberen bij -20 ° C gedurende 20 min.
  6. Microfuge het DNA bij 4 ° C en 13.500 g gedurende 10 min, was de pellet met 70% ethanol, gedroogd in een centrifugale vacuümconcentrator en resuspendeer in 10 pl nuclease-vrij water. Als alternatief kan de DNA lucht gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
  7. Gebruik 4 pi geresuspendeerd DNA te transformeren E. coli stam ECD100D pir of ECD100D pir116 door elektroporatie zoals in hoofdstuk 1. De R6K γ replicatie oorsprong vereist een bacteriële stam met een PIR-gen te repliceren 6. De PIR-stam resulteert in lage kopie plasmiden, en de pir116 stam bevat een pir mutant gen dat resulteert in hoge kopie plasmiden. Elke transformant bevat een nieuw plasmide met de transposon en een gebied van de onderbroken chromosoom (figuur 1E).
  8. Inoculat 5 ml LB-kan medium met een enkele kolonie, groeien O / N onder schudden bij 120 rpm en 37 ° C en zuiveren plasmide-DNA uit het gehele O / N kweek met commerciële kit.
  9. Digest 14 ul van het plasmide met de restrictie-endonuclease XhoI Zorg ervoor dat het eindvolume van de reactie 20 pl. Dit enzym herkent een plaats in het midden van het transposon einde van het kanamycine resistentie-gen 5 '. Analyseer 10 ul van de gedigesteerde en de gedigesteerde plasmide op een 0,8% agarosegel (Figuur 3). Het plasmide bestaat uit de 2 kb plus transposon flankerende gastheer DNA.

5. DNA Sequencing

  1. Sequentie het plasmide met een algemeen verkrijgbare sequencing kit, primers die homoloog zijn aan elk uiteinde van de transposon zijn, en een capillair sequencing analysesysteem. Alternatief, kan het plasmide worden verzonden naar een externe inrichting voor sequencing.
  2. Gebruik het molecuulgewicht standaard (1 kb ladder) inde gel om de grootte van het plasmide te schatten. Vervolgens schat het aantal nanogram (ng) van plasmide die nodig is voor 50 fmol.
  3. Meet de concentratie van het plasmide DNA met behulp van een spectrofotometer bij golflengten van 260 nm (260 A) en 280 nm (A280). Zorg ervoor dat het licht lang pad door de cuvet is 1 cm. Bepaal de concentratie van de absorptie bij 260 nm te vermenigvuldigen met 50 ng / ul. Hoogwaardige plasmide-DNA zal een A260 / A280 verhouding tussen 1,8 en 2,0.
  4. De hoeveelheid DNA voor elke sequencing reactie is het aantal ng vereist 50 fmol en de concentratie van het plasmide. Meng de benodigde hoeveelheid plasmide met water om het totale volume tot 10 pi te brengen.
  5. Verwarm het plasmide DNA / water mengsel bij 96 ° C gedurende 1 minuut en koel het af tot kamertemperatuur.
  6. Voeg 8 pi Master Mix van de sequencing kit en 2 pl van 1,6 uM van één van de sequencing primers.
  7. Follaag het protocol van de sequencing kit voor de thermocycler programma en reactie opruimen.
  8. Analyseer elk monster met behulp van een capillair DNA-analyse-systeem.
  9. Gebruik een in de handel verkrijgbaar softwarepakket voor de DNA-sequentie zien. Zoek de sequentie "5'-GAGACAG-3 '," die de laatste 7 bp van de transposon (figuur 4). De volgorde voor het einde van deze 7 bp segment van de 5 'behoort tot het transposon. De sequentie na het 3 'uiteinde van het 7 bp segment behoort tot de onderbroken gen.
  10. Bepaal de mogelijke functie van de onderbroken gen met behulp van de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Gebruik de volgende link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Plak de sequentie van de interrupted-gen in de doos query, selecteert u "anderen" in het kader van de database en klik op "BLAST" aan de onderkant van de pagina. Wanneer het resultaat verschijnt, scroll naar beneden de pagina om de uitlijning resultaten (figuur 5) te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transformatie van Enterobacter sp. YSU door elektroporatie met de transposome ingeleid genoom willekeurige insertie in het gastheergenoom (Figuur 1A, B). Een succesvolle elektroporatie leverde enkele duizenden transformanten welk op LB-kan-platen. Voor het verkrijgen 300-400, goed gespreid kolonies per plaat, werd de hoeveelheid transformatiemengsel verspreid over elke LB-kan agarplaat geoptimaliseerd. Elke transformant bevatte ten minste een transposon insertie, maar het was niet duidelijk of ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transposon mutagenese met behulp van een transposome is een efficiënte tool voor het genereren auxotrofen in Enterobacter sp. YSU en andere vormen van Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën 3,4. Het proces werd geïnitieerd door de invoering van de Tn 5-afgeleide transposome in de gastheer door middel van elektroporatie. Om kolonies te identificeren met inserts, de ongetransformeerde stam doel moest gevoelig voor kanamycine voor het selecteren van de resistentiemerker de transposon uitgev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur wil graag al mijn undergraduate Independent Research Studenten en al mijn Microbiële Fysiologie afgestudeerde studenten die mijn transposon mutagenese ideeën tijdens de 2010-2014 lentesemesters getest bedanken. Dit werk werd gefinancierd door de Afdeling Biologische Wetenschappen aan Youngstown State University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome KitEpicentre (Illumina)TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coliEpicentre (Illumina)ECP09500Capabel van het repliceren van plasmiden met een R6Kγ replicatie-oorsprong bij een laag kopienummer
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coliEpicentre (Illumina)EC6P095HCapabel van het repliceren van plasmiden met een R6Kγ replicatie-oorsprong bij een hoog kopienummer
5X M-9 SaltsThermo FisherDF048517
Lennox LB BrothThermo FisherBP1427-2
AgarAmresco, Inc.J637-1KGSolide media bevat 1,6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate Amresco, Inc.0408-25GWanneer vereist, bevat media 50 μg/ml kanamycin sulfaat
D-Glucose MonohydrateAmresco, Inc.0643-1KG
Yeast ExtractAmresco, Inc.J850-500G
TryptoneAmresco, Inc.J859-500G
KClSigma-AldrichP4504-500G
NaClAmresco, Inc.X190-1KG
MgCl2Fisher ScientificBP214-500
MgSO2Fisher ScientificBP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium0,5% (w/v) gistextract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 en 20 mM glucose
BfuC INEBR0636SPartiële spijsvertering van genomisch DNA
Xho INEBR0146SPlasmidspijsvertering
T4 DNA LigaseNEBM0202S
Nuclease Free WaterAmresco, Inc.E476-1LVoor het oplossen van geprecipiteerd DNA en restrictie-endonuclease-reacties
GenomeLab DTCS - Quick Start KitBeckman Coulter608120DNA-sequencing
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification SystemPromegaA1460Plasmidzuivering
Replica Plating BlockThermo Fisher09-718-1
Velveteen SquaresThermo Fisher09-718-2Replica plating
PetriStickersDiversified BiotechPSTK-1100Raster voor replica plating
Petri DishesThermo FisherFB0875712
Gene Pulser IIBioRadElektroporatie
Electroporation Cuvettes – 2 mmBioExpressE-5010-2
CentriVap DNA Vacuum ConcentratorLabconco7970010DNA drogen
CEQ 2000XL DNA Analysis SystemBeckman CoulterDNA-sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0Life Technologies12605099DNA-sequentieanalyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
  2. Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
  3. Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
  4. Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
  5. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  6. Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
  7. Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
  8. Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
  9. Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
  10. Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
  11. Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
  12. Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
  13. Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
  14. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
  15. Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
  16. Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
  17. Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
  18. Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Generatie van auxotrofenelektroporatietechniekreplica platingkanamycineresistentiezuivering van genomisch DNASanger sequencingBLAST analyseR6K replicatieoorsprong

Gerelateerde artikelen